1. 증식유발인자에 의한 혈관 평활근세포의 증식효과
대조군의 [3H ]t hy m idin e in corpor at ion 측정치는 4,809.4±1,763.0 cpm 이었으며 증식후의 측정치는 PDGF 10 n g/ ml 사용군은 17,237.6±7,600.8 cpm , en dothelin - 1 10nM 사용군은 7903.6±2,371.4 cpm , an giot en sin - II 100 n M 사용군은 9,330.2±
3,170.0 cpm 이었다. 유발인자의 증식효과는 P D GF 사용군은 대조군의 3.58배 (±
0.72), en doth elin - 1 사용군은 1.69배 (±0.25 ), an giot en sin - II 사용군은 2.01배(±
0.47 )로 통계학적으로 유의한 증식유발효과를 보였다(p < 0.05 ). P DGF 사용군에서의 증식효과는 en dothelin - 1 사용군과 angioten sin - II 사용군과 비하여 통계학적으로 유의한 차이를 보여 PDGF 10 n g/ m l에서의 증식유발효과가 가장 강력하였다(그림 2).
그림 2. PDGF , endoth elin - 1 및 angioten sin - II 이 혈관 평활근세포 증식에 미치는 영향.
* p < 0.05 v s . con tr ol
** p < 0.05 v s . cont r ol an d en doth elin - 1/ an giot en sin - II gr oup
2. Cy closporin e의 증식억제효과
임상에서 사용 가능한 cy closporin e 100 nM 의 농도하에서의 [3H ]t hy m idin e in corp or at ion 측정치는 PDGF 사용군은 11,049.0±3,311.9 cpm (67.4±10.2% ), en doth elin - 1 사용군은 5,512.2±1,729.0 cpm (71.6±16.9% ), an g iot en sin - II 사용군 은 7,085.2±1,633.0 cpm (78.7±11.2% )으로 증식을 유도한 cyt okine의 종류에 따라 서 cy closporin e의 증식억제효과에 차이가 있었다. 즉 PDGF 를 증식유발인자로 사 용한 경우에는 평균 67.4%의 증식이 이루어져 통계학적으로 유의한 증식억제효과 를 보인 반면(그림 3. p < 0.05), endothelin - 1과 angiot en sion - II를 증식유발인자로 사용한 경우에는 통계학적으로 유의한 증식억제효과를 발견할 수가 없었다(그림 3. p > 0.05).
그림 3. Cy closporine이 PDGF , endothelin - 1 및 an giot en sin - II 로 유도된 혈관 평활근세포 증식에 미치는 영향.
* p - v alu e calcu lat ed by M an n - W hit n ey U - t est
** in dicat e t h e cont r ol lev el CsA : cy closporin e A
3. Carv edilol의 증식억제효과 - carv edilol 단독투여군
P D GF 사용군에서 carv edilol 투여군의 [3H ]th y m idin e in corp or at ion 측정치는 1 μM 농도에서는 9,807.8±2,649.6 cpm , 10 μM 농도에서는 3,032.4±1,155.0 cpm 으로 carv edilol의 농도가 증가할수록 증식억제효과가 뚜렷하였다. 즉 1 μM 의 carv edilol 투여군에서는 증식유발인자 단독투여군에 비하여 60.3±10.4%의 증식 이, 10 μM 의 carv edilol 투여군에서는 18.3±5.9%의 증식만이 관찰되어 각군마다 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(p< 0.05)(그림 4).
이러한 carv edilol의 PDGF 로 유도된 혈관 평활근세포의 증식억제효과는 다른 증식유발인자 사용군에서도 동일한 결과를 얻어 en dothelin - 1과 an giot en sin - II 사 용군에서 1 μM 의 carv edilol 투여군의 상대적인 증식정도은 각각 54.8±15.3%
와 68.7±16.6%이었으며, 10 μM 의 carv edilol 투여군의 상대적 증식률은 각각 11.6±3.2%와 15.3±4.2%로 증식유발인자 단독투여군은 물론 1 μM 의 carv edilol 투여군과도 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(p< 0.05)(그림 4 ). 아울러 en doth elin - 1과 an g iot en sin - II 사용군의 carv edilol의 농도에 따른 상대적인 증식정 도는 PDGF 사용군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이가 없어 carv edilol은 증 식유발인자의 종류에 관계없이 일정한 증식억제효과를 가짐을 알 수 있었다.
본 연구결과에 의하면 carv edilol의 IC5 0(In hib it ory con cent r at ion 50% )은 1 μ M 과 10 μM 사이임을 추정할 수 있었다.
4. Carv edilol과 cy closp orin e 병합투여의 증식억제효과
P D GF 사용군에서 cy closporin e과 carv edilol 1μM 을 병합투여한 경우, [3H ]th y m idin e in corporation 측정치는 9,807.8±2,649.6 cpm (51.7±6.4% )으로 증식 유발인자 단독투여군에 비하여 통계학적으로 유의한 증식억제효과를 보였으며, cy closporin e과 carv edilol 10μM 을 병합투여한 경우에도 3,025.6±1,347.4 cpm (17.8±5.9% )의 증식을 보여 증식유발인자 단독투여군은 물론 cy closporine과 carv edilol 1 μM 의 병합투여군과 비교하여 통계학적으로 유의한 증식억제효과를 보였다(p < 0.05)(그림 5). 그러나 cy closporin e과 carv edilol 병합투여군의 증식정도 를 같은 농도의 carv edilol 단독투여군의 증식정도와 비교하면 통계학적으로 유의 한 차이를 발견할 수가 없었다(p> 0.05)(그림 5). 즉 carv edilol의 증식억제효과는 cy closporin e의 유무에 관계없이 carv edilol의 농도에 따라서 결정됨을 알 수 있었
그림 4. P DGF , endoth elin - 1 및 an giot en sin - II로 유도된 혈관 평활근세포에 대한 carv edilol의 증식억제효과.
* p - v alu e calcu lat ed by Kru scal- W allis t est
** pr olifer at ion percent ag e (% ) = (cpm in stim ulat or +dru g tr eat ed sam ple / cpm in stim ulat or tr eat ed sam ple ) x 100
다.
이러한 PDGF 사용군에서의 cy closporin e과 carv edilol의 병합투여의 증식억제 효과는 다른 증식유발인자인 endothelin - 1 과 an giot en sin - II 사용군에서도 같은 결과를 얻어, cy closporine과 carv edilol의 병합투여군의 증식억제효과는 carv edilol
의 단독투여군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이를 발견할 수 없었다
(p > 0.05 )(그림 6,7 ). 결론적으로 임상적으로 사용이 가능한 농도의 cy closporin e은 carv edilol의 혈관 평활근세포 증식억제효과에 어떠한 영향도 미치지 않았다.
그림 5. Carv edilol 단독 혹은 cy closporine 과의 병합투여가 PDGF 로 유도된 혈관 평활근세포의 증식에 미치는 영향.
* m ean s p < 0.05, v s . stim ulat ed cont r ol
** m ean s p < 0.05, v s . stim ulat ed cont r ol an d carv edilol 1 μM g roup CsA : Cy closporin e A
그림 6. Carv edilol 단독 혹은 cy closporine 과의 병합투여가 endothelin - 1 으 로 유도된 혈관 평활근세포의 증식에 미치는 영향.
* m ean s p < 0.05, v s . stim ulat ed cont r ol
** m ean s p < 0.05, v s . st im u lat ed cont r ol an d carv edilol 1 μM gr oup CsA : Cy closporin e A
5. 세포융해검사(cy t oly sis a s say )결과
P DGF 로 증식유도된 실험군의 LDH 분비정도는 10.9±1.5%로 약제투여군들의 LDH 분비와 비교하여 통계학적으로 유의한 차이를 발견할 수 없었다 (그림 8 ). 즉 cy closporin e 100 nM 단독투여군에서의 LDH 분비는 9.3±6.6% , carv edilol 10 μ M 투여군은 11.3±7.4% , cy closporin e 100 n M 과 carv edilol 10 μM 병합투여군은 9.3±4.3%로 P DGF 단독투여군과 비교하여 통계학적으로 유의한 차이를 발견할 수 없었다. 이는 cy closporin e 이나 carv edilol에 의한 세포융해가 없었음을 의미한 다. 이러한 세포융해검사는 증식유발인자로 endoth elin - 1이나 angioten sin - II를 사 용한 경우에도 같은 결과를 얻을 수 있었다(자료 제시하지 않음).
그림 7. Carv edilol 단독 혹은 cy closporin e 과의 병합투여가 an giot en sion - II 로 유도된 혈관 평활근세포의 증식에 미치는 영향.
* m ean s p =0.047, v s . st im u lat ed con tr ol
** m ean s p < 0.05, v s . stim ulat ed cont r ol an d carv edilol 1 μM g roup CsA : Cy closp orin e A
그림 8. P DGF 로 증식유도된 대동맥 혈관 평활근 세포에서 약제에 의한 세포융해정도.
* LDH r elea se (% )
= 배양액내의 LDH 농도 x 100 / 전체 LDH 농도 CsA : cy closporin e A
IV . 고 찰
나타날 수 있는 수준으로 임상적으로는 적용하기에는 어려움이 있는 것으로 보고
그러나 이러한 carv edilol의 혈관 평활근세포에 대한 증식억제효과에도 불구하 고 carv edilol의 만성거부반응이나 풍선 확장술후 혈관 재협착을 억제할 지에 대하 여서는 논란의 여지는 있다. 이미 널리 알려진 대로 만성적으로 발생하는 혈관경 화증은 혈관 평활근세포의 증식은 물론 혈관 평활근세포의 내막층으로의 이동현 상에 기인하는 것으로 보고되고 있으나3 - 5 현재까지의 in v itr o 실험중 carv edilol의 이동억제효과에 대한 보고는 증식억제효과에 대한 보고에 비하여 매우 제한적이 다.1 9 더구나 carv edilol이 억제하는 것으로 알려진 M AP kin ase가 세포증식에 관
여하는 기간과 세포이동에 관여하는 기간에는 차이가 있다는 최근보고2 7와
carv edilol의 증식억제를 위한 IC5 0와 이동억제를 위한 IC5 0간의 차이를 보인다는 보고1 9를 감안하면 혈관 평활근세포의 증식과정과 이동과정간에는 분명히 차이가 있을 것으로 추정할 수가 있다. 따라서 carv edilol의 혈관 평활근세포 이동억제효 과에 대한 in vitr o 내지는 in viv o 실험은 물론 혈관 평활근세포의 증식이나 이동 의 기전에 관한 연구가 향후 진행되어야 할 것으로 사료된다.
V . 결 론
Carv edilol의 단독투여 또는 면역억제제인 cy closp orin e과의 병합투여가 각종 혈관 평활근세포의 증식유발인자의 존재하에서 혈관 평활근세포의 in v itr o 증식에 미치는 영향을 관찰한 결과, carv edilol은 증식유발인자로 유도되는 백서 혈관
평활근세포의 증식을 용량 비례적으로 억제하며 이러한 증식억제효과는
cy closporin e의 병합투여와는 관계없이 일정하였다. 본 연구에서 확인된 carv edilol 의 혈관 평활근세포 증식억제효과는 고혈압을 동반하는 이식환자에서 만성거부반 응의 예방책으로 carv edilol의 사용 가능성을 시사하여 주고 있다.
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