1.
1.
1. 재료 재료 재료 재료
Kryptofix 2.2.2, potassium carbonate, acetonitrile, CeliteTM, reaction flask, Silica gel 60, methanol, chloroform, tetrahydrofuran, ethanol, HCI, H2O2 solution, NaHSO3, NaHCO3는 Aldrich사(USA)의 제품을 구입하여 사용 하였다.
Trypan blue solution, formamide, formaldehyde dipyridamole, nitrobenzyl-thioinosine(NBTI), TdR, uracil, adenine, 2-chloroadenosine 10mM phosphate buffer, dimethylsulfoxide(DMSO)는 Sigma사(USA)의 제품을 사용 하였다. Diethyl ether는 Tedia사(USA)의 제품을 사용하였다.
Tosyla te-penciclovir( N2-( p-Anisyldiphenylmethy l) -9-[(4 -( p- toluenesulfonyloxy))-3-p-anisyldiphenylmethoxy-methylbutyl]guanine)은 Futurechem(Korea)에서 구입하여 사용하였다.
방사성동위원소인 [18F]는 한국원자력의학원의 KIRAMS MC-50 가속기로부 터 생산된 [18F]KF 용액을 사용하였다.
Earle's Balanced Salt Solution(EBSS), Trypsin-EDTA, Nylon membrane, nitrocellulose membrane, Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)은 Gibco사(USA) 제품을 사용하였으며, 세포배양 접시는 Corning사(USA) 제품을 사용하였고, fetal bovine serum은 Biowhittaker사 (USA) 제품을 사용하였다. Agarose는 FML Bio-product사의 seakem LE agarose를 사용하였고 Neubauer chamber는 Superior사(Germany)의 것을 사 용하였다.
MCA-RH7777(MCA) 세포주는 ATCC(USA)에서 구입하여 사용하였고, 이 세포에 retroviral 벡터를 이용하여 Neo 유전자와 HSV1-tk 유전자가 이입된
MCA-tk 세포는 원자력병원 핵의학연구실에서 제공받아 사용하였다. 세포배양을 위한 항온 항습기는 Forma scientific사(USA)의 water jacket 3250 모델을 사 용하였다. 반응물의 건조 및 용매를 제거하기 위하여 사용한 rotary evaporator 는 Buchii사의 제품을 사용하다.
Total RNA 추출 시약으로 iNtRON Biotechnology사(USA)의 easy-spinTM (DNA free) Total RNA Extraction Kit을 사용하였으며, RT-PCR을 위한 primer는 한국 보한 바이오메디칼 주식회사에 주문하여 사용하였고, RT-PCR 시 약으로 QIAGEN사(USA)의 OneStep RT-PCR kit을 사용하였다. Internal control인 G3PDH는 Clontech사(USA)의 제품을 이용하였다.
고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)는 Waters사(USA)의 제품을 이용하였으 며, 컬럼은 Waters Xtera C18을 사용하였고 흡광도를 측정은 Waters 486 Absorbance detector를 사용하고, 방사능 계측은 Raytest사(Germany)의 GABI RI detecter를 이용하여 계측하였다. 반응물의 분취를 위하여 Bio-rad(USA)사 로부터 구입한 fraction collecter (Model 2110)를 사용하였다.
방사능을 계측하기 위하여 우물 형태 NaI crystal로 된 Wallac Wizard사 (Finland)의 1480 WIZARD 3TM 감마카운터를 사용하였으며 PET 생체영상은 Concorde Microsystems Inc.(USA)사의 microPET R4 장비를 이용하였다. 실험 동물로 사용한 BALB/c-nude 마우스는 SLC사(Japan)로부터 구입하여 사용하였 다.
2. 2.
2. 2. 실험 실험 방법 실험 실험 방법 방법 방법
2. 1. MCA 간암 세포주에서의 HSV1-tk 유전자 발현
2. 1. 1. 세포주의 배양
Buffalo 렛드의 간암 세포주인 MCA와 이 세포에 retroviral 벡터를 이용해 HSV1-tk 유전자를 이입한 MCA-tk 세포주를 20% horse serum과 5% fetal bovine serum이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium에 75 mm2 culture flask를 이용하여 5% CO2 조건하에 배양하였다. 배양한 후 48시간 간격 으로 세포의 밀도가 전체 flask 면적의 80%가 넘지 않도록 계대하며 유지하였다.
세포내에 이입된 유전자에 selection marker로서 NEO gene이 삽입되어 있어 HSV1-tk 유전자가 이입된 세포만 선택적으로 배양이 가능하도록 3번의 계대 시 1회의 간격으로 G418을 800 ㎍/㎖ 첨가하여 배양 하였다. 계대 시 flask 바닥에 붙어있는 세포를 떼어내기 위해서 1× trypsind-EDTA를 사용하여 가볍게 한번 헹구어 낸 후 다시 1× trypsin-EDTA 3 ㎖를 첨가하여 5-10분 실온에 방치한 후 세포손상을 막기 위해 10 ㎖의 세포 배양액으로 중화시켜 1000 rmp에 5분 원침하여 세포를 수집하였다. 수집된 세포는 3 ㎖의 세포배양액으로 재 부유 한 후 세포 수 확인과 생존율 확인을 위해 tryphan blue로 염색하여 Neubaure chamber에서 계수 하였다.
2. 1. 2. RNA 분리
MCA와 MCA-tk 세포 각각 5×106개를 total RNA 분리에 이용하였다. RNA 분리는 iNtRON Biotechnology사의 easy-spinTM(DNA free) Total RNA Extraction Kit을 사용하여 제조사의 지침에 따라 다음과 같이 수행하였다.
5×106개의 세포를 lysis buffer 1 ㎖과 섞어서 세포가 다 녹을 때 까지 진탕 한 후 chloroform 400 ㎕를 넣고 다시 진탕하여 실온에 2분간 방치하였다. 4℃, 13000 rpm에서 15분간 원침하여 상층액 400 ㎕를 취한 후 동량의 precipitation buffer와 섞어 실온에 2분 방치한 후 400 ㎕ 씩 2 회에 걸쳐 membrane filter에 옮겨 13,000 rpm에서 2분간 원침하여 여액을 제거하였다.
Washing buffer 1 ㎖를 membrane filter에 넣어 2회 세척한 후 최종적으로 elution buffer 50 ㎕를 이용하여 RNA를 용출시켰다. 분리한 RNA를 UV
spectrophotometer를 이용하여 정량한 후 다음 검사에 이용할 때 까지 -70℃에 보관하였다.
2. 1. 3. RT-PCR 분석
MCA-tk 세포에서 HSV1-tk 유전자가 잘 발현되고 있는지를 확인하기 위하 여 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Re-action)을 이용하여 HSV1-tk 유전자 발현에 의해 생성된 mRNA를 검출하였다.
QIAGEN사의 OneStep RT-PCR Kit을 사용하여 HSV1-tk 유전자에 특이적인 primer (sense : 5'-CTCACCCTCATCTTCGACCG-3', antisense : 5'-CCT GCAGATACCGCACCGTA-3')를 사용하여 PCR을 시행하였고, rat glyceraldeh yde 3-phosphate dehydrogenase(G3PDH)에 특이적인 primer( sense : 5'-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3', antisense : 5'-CATGTAGGCC ATGAGGTCCACCAC-3')을 이용하여 internal control로 사용하였다. RT- PCR 조건은 total RNA 1 ㎍/㎕, primer 각 0.6 μM, enzyme mix 2.0 ㎕, dNTP mix 2.0 ㎕, 5×RT-PCR buffer 10.0 ㎕, RNase-free water 31 ㎕를 master mix로 만들어 사용했다. 50℃에서 30 분, 95℃에서 15 분을 1 cycle, 94℃ 30 초, 59℃ 45 초, 72℃ 45 초를 35 cycle, 72℃ 10 분 1 cycle로 PCR 을 진행 하였다. 생성된 PCR product는 2% agarose에서 100 V로 40분간 전기 영동한 후 etidium bromide로 염색하여 자외선 조사하여 반점을 관찰하였다.
2. 2. 방사성 불소 표지 핵산 유도체인 FHBG 제조
2. 2. 1. 전구체인 tosylate penciclovir의 제조
Triester(2)를 t-butanol 용매와 sodium borohydride와 MeOH을 넣고 교반하
methyl)butane-1,4-diol(3)에 2,2-dimethoxypropane과 p-toluenesulphonic acid을 처리하여 5-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-1,3-dioxane(4)를 합성 하였으며, triphenylphosphine과 N,N-dimethylformamide에 녹아 있는 carbon tetrabromide를 이용하여 5-(2-bromoethyl)-2,2-dimethyl-1,3-dioxane(5) 을 합성하였다. 합성된 5-(2-bromoethyl)-2,2-dimethyl-1,3-dioxane(5)과 2- amino-6-chloro-purine, potassium carbonate를 N,N-dimethylformamid e 용매에 녹인 후 실온에서 교반하여 2-amino-6-chloro-9-[2-[2,2-dimethyl -1,3-dioxane-5-yl)-ethyl]-purine(6)을 합성하였으며 얻어진 2-amino-6- chloro-9-[2-[2,2-dimethyl-1,3-di-oxane-5-yl)-ethyl]purine(6)에 2 M hydrochloric acid를 가하고 교반하여 6-chloro기를 6-oxo기로 변환시키고 acetonide의 보호기를 제거함으로써 9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)butyl]
guanine (penciclovir)(7)을 얻을 수 있었다. 방사성동위원소를 표지하기에 안정한 형태의 전구체를 만들기 위해 9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)but-1-yl]
guanine(7)을 N,N-dimethylformamide에 녹이고 DMAP (dimethylamino- pyridine)와 methoxytrityl, triethylamine을 가하여 50℃에서 2 시간 동안 교반함 으로써 MTr로 보호된 N2 -(monomethoxytrityl)-9-[4-(hydroxy-3-(hydro-xymethyl)but-1-yl]guanine (8)를 얻었다. p-toluene- sulfonyl chloride를 사용하여 최종 전구체인 N2-(p-anisyldiphenylmethyl)-9-(4-tosyl)-3-p- anisyldiphenylmethoxy-methylbutyl]guanine (9)를 합성하였다 (Fig. 4).
2. 2. 2. FHBG 전구체를 이용한 [
18F]FHBG의 합성 및 분리정제
KIRAMS MC-50 가속기에서 생산된 [18F]KF solution 248.6 mCi(9.2 GBq), Kryptofix 2.2.2.(7-9 mg), potassium carbonate(1-2 mg)을 azeotropic distillation 방법을 이용해 fluoride-kryptofix complex로 만들었다. 얻어진 혼합물 과 0.5 ㎖ acetonitrile에 4 mg 의 농도로 녹여져 있는 전구체인 tosylate penci-
clovir(N2-(p-anisyldiphenylmethyl)-9-[(4-tosyl)-3-p-anisyldiphenyl-methoxy-methylbutyl]guanine)(9) 를 넣고 120℃에서 20분간 교반하였다. 혼합 물을 실온으로 식히고 Sep-Pak cartridge(silica)로 kryptofix 2.2.2.와 반응하지 않은 F-18을 제거한 후 15% MeOH/CH2Cl2 용액으로 추출하였다. 추출된 용액에 1 N HCl(400 ㎖)를 가하고 90℃에서 10분 교반하여 보호기를 제거하였으며, pho-sphate buffer (1 ㎖) 용액으로 희석하였다. 혼합물을 HPLC filter(0.45 mm)로 여 과한 후에 semipreparative-HPLC (Waters Xtera C18, mobile phase : 5-15%
CH3CN/H2O gradient condition, flow rate: 2 ㎖/min)로 분리함으로써 [18F]FHBG를 최종적으로 합성하였다.
C2H5O
Figure 4. Synthetic pathway of [18F]FHBG precursor(tosylate penciclovir).
Triester(2), 2-(hydroxymethyl)butane-1,4-diol(3), 5-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-1,3-dioxane(4), 5-(2-bromoethyl)-2,2-dimethyl-1,3-di-oxane(5), 2-amino-6-chloro-9-[2-[2,2-dimethyl-1,3-dioxane-5-yl)-ethyl]purine(6), 9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)butyl]guanine(penci- clovir)(7), N2-(monomethoxytrityl)-9-[4-(hydroxy-3-(hydroxymethyl) but-1-yl]guanine(8), N2-(p-anisyldiphenylmethyl)-9-(4-tosyl)-3-p- anisyldiphenylmethoxy-methylbutyl]guanine(9).
2. 3. [
18F]FHBG의 세포내 섭취
2. 3. 1. 렛드 간암세포주에서의 [
18F]FHBG 섭취율 분석
HSV1-tk 유전자가 발현된 세포내에만 특이적으로 [18F]FHBG가 집적되는지 를 평가하기 위하여 Morris hepatoma 세포주인 MCARH-7777(MCA) 세포주 와 HSV1-tk 유전자를 retrovirus 벡터로 이입한 MCA-tk 세포주에서 [18F]FHBG의 시간경과에 따른 섭취율을 비교하였다. 6 well plate에 각 세포주 를 well당 1×106 cell(n=3)이 되도록 seeding 하고 20% horse serum과 5%
FBS가 포함된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)을 이용하여 24 시 간 배양한 후 각 well 당 20 μCi(740 KBq)의 [18F]FHBG를 넣고 각각 10 분, 30 분, 60 분, 120 분, 180 분 동안 추가로 배양한 뒤 배지를 흡입하여 제거하 고 각각의 세포를 trypsin-EDTA 300 ㎕로 처리하여 세포를 떼어 내었다. 떼어 낸 세포를 Cold PBS 1 ㎖로 3 회 세척하여 세포에 섭취되지 않은 여분의 방사능 을 제거하였다. 최종적으로 각 세포에 섭취된 방사능을 감마카운터를 이용하여 계 측하여 평가하였다. 섭취율은 투입된 방사능의 백분율(% ID: percentage of injected dose)로 나타내었다.
2. 3. 2. 섭취된 [
18F]FHBG의 세포외로의 방출량 분석
섭취된 [18F]FHBG가 세포내에서 방출되는지를 평가하기 위하여 MCA 세포주 와 MCA-tk 세포주를 6 well plate에 세포수가 2×105개 (n=3)가 되도록 seeding하고 DMEM에서 24 시간 배양하였다. 각각의 well에 [18F]FHBG 40 μCi (1.48 MBq)를 넣고 2 시간동안 배양하여 섭취시킨 후 각각의 세포를 trypsin-EDTA를 처리한 후 cold PBS 1 ㎖을 이용하여 3회 세척하였다. 여기에 2 ㎖의 DMEM을 넣고 배양한 후 0 분, 10 분, 20 분, 30 분, 60 분 후에 원침하 여 배지 여액을 제거하고 세포내에 방출되지 않고 남아있는 방사능을 감마카운터
를 이용하여 계측하였다. 0분에서 계측된 방사능을 100%로 하고 이에 따른 각각 의 시간대별 세포의 상대적 방사능을 백분율(% retention radioactivity)로 나타내 었다.
2. 3. 3. HSV1-tk 발현 세포수 변화에 따른 [
18F]FHBG 섭취율 상관도 분석
MCA 세포와 HSV1-tk 유전자가 이입된 MCA-tk 세포에서 MCA-tk 세포의 백분율 증가에 따른 [18F]FHBG 섭취량의 상관관계를 평가하기 위하여 MCA-tk 세포를 전체 세포수의 0%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%가 되도록 각각 혼합하고 6 well plate의 각 well 당 2×105 개 (n=3)의 세포를 seeding 하여 DMEM 상에서 24시간 배양한 뒤 [18F]FHBG 40 μCi (1.48 MBq)를 첨가하여 2 시간 동안 추가로 배양하여 섭취시켜 배지를 흡입하여 제거 하였다. Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 떼어내고 1 ㎖의 cold PBS로 3회 세척하여 여액의 방사능을 제거 하였다. 세포내에 섭취된 방사능을 감마카운터를 이용하여 계측하였다.
2. 3. 4. Transporter 억제물질 및 경쟁물질에 따른 [
18F]FHBG 섭취율 분석
FHBG의 세포내로의 섭취 경로에 관한 연구와 여러 가지 억제물질(inhibitor) 과 경쟁물질과의 상호관계를 알아보기 위하여 Harberkorn 등의 실험방법 (42)을 이용하였다. MCA 세포주와 MCA-tk 세포주를 6 well plate에 세포수가 5×105 개(n=3)가 되도록 접종하고 24시간 배양하였다. 각각의 well을 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)으로 15 분씩 2 회 세척하였다. EBSS에 각각의 경쟁물질 및 억제물질을 최종농도가 각각 2.5 μM (dipyridamole), 2.5 μM (nitrobenzyl-thioinosine; NBTI), 1 mM (Thymidine; TdR), 1 mM
(Uridine), 1 mM (uracil), 1 mM (adenine), 1 mM (2-chloroadenosine;
CA), 1 mM (Ganciclovir; GCV)가 되도록 제조하여 2 ㎖을 각 well 에 분주하 고 [18F]FHBG 40 μCi (1.48 MBq)를 첨가하였다. 60 분간 섭취시킨 후 반응 액을 흡입하여 제거하고 cold PBS 1 ㎖로 3회 세척한 뒤 감마카운터로 계측하여 각각의 억제물질 및 경쟁물질의 영향에 따른 세포내 [18F]FHBG의 섭취율 변화를 평가하였다.
2. 4. 종양 동물모델에서의 [
18F]FHBG 생체분포 및 영상
2. 4. 1. 실험동물의 사육
실험동물로 사용한 BALB/c nude mouse의 사육조건은 온도 23±2℃, 상대 습도 55±5%, 그리고 명암교대 12 시간을 각각 유지하였다. 방사선 멸균사료와 자외선 여과수를 급식시켰으며 고온 처리된 β-chip을 깔아 cage당 5 마리씩 사 육하였다.
2. 4. 2. 종양 동물모델에서의 생체분포
종양 동물모델을 만들기 위해 MCA 세포와 HSV1-tk 유전자 이입 세포주인 MCA-tk 세포를 배양하여 trysin-EDTA로 처리한 뒤 1000 rmp 으로 5 분간 원침하여 상층의 배양액을 제거한 뒤 PBS로 재부유한 후 100 ㎕ 당 각 세포가 1×107개가 되도록 희석하였다. BALB/c-nude mice의 좌측 옆구리에는 MCA 세포를, 우측 옆구리에는 MCA-tk 세포를 피하로 주사하고 3주간 종양의 성장을 관찰 하였다. 형성된 종양의 직경이 7mm-10mm 정도인 mice를 선별하여 마취 시킨 뒤 [18F]FHBG 300 μCi (11.1 MBq)를 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다 (n=4). 각각의 동물을 투여 10 분, 30 분, 60 분, 120 분 후에 희생하여 혈액,