III. 결과
2. 항균펩타이드 생물학적 활성
(1) 항균펩타이드 최소억제농도(MIC)
Table 2에서 보여준 것과 같이, 항균펩타이드 CBS73은 테스트균주로 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Vancomycin-resistant S.aureus (VRSA), 그리고 Vancomycin-resistant enterococci (VRE), IMP (Imipenem resistance Pseudomonas aureus), ESBL (Extended spectrum beta lactamase Escherichia coli), Alcaligenes faeclis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sabtilis, Micrococcus luteus, Mycobacterium smegmatis, Enterococcus faecalis을 사용한 결과 폭 넓은 항균활성을 확인하였다. 그람 양성인 VRE, VRSA, 그람 음성인 Escherichia coli, Salmonella에서 Vancomycin과 Bacitracin보다 더 강한 항균활성을 보여주었다.
그람 양성균 VRSA에서 Vancomycin과 Bacitracin의 최소억제농도는 80㎍/㎖이상의 농도를 나타내었고, 항균펩타이드 CBS73은 20㎍/㎖의 최소억제농도를 확인하였다. 그람 음성균으로 Salmonella 에서 Vancomycin과 Bacitracin의 최소억제농도는 80㎍/㎖이상의 농도를 나타내었지만, 항균펩타이드 CBS73은 10㎍/㎖의 최소억제농도를 확인하였다.
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Table 2. Minimum inhibitory concentration of Bacillus sp. CBS73 peptide
Test organisms MIC(μg/ml)
CBS73 Bacitracin Vancomycin
Alcaligenes faecalis ATCC 1004 G(-) 80 >80 >80
Salmonella typhimurium KCTC 1925 G(-) 10 >80 >80
Escherichia coli KCTC 1923 G(-) 80 >80 >80
ESBL B1* G(-) 80 >80 .>80
ESBL P3* G(-) 80 >80 >80
ESBL S1* G(-) 80 >80 >80
ESBL U4* G(-) 80 >80 >80
ESBL W1* G(-) 80 >80 >80
Pseudomonas aeruginosa KCTC 1637 G(-) 80 >80 >80
IMP 120** G(-) 80 >80 >80
IMP 123** G(-) >80 >80 >80
IMP129** G(-) 80 >80 >80
Bacillus subtilis ATCC 6633 G(+) 80 >80 >80
Micrococcus luteus ATCC 9341 G(+) 80 1.25 1.25
Mycobacterium smegmatis ATCC 9341 G(+) 0.15 0.15 0.15
Enterococcus faecalis ATCC 29212 G(+) >80 20 1.25
VRE 4*** G(+) 20 20 >80
VRE 6*** G(+) >80 >80 >80
VRE 82*** G(+) 40 5 >80
VRE89*** G(+) 40 >80 >80
VRE98* G(+) >80 80 >80
VRSA**** G(+) 20 >80 >80
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Test organisms MIC (μg/ml)
CBS73 Bacitracin Vancomycin
Staphylococcus aureus KCTC 1928 G(+) 80 10 1.25
MRSA693E***** G(+) >80 10 1.25
MRSA 4-5***** G(+) 80 2.5 1.25
MRSA 5-3***** G(+) 80 2.5 1.25
MRSA S3***** G(+) 80 40 1.25
MRSA U4***** G(+) 80 80 0.625
MRSA S1***** G(+) 80 40 1.25
MRSA B15***** G(+) 80 40 1.25
*ESBL, Extended spectrum beta lactamase Escherichia coli; **IMP, Imipenem resistant Pseudomonase aureus; ***VRE, Vancomycin resistant Enterococcus faecium; ****VRSA, Vancomycin resistant Staphylococcus aureus; *****MRSA, Methicillin resistant Staphylococcus aureus.
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(2)항균펩타이드 온도, pH, 단백질분해효소, 유기용매의 안정성
항균펩타이드 CBS73의 온도, pH의 영향에 대한 안정성은 Table 3에 나타내었다.
CBS73의 온도 안정성은 다양한 온도에서 잔존활성을 측정하였다. 20-100℃의 온 도에서는 안정하였지만 그 이상의 온도에서는 잔존활성이 줄어드는 것을 확인하 였다. 항균펩타이드 CBS73의 pH 안정성은 다양한 범위의 pH버퍼 (pH 2.0 - 10.0) 에서 측정하였더니, pH 4.0 – 10.0 에서 안정함을 확인하였지만, pH 2.0 에서 잔 존활성 없음을 확인하였다.
CBS73에 대해 다양한 화학물질에 대한 안정성을 Table 4에 나타내었다. TCA (Trichloroacetic acid), Triton X-100을 제외하고 나머지 화학물질에는 반응 하 지 않음을 확인 할 수 있었다.
단백질분해효소에 대한 안정성은 Table 5에 나타내었다. CBS73와 Lipase, Proteinase K, α-chymotrypsin, Trypsin, Protease, Papain, Pepsin 반응 후, Mycobacterium smegmatis를 디스크확산 법을 이용하여 측정하였다. 항균펩타이드 CBS73은 모든 단백질분해효소에 안정함을 확인하였다.
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Table 3. Effect of different temperature and pH on inhibitory activity of peptide
Treatment Residual activities (%) Temperature (Time)
None 100
20 ℃, 30 min 100
40 ℃, 30 min 100
60 ℃, 30 min 104.1
80 ℃, 30 min 84.8
100 ℃, 30 min 81.3
121 ℃, 15 min 0
pH
2 0
4 103.7±5.77
6 98.2±5.77
8 96.4±17.32
10 100
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Table 4. Effect of various chemicals on antimicrobial activity
Treatment Concentration Residual activity(%) None
Acetone Chloroform
Ethanol Methanol Ethyl acetate
EDTA
Trichloroacetic acid Triton X-100
Tween 20 Tween 80
10 % (v/v) 10 % (v/v) 10 % (v/v) 10 % (v/v) 10 % (v/v)
10 mM/ml 100 mg/ml 1 % (v/v) 10 % (v/v) 10 % (v/v)
100 102.2±5.77
100 102.4±5.77
105.0 134.5 107.3±5.77
0 0 90.0 85.7
* Antimicrobial peptide was pre-incubated for 1h at room temperature with chemicals and then assayed for antimicrobial activity. Antimicrobial peptide activity measured in the absence of any chemicals was considered as none (100 %).
* After treatment with TCA samples were centrifuged 8,000rpm for 5min and the supernatant was neutralized to pH 7.0 before testing for antimicrobial activity.
- 29 - Table 5. Effect of various proteolytic enzymes
Proteolytic enzymes Residual activity(%)
None 100
Lipase 102.0±5.8
Proteinase K 105.8±5.8
Protease 102.0±5.8
α-chymotrypsin 98.2
Trypsin 96.4±5.8
Pepsin 98.1±5.8
Papain 102.0±11.0
* Peptide was treated with 1mg/ml of each enzyme and incubated at room temperature for 1h and then boiled for 2min at 100℃ for enzyme inactivation. Peptide solution without any proteolytic enzymes treatment was taken as none (100%).
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b. 항산화력 측정
(1) DPPH 라디컬 소거능
DPPH는 항산화 물질과 반응하게 되면 본래 보라색의 안정한 free radical인 DPPH가 무색으로 변하게 되는데 항산화 활성을 비교적 신속하고 간단하게 측정할 수 있는 방 법 중 하나이다. 517㎚에서 DPPH 라디컬의 흡광도 변화를 측정함으로써 라디컬 소거 효과를 조사 하였다. CBS73 및 Ascorbic acid의 DPPH 라디컬 소거능은 농도의존적으 로 저해됨을 확인하였다. 모든 실험은 3번을 수행하였고, 평균값을 측정하였다.
CBS73의 DPPH소거능를 이용하여 항산화 활성을 측정한 결과는 Figure 9에 나타내었 다. 500㎍/㎖의 농도에서 CBS73은 9.7±1.35의 억제율을 나타내었다. Ascorbic acid 는 DPPH방법에 의한 항산화 활성 측정을 위한 대조군으로 사용하였다. Ascorbic acid 의 농도는 1-500㎍/㎖까지 변화를 측정하였고, 농도가 500㎍/㎖일 때, 88.26±0.26의 억제율을 나타내었다. Ascorbic acid의 농도변화에 따라 억제 백분율이 상승됨이 관 찰되었다.
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1 3 7 15 31 62 125 250 500
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
D P P H S cav en g in g act iv it y( % )
Concentration(ug/ml)
Ascorbic acid CBS73
Figure 9. DPPH radical scavenging activity of CBS73 antimicrobial peptide in different concentration.
- 32 - (2) 환원력 측정
환원력은 700nm에서 ferric-ferricyanide (Fe3+)혼합물이 수소를 공여하여 유리 라디 컬을 안정화시켜 ferrous (Fe2+)로 전환하는 환원력을 흡광도 값으로 측정하는 방법이 다. 환원력을 측정하기 위해 대조구로써 Ascorbic acid를 사용하였으며, 항균펩타이 드 CBS73의 환원력은 Figure 10에 나타내었다. 모든 실험은 3번을 수행하였고, 평균 값을 측정하였다.
보통 환원력은 항산화 활성과 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다[28]. CBS73의 농도 가 500㎍/㎖일 때 흡광도 값이 0.566±0.03을 나타내었고, Ascorbic acid의 농도가 500㎍/㎖일 때 1.384±0.026의 흡광도 값을 나타내면서 약 3배 차이를 확인하였다.
높은 수준의 항산화 활성은 아니지만 미비한 수준의 활성이 있다고 생각된다.
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1 3 7 15 30 60 125 250 500
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
R e duc ing pow e r( 7 0 0 nm )
Concentration(ug/ml)
Ascorbic acid CBS73
Figure 10. Reducing power of CBS73 antimicrobial peptide
The absorbance (700nm) was plotted against concentration of sample. All values are mean ± SD of triplicates.
- 34 - (3) 총 페놀 함량 측정
총 페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu reagent가 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴이 청색으로 발색하는 원리로 측정하였다. 총 페놀 함량을 조사하기 위해 대조군으로 Gallic acid을 사용하였고, Folin-Ciocalteu 비색법에 따라 최대 파장인 700㎚에서 측정하였다. 모든 실험은 3번을 수행하였고, 평균값을 측정하였다.
항균펩타이드 CBS73의 총 페놀 함량은 Figure 11에 나타내었다. CBS73의 농도가 500㎍/㎖일 때 0.339±0.03의 흡광도 값을 보였고, Gallic acid의 농도가 500㎍/㎖일 때 2.712±0.06의 흡광도를 확인하였다. Gallic acid는 농도의존적으로 흡광도 값이 상승됨을 관찰하였지만, 항균펩타이드 CBS73은 미비한 수준을 보여주었다.
CBS73은 페놀의 구조를 포함하는 물질이 거의 없다는 것으로 생각된다.
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1 3 7 15 31 62 125 250 500
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Tot a l phe nol c ont e nt s (7 0 0 nm )
Concentration(ug/ml)
Galic acid CBS73
Figure 11. Total phenol contents of CBS73 antimicrobial peptide
Total phenolic content was measured using the Yen and Hsieh method. Absorbance values represent triplicates of different samples analysed.
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d. 항염증 시험 평가
(1) 세포 생존율 및 일산화질소 생성 억제능 측정
Raw 264.7 세포를 24 시간동안 배양 후, 항균펩타이드 CBS73 을 다양한 농도로 처리한 후 흡광도 540 ㎚에서 세포 생존율을 측정하였다. 항균펩타이드 CBS73 을 처리하지 않은 세포의 생존율은 100%로 하였다. Figure 12(a)에서 나타낸 바와 같이, CBS73 은 1-50 ㎍/㎖의 범위에서 세포독성을 나타내지 않았지만, 50 ㎍/㎖이상의 농도에서 세포독성을 나타내어 세포생존율이 감소함을 확인하였다.
대식세포는 LPS와 같은 자극에 따라 일산화질소를 생산한다. LPS에 의해 유도된 일 산화질소 생성의 CBS73에 농도에 따른 억제능 효과를 측정하기 위해 그리스시약을 이 용하여 일산화질소의 농도를 측정하였다. Figure 13(b)에 나타낸 바와 같이, LPS 처 리된 세포의 NO 생성량은 처리되지 않은 세포와 비교하여 일산화질소 생성이 증가함 을 확인하였다. LPS와 1-100 ㎍/㎖ CBS73를 함께 처리한 세포의 일산화질소 생성 억 제능을 비교하였을 때 본 펩타이드는 일산화질소의 생성을 억제하는 효과가 없음을 확인하였다.
- 37 - (a) (b)
NA 1 3 6 12 25 50 100
0 20 40 60 80 100 120
Cell viabillity(%)
Concentration(ug/ml)
NA LPS 1 3 6 12 25 50 100
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Nitrate(uM)
Concentration(ug/ml)
Figure 12. Effect of the CBS73 antimicrobial peptide on cell viability and NO production.
(a) Cell viability was measured after 24 h incubation. Survival rates were tested
with MTT assay in Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were incubated in the presence
or absence of 1-100μg/ml peptide for 24 h. (b) Cells were incubated with the
various concentration of peptide for 30 min, followed by treatment with 1μg/ml of
LPS and incubated for 24 h. The amounts of NO were determined using the Griess
reagent in the culture medium. Each bar shows the mean ± S.D of three independent
experiments performed in triplicate.
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