불소함유 접착필름은 점막 점착성(mucoadhesion)의 개념으로 제작된 제제이다. 많 은 의학분야에서 약물이 목표 장기에 도달하여 확산되는 속도를 조절하는 제어, 방 출 기술들에 대한 연구들이 이루어지고 있다[22,23]. 약물의 체류시간을 증가시키기 위해 여러 가지 형태의 점막 점착성 제제들이 개발되었고 비슷한 개념으로 치아에 접착되어 불소가 방출되는 속도를 조절하는 것을 목적으로 불소함유 접착필름이 고안되었다.
Sun L은[24] 원자나 분자 단위의 극미세 물질을 인위적으로 조작함으로써 새로운 성질과 기능을 가진 물질이나 장치를 만드는 기술인 나노(nano) 테크놀로지를 이 용하여 불소를 적용한 효과를 보고하였다. 나노 타입의 불소가 마크로(macro) 타입 의 불소보다 더 많은 반응을 보이는 이유는 용해도(solubility)가 더 뛰어나기 때문 이라고 하였다. 불소함유 접착필름도 sodium fluoride (NaF)를 나노섬유를 분사하 는 과정을 통해 첨가하였다. 이를 통해 매개체로서의 효율을 증진시킬 뿐 아니라 박막의 점성, 탄성도, 강도, 접착력, 표면장력 등을 필요에 따라 조절해 주고자 하 였다. 이러한 불소함유 접착필름의 성분 변화가 용이하다는 장점을 이용하여 풀루 란을 첨가한 불소함유 접착필름을 고안하였고 이 두 필름들의 세균에 대한 효능과 생체안정성 검사를 시행하게 되었다.
불소함유 접착필름의 Agar dilusion test는 구강 내 세균들 중 치아 우식의 주 원 인균으로 여겨지는 mutans streptoccoci를 대상으로 시행하였다[25-27]. 20ppm이하 의 불소농도로는 산형성 세균의 항균 효과가 거의 없다는 보고도 있었지만 이는
Lactobacillus
가 포함된 연구였다[28,29]. 본 연구에서는 NaF-PVA tape 군에서 명 확한 항균 효과를 보여주었다. 본 연구에서와 같이 Jang은[30]S. mutans
실험에서 불소유리의 시간에 따른 생장 저해 구역의 길이가 48, 72시간에 24시간 후보다 유의하게 큰 것을 보고하였다. Pullulan + NaF-PVA tape의 경우 72시간동안 S.
mutans에 항균효과를 보여주지 못하였지만 NaF-PVA tape은 48시간에 대조군과 비교하여 유의한 항균효과를 보여주었다.
불소함유 접착테잎이 Biofilm의 표면과 S.mutans의 군집형성 그리고 대사과정에 미치는 영향을 확인하기 위해 field emission scanning electron microscope (FE-SEM) 및 Confocal laser scanning microscopy (CLSM)를 촬영하였다.
Scanning electron microscope (SEM)는 10,000배 이상에서는 선명하게 관찰되지 않으며 시편이 오염되는 문제점이 있어 FE-SEM을 사용하였다[31,32]
FE-SEM과 CLSM 이미지 모두 불소함유 접착필름들에서
S.mutans
에 대한 유의 한 항균 효과를 보여주었으며 NaF-PVA tape군에서 pullulan +NaF-PVA군보다 더 좋은 항균 능력을 보여주었다. CLSM 이미지로S. mutans
와 extracellular polymeric substances (EPS)의 bio-volume을 측정하였다. EPS는 주로 polysaccharide와 단백질 그리고 extracellular DNA (eDNA)로 구성되어있는 biofilm을 감싸는 biofilm의 기본구성요소로서 EPS에 내장된 세포는 다른 세포들과 비교하여 항균에 저항력이 높아 불소함유 접착필름의 항균효과에 대한 확실한 증 거가 되었다[33-35].불소함유 접착필름의 항균능력을 평가할 수 있는 3가지의 실험(agar diffusion test, FE-SEM, CLSM)에서 모두 동일한 결과가 도출되었다. 전통적인 불소함유 접 착필름이 풀루란을 첨가한 이중 접착필름보다 유의하게 높은 항균 효과를 보여주 었다.
풀루란을 첨가한 불소필름의 항균력 저하는 첫째로 풀루란을 첨가한 불소함입 접 착필름의 형태적 문제로 인해 발생할 수 있다. 접착력을 증진시켜 불소방출량이 증 진되는 것을 기대하였으나 오히려 풀루란 표면이 불소의 세균과의 접촉을 방해할 수 있으며 풀루란을 제외할 경우 기존의 불소함유 접착필름의 절반의 두께는 불소 방출량에 있어서 차이가 있을 수 있다. 두 번째 이유는 풀루란 자체의 성분이 항균
효과를 저해시킬 수 있다. 따라서 풀루란의 두께를 달리하여 항균효과를 측정하고 풀루란으로만 제작한 필름을 실험해보는 과정을 통해 이를 확인해야 할 것이다.
불소함유 접착필름의 생체안정성을 검증하기 위해 human gingival fibroblast (HGF)와 periodontal ligament (PDL) 세포들을 이용하여 MTT assay를 시행하였 다. 불소함유 접착필름은 상악 및 하악 악궁 단위로 치아에 적용하기 때문에 치질 뿐 아니라 치은에 접촉하며 치주인대에도 접촉할 가능성이 있어 HGF와 PDL 세포 들이 선택되었다[7].
모든 불소함유 접착필름은 대조군에 비해 HGF와 PDL 세포 모두에서 유의하게 낮은 세포 생존능력을 보여주었다. 특히 Pullulan + NaF-PVA tape군은 전통적인 NaF-PVA tape군에 비해 절반 이하의 세포 생존능력을 보여주었다. 흥미롭게도 Pullulan + NaF-PVA tape군의 낮은 항균능력 결과로 인해 불소가 세포에 미치는 영향력이 떨어질 것으로 추정되었음에도 불구하고 풀루란을 첨가한 불소필름이 더 높은 세포 독성을 보여주었다.
풀루란은 α-(1->6) 연결의 규칙적인 독특한 연결 패턴으로 구조적 유연성을 갖기 때문에 다른 다당류에서는 나타나지 않는 뚜렷한 필름 및 섬유 형성 특성을 나타 내어 약물 전달, 유전자 전달, 혈장 확장기, 조직 공학, 상처 치유 및 구강 관리 제 품에 널리 사용되고 있다[13,36]. 약물의 전달 응용을 위해 가교된 풀루란 나노 입 자를 이용한 연구는 풀루란 나노 입자가 세포에 무독성이며 세포에 명확한 해를 끼치지 않는다고 보고하였으며 풀루란 자체의 비면역원성(non-immunogenic), 무독 성 그리고 돌연변이가 없는(non-mutagenic) 특성 때문에 풀루란은 표적화 약물에 사용 될 수 있다고 하였다[37,38]. 이 표적 효과로 인하여 항암제의 정상 세포에 대 한 독성까지도 감소시킬 수 있다고 밝혀졌다[39,40].
더하여 풀루란은 유익한 박테리아의 성장을 촉진하는 프리바이오틱(prebiotic)의 역할을 하며[13] 치아에 직접적으로 실험을 시행한 치수재생술에서 scaffold 역할로 풀루란을 첨가한 연구에서도 human dental pulp stem cells (hDPSC)을 사용한 세
포 배양에서 세포 부착, 증식, 확산 모두에서 scaffold로서 긍정적인 효과를 보여주 었다[41].
풀루란 자체의 성분과 특성만을 보았을 때, 풀루란 층(layer)이 세포에 독성을 일 으켰다고 추정하기는 어렵다. 불소함유 접착필름과 풀루란 각각의 분석으로는 낮은 세포 생존능력을 확인하기 어려울 것으로 생각되며 이에 영향을 미치는 원인을 알 기 위해 풀루란과 불소함유 접착필름간의 상호작용에 대한 연구가 더 필요할 것으 로 생각된다.
MTT assay는 간편하면서 비교적 정확하게 세포 증식 및 사멸도 변화를 평가할 수 있으며 대량을 동시에 측정할 수 있다는 장점이 있다[42]. 하지만 비수용성인 formazan 용해를 위해 유기용매를 사용하여 녹이는 과정이 필요하다. 또한 media 를 제거하는 과정에서 세포가 손실될 위험이 있으며 한 세포의 생리적 상태나 세 포의 종에 따라서 활성 차이가 나타날 수 있다[43]. MTT asssay의 가장 큰 문제 점은 세포의 생존력에 대한 평가에서 세포의 생존과 괴사라는 이분법적인 판단만 이 가능하다는 점이다. 이러한 단점을 보완하고자 유전자 분석을 수행하였고 유전 자 분석을 통하여 세포의 괴사에 영향을 미치는 원인들과 불소함유 접착필름에 접 촉한 세포들의 상태를 다각화하여 관찰하고자 하였다.
불소함유 접착필름에 적용된 human gingival fibroblast (HGF)와 periodontal ligament (PDL) 세포들을 RNA sequencing을 수행하여 DEGs를 찾아 분석하였다.
모든 유전자 분석은 일반적으로 행하여지는 이전의 유전자 실험들과 마찬가지로 fold 값을 2로 normalized data log값을 4이상으로 p값은 0.05 이하를 기준으로 하 였다[20,44].
RNA sequencing은 수 만개의 유전자를 포함하기 때문에 유전자를 하나씩 분석하 기보다 기능별로 그룹을 지어 분석을 하는 것이 용이하다. 이를 위해 많은 연구자 들이 gene ontology (GO)를 활용한다[45,46]. GO는 모든 종에 걸쳐 유전자 속성의 표현을 통합하기 위한 주요 생물 정보학 이니셔티브를 말한다. GO는 비슷한 기능
의 유전자들을 묶어 놓은 그룹이라고 생각할 수 있다.
Gene caterogy chart를 통하여 어떤 종류의 GO의 유전자들이 상대적으로 많은 발현 변화가 있었는지 확인할 수 있었다(Fig 6.). 여러 가지 GO들 중에서 세포의 기능이 쇠퇴하거나 사멸하는 것과 연관이 있는 GO는 여러 종류가 있을 수 있다.
Aging, Apoptotic process, Cell death, Cell migration, DNA repair, Immune response, Neurogenesis, Secretion GO의 유전자 발현 변화가 HGF, PDL 세포에서 NaF-PVA tape군과 pullulan + NaF-PVA tape군 모두에서 관찰되었다. GO들 중 에서 세포 독성과 가장 직관적으로 연관성이 높게 여겨지는 cell death GO의 유전 자들 중 유의하게 발현이 변화한 유전자들을 분석하였다.
Pullulan + NaF-PVA tape은 HGF 세포에서 GADD45A, GADD45B 그리고 PPP1R15A의 발현이 증가되었다. GADD45 A와 B는 DNA repair 그리고 세포의 정지(arrest)와 자멸사(apoptosis)에 관여한다. PPP1R15A 또한 GADD 그룹으로 세 포자멸사에 관여하는 성장 억제 및 DNA 손상 유도 단밸질로 알려져있다[47,48].
NaF-PVA tape군은 HGF 세포에서 발현이 유의하게 증가된 유전자는 MLKL, NSG1 이었고, 감소된 유전자는 DFFB, CASP9, CASP8, MYD88였다. MLKL 유전 자는 세포사멸과정인 tumor necrosis factor (TNF) 유발 괴사 (induced necroptosis)에서 중요한 역할을 한다[49]. NSG1 또한 DNA 손상에 대한 반응으로 세포 사멸을 유도한다[50]. 이러한 세포들의 발현이 증가하여 cell death에 관여하 였으나 세포 사멸동안 염색질 응축을 유발하는 DFFB 유전자와 역시나 세포사멸에 관여하는 caspase family인 CASP8,9 그리고 MYD88 같은 유전자들의 발현은 감소 되었다[51-54]. 이러한 결과는 풀루란이 포함된 불소함유 접착필름과의 차이를 보 여주었다.
PDL 세포에서는 HGF에서보다 cell death GO 유전자의 발현의 변화가 훨씬 많았 다. Pullulan + NaF-PVA tape에서 발현이 유의하게 변화된 유전자의 수는 61개였 다. NaF-PVA tape에서는 48개로 Pullulan + NaF-PVA tape보다 더 작은 변화된
유전자의 수를 보여주었다.
이렇게 다양한 유전자들에서 발현의 변화가 관찰된 분석 결과에서 유전자의 숫자 만으로 세포 독성에 대해서 명확히 결론지을 수는 없다. 하지만 풀루란을 포함한 불소함유 접착필름에서 기존의 NaF-PVA tape보다 cell death GO와 연관된 많은 유전자의 변이가 일어났으며 이것이 세포의 생존력에 영향을 주는 원인임을 유추 할 수 있다. 이것은 MTT assay에서도 증명되었다(fig. 5).
벤다이어그램을 이용한 각 세포들의 3개의 그룹(control, NaF-PVA, pullulan + NaF-PVA)의 DEGs를 비교한 결과 PDL세포들에서만 대조군과 비교한 불소함유 접착필름들간의 발현이 서로 반대되는 유전자들이 존재하였다(n=33). 이를 통해 불 소함유 접착필름의 종류에 따라 HGF 세포들보다 PDL 세포들에서 더 다양한 변이 가 발생할 수 있다고 해석할 수 있다.
DEGs 분석에서 모든 유전자들의 발현의 증가와 감소의 의미를 찾는 것은 많은 노력을 필요로 하고 뚜렷한 목적(target) 유전자가 있지 않는 이상 그 자체가 오히 려 전체 분석에서 오류가 발생할 수 있는 가능성이 있다. 따라서 유전자들의 key pathway를 찾아서 분석하는 것이 더 효율적이다[20,55].
Gene set enrichment analysis (GSEA)는 Microarray 또는 RNA-seq. 자료를 이 용하여 대조군, 실험군에서 유의한 유전자 세트를 분석하는 프로그램이다. GSEA는 인간과 쥐의 유전자만 분석 가능하며 molecular signature database (MsigDB)에 있는 유전자 세트를 기반으로 분석한다[56]. Key pathway를 찾는 여러 가지 방법 들 중에서 본 연구에서는 Hallmark pathway 방법을 이용하였다[20].
Pullulan + NaF-PVA tape은 HGF 세포의 GSEA에서 key pathway로 TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB를 보여주었다. Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB)는 염증반응과 면역체계 를 조절하고 세포괴사, 세포증식, 상피세포의 분화 등에 관여하는 단백질군(protein familly)이다[57]. Tumor necrosis factor (TNF)-α는 몸에 지속적인 염증을 유도하
며 류마티스 관절염과 같은 여러 가지 염증성 질환들과 연관되어 있다[58]. 이와 같은 내용으로 치은쪽에 플루란을 첨가한 불소필름이 접촉했을 때 두드러지게 나 타날 수 있는 세포학적 반응은 NF-κB를 경로로 따르는 TNF-α의 조절 과정이라 고 할 수 있다.
Pullulan + NaF-PVA tape은 HGF 세포에서 NF-κB를 통한 TNF-α에 영향을 미 치는 과정을 통해 필름이 치은과 접촉했을 때 염증반응을 일으킬 수 있다는 의심 이 가능하였다. 이 key pathway를 통하여 pullulan + NaF-PVA tape세포의 생존 률이 낮아진 이유가 필름에 의한 염증반응에 의한 결과임을 추정해 볼 수 있다.
앞서 이야기 했듯이 GSEA는 큰 세트에서 과발현 유전자의 기능적 프로파일을 식 별하고 세트의 유전자 간의 연관성을 확인하기 위해 수행되었다. 여러 개의 유전자 중에 이 Key pathway와 연관된 유전자를 하나씩 살펴볼 수 있었다. HGF 세포 실 험에서 pullulan + NaF-PVAtape 그룹은 총 15개의 유전자가 key pathway에 관여 하였다(Fig. 9). 이 유전자들 중 LDLR 유전자의 결핍은 혈장 콜레스테롤을 증가시 키고 동맥경화증 가능성을 높인다. LDLR이 높아지면 혈관 염증에 영향을 미친다 [59]. CXCL3는 종양 유전자, 대식세포 염증성 단백질-2-β라고 불리는 염증과 연관 된 유전자이다[60]. 이러한 15개의 유전자들의 발현의 변화에 의해서 TNF-α의 기 능이 증진되었다고 유추할 수 있다.
이와 대조적으로 HGF 세포의 전통적인 불소함유 접착필름과 대조군 그룹간의 GSEA에서는 어떠한 Hall mark key pathway도 나타나지 않았다. 즉 유전자 검사 를 통한 GSEA 분석에서도 MTT assay 결과를 뒷받침할 수 있는 값이 도출되었 다.
PDL 세포의 GSEA에서는 pullulan + NaF-PVA tape 그룹과 NaF-PVA tape 그 룹 뿐 아니라 두 그룹 모두에서 발현의 변이가 나타난 유전자들에서도 5개 이상의 key pathway가 도출되었다. 이 모든 GSEA의 key pathway는 TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB였다. NaF-PVA tape도 이 key pathway와 유의
성이 아주 높았지만 pullulan + NaF-PVA tape에서 더 높은 유의성을 보여주었다.
이 연구에서 기존의 불소함유 접착필름의 접착력을 개선하기 위해 서로 다른 용 해 특성을 갖는 pullulan과 PVA를 접착시켜 개발된 이중(double layers) 접착필름 은 전통적인 불소함유 접착필름보다 더 낮은 항균효과와 높은 세포 독성을 보여주 었다. 앞으로 불소함유 접착필름의 효과와 안정성의 개선을 위해서 풀루란의 적용 방법을 개선하거나 풀루란을 대체하는 물질에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된 다. 또한 DEGs 분석을 통해 HGF 세포들보다 PDL 세포들이 모든 불소함유 접착 필름에 있어서 생체 안정성이 더 취약하다고 유추해 볼 수 있었다. 어린아이들에게 불소함유 접착필름을 사용했을 때 치주인대가 직접적으로 불소함유 접착필름에 접 촉될 경우는 아주 적을 것으로 생각되지만 비정상적인 저작력에 의해 치근이 노출 되거나 교정치료에 의해 치은퇴축이 발생한 경우, 외상으로 인하여 치주인대가 노 출된 경우, 또는 전신질환으로 인하여 치조골의 많은 흡수가 있는 아이들에서 불소 함유 접착필름을 적용할 때 이러한 점을 고려해야 할 것이다[61,62]. 더하여 치은과 의 접촉을 최소화 하기 위해 불소함유 접착필름의 크기에 대한 고려가 필요하며 사용자 개개인에 맞는 커스터마이즈화 한 불소함유 접착필름의 제작은 제품의 안 정성을 보완해줄 수 있을 것으로 생각된다.