Fig. 15는 20배 대물렌즈(α-23°, N.A-0.4)를 사용하였을 때의 실험 결과이다. 가로 축은 시료가 광축 방향으로 이동한 거리를 나타낸 것이며, 세로축은 거리의 변화 따 른 빛의 세기를 나타낸 것이다. 시료는 거울을 사용하였고, 시료에서 대물렌즈까지의 거리(O)를 일정한 범위 내에서 광축 방향으로 2.5μm씩 이동하고, 대물렌즈에서 상까 지의 거리(I)를 5cm씩 변화시키면서 빛의 세기가 변화하는 것을 측정한 것이다. (a)는 I = 25.5cm, O = 2000μm 인 경우로 side-lobe의 크기가 매우 크고 반치폭 또한 넓게 분포하고 있다. 그리고 빛의 세기의 최대값은 작게 나타남을 볼 수 있다. 이에 반해 (b)는 I = 20.5cm, O = 2045μm 상태로 side-lobe의 크기가 최소화되었으며 빛의 세 기의 최대 크기도 증가하였다. 또한, 빛이 세기가 가장 큰 부분을 중심으로 대칭 형태 를 보이고 있다. 이는 경로차가 없는 경우의 전산기 시늉결과인 Fig. 8(a)에 가장 유 사한 결과이다. 즉, 이 부분이 경로차가 최소화되는 지점으로 볼 수 있다. (c)와 (d)의 경우는 반치폭의 넓고, side-lobe의 크기도 빛의 세기 최대값과 비교해볼 때 무시 할
-300 -250 -200 -150 -100 0.000
0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030
I n t e n s i t y ( a.u )
( b ) ( a )
t=19 μm
-300 -250 -200 -150 -100 -50 0 0.00
0.01 0.02 0.03 0.04
I n t e n s i t y ( a.u )
B= 1 6
Fig. 13. Axial response intensity for various values of coefficient B.
(t : sample thickness, B =- 1
2 kd2∇ (1
l ), d : distance from objective to sample, l : distance from objective to image, a : Before phase compensation, b : after phase compensation )
-500 -450 -400 -350 -300 -250 -200 0.000
0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.016
I n t e n s i t y ( a.u )
( a )
t=33 μm
( b )
-500 -450 -400 -350 -300 -250 -200 0.00
0.01 0.02 0.03 0.04
I n t e n s i t y ( a.u )
B= 2 8
Fig. 14. Axial response intensity for various values of coefficient B.
(t : sample thickness, B =- 1
2 kd2∇ (1
l ), d : distance from objective to sample, l : distance from objective to image a : Before phase compensation, b : after phase compensation)
0 10 20 30
수 없을 정도로 크다. 그리고 빛의 세기가 가장 큰 부분을 중심으로 반대칭의 형태를 이루고 있다.
40배의 대물렌즈(α-40°, N.A.-0.65)를 사용하여 같은 방법으로 빛의 세기를 측정한 실험 결과가 Fig. 16이다. (a)는 위상오차에 의한 side-lobe의 영향으로 반치폭이 넓 고, 빛의 최대 세기도 작다. (b)는 반치폭은 좁아졌으며 빛의 세기의 최대 크기는 증 가하였다. 그리고 빛의 세기 분포도 (a)에 비해 오른쪽으로 이동하였음을 볼 수 있었 다. 이것은 (a)와 비교해 경로차가 감소하였기 때문에 나타난 현상이다. (c)에서는 side-lobe의 크기가 빛의 세기 최대값과 비교해 매우 작아졌으며 반치폭도 매우 좁아 졌으며, 빛의 세기가 가장 큰 부분을 중심으로 대칭 형태에 근접함을 확인할 수 있었 다. 그러므로 이 부분이 Herschel 조건을 가장 잘 만족하는 부분이며, 경로차가 없는 경우에 전산기 시늉 결과인 Fig. 9(a)에 가장 근접한 것으로 볼 수 있다. Fig. 15와 Fig.
16의 실험 결과에서 보듯이 위상오차를 최소화 할 경우 side-lobe의 크기는 매우 작 고, 빛의 세기는 크게 나타났다. 그리고 빛의 세기가 가장 큰 부분을 중심으로 빛의 세기 분포가 대칭 형태를 이루고 있음을 확인할 수 있다. 또한 렌즈의 개구수 (numerical aperture)가 클수록 반치폭의 점점 좁아짐으로써 분해능이 좋아진다는 사 실도 알 수 있었다.
렌즈의 왜곡에 의해 발생하는 side-lobe가 광축 방향의 분해능에 미치는 영향을 알 아보기 위하여 Fig. 17과 같은 형태의 시료를 초점 심도를 이용하여 측정하였다. 시 료는 덮게 유리(cover glass)를 50% 불산 처리 후 증발(evaporation)증착법을 이용하 여 알루미늄을 증착 하였다.
Fig. 18은 초점 심도를 이용하여 시료를 측정한 것으로 위상 보정을 하지 않았을 때 의 실험 결과이다. 검출기 앞의 바늘구멍을 20μm로 사용했을 경우에 초점 심도가 2.5μm 인 40배 대물렌즈를 사용하였다. 가로축은 x방향으로 시료를 2.5 μm씩 이동 한 거리를 나타내며, 세로축은 빛의 세기를 나타낸다. 우변의 z는 광축 방향으로 시료 를 1.25μm 씩 이동한 거리를 표시한 것이다. (a)는 시료를 광축 방향으로 이동시켜 시료의 중간 부분에 초점이 형성되도록 하여 측정한 결과이다. z3 부분에서 빛이 세 기가 가장 크게 측정되었다. 이것은 시료 표면에서 시료 중간까지의 깊이가 3.75μm 임을 뜻한다. 하지만 실제 시료의 깊이는 6.5μm로 측정 결과와 다르게 나타났다. (b)는
0 5 10 15 20 25 30 35
시료의 가장 밑 부분에 초점이 형성되었을 때에 빛의 세기를 표시한 것으로 시료의 위치가 광축 방향에 대해 z4, z5, z6으로 변화하면서 빛의 세기가 밑 부분의 중간 영 역을 제외하고는 계속하여 감소하여야 하지만 z6에서 볼 수 있듯이 빛의 세기가 감소 하지 않고 증가함을 관찰할 수 있었다. 이것은 side-lobe의 영향으로 시료의 정확한 형태를 알 수 없으며, 또한 시료의 깊이에 대한 정보도 정확히 알 수 없음을 보여주 고 있다. 따라서 위상오차에 의해 발생하는 side-lobe가 3차원 상을 형성하는데 중요 한 역할을 하는 광축 방향의 분해능에 막대한 영향을 주고 있는 것을 알 수 있었다.
Fig. 19는 Herschel 조건을 만족하도록 광경로를 조절한 후(위상을 보정한 후)에 시 료에서 반사된 빛의 세기를 측정한 실험 결과이다. (a)와 (b)는 각각 초점이 시료의 중간 부분과 가장 밑 부분에 형성되도록 시료를 광축 방향으로 이동하여 빛의 세기를 측정한 것이다. (a)에서 보듯이 z6일 경우에 빛이 세기가 가장 크게 나타났다. 이는 시료의 중간 깊이가 약 6.25μm 임을 나타내는 것으로 실제 시료의 깊이와 거의 일치 한다. 또한, Fig. 18에서 side-lobe의 영향으로 시료에 대한 정보가 부정확했던 것을 광경로의 조절을 통해 수정되었음을 확인할 수 있었다. 또한 (b)를 Fig. 18(b)와 비교 하여 보면 Fig. 18(b)에서는 구분할 수 없었던 시료의 가장 밑 부분의 형태를 (b)에서 는 빛의 세기 차이를 이용하여 구별할 수 있음을 볼 수 있다.
Fig. 18과 Fig. 19의 결과에서 렌즈 왜곡에 의한 위상오차를 광경로의 조절을 통해 위상오차를 최소화함으로써 광축 방향의 분해능을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
시료의 두께와 굴절에 따른 위상오차의 영향을 알아보기 위해 시료는 깊이가 19μm, 33μm 이며 물, 식염수 등을 채워 놓을 수 있도록 제작한 형태가 Fig. 20 이다.
시료에 물을 채워놓고 광축 방향으로 변화시키면서 빛의 세기변화를 측정한 결과가 Fig. 21 이다. (a)는 대물렌즈에서 시료까지의 거리(O)가 980.0μm이고 대물렌즈에서 시료까지의 거리(I)가 20cm로서 광경로의 차로 인한 side-lobe의 영향으로 전체적인 선폭이 넓게 분포하고 있고 빛의 최대 세기를 중심으로 비대칭 형태를 이루고 있다.
(b)는 O가 987.5μm이고 I 가 25cm 인 경우로 선폭이 많이 좁아 졌으며 빛의 세기도 증가하였고, 또한 빛의 최대 세기를 중심으로 대칭형태를 이루고 있다. (c)는 O가 992.5μm 이고 I가 30cm인 경우로 빛의 세기가 (b)와 비교해 많이 낮아졌고 선폭도 side-lobe의 영향으로 커지는 경향을 볼 수 있으며 O와 I를 더 증가시킨 (d)의 경우는
0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 0 .0 0
0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 0 .2 5 0 .3 0 0 .3 5
( a ) x ( 2 .5 μ m )
Intensity(a.u)
z 6
0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0
0 .0 0 .1 0 .2 0 .3 0 .4 0 .5
( b ) x ( 2 .5 μ m )
Intensity(a.u)
z 7 z 8
Fig. 19. Minimum of side-lobe.
가 987.5μm이고 I가 25cm인 경우에 전체적인 특징이 Fig. 13(b)의 전산기 시늉 결과 와 가장 유사하므로 이 부분이 위상오차로 인해 발생하는 side-lobe의 영향을 최소화 한 지점으로 볼 수 있다.
같은 방법으로 시료(물)의 두께가 33μm일 때의 실험결과를 나타낸 것이 Fig. 22이 다. (a)는 O가 975.0μm, I가 20cm인 경우로 선폭의 넓이가 side-lobe의 영향으로 넓 게 분포되어 있으며 비대칭이다. 반면에 (b)는 O가 987.0μm 이고 I가 25cm인 경우로 빛의 세기가 가장 크게 나타나고 있고, 빛의 세기분포도 대칭형태로 측정되었다.
(c) 와 (d)는 O와 I를 더 증가시키면서 측정한 결과로서 반치폭의 크기가 더 넓어졌으 며 빛의 최대 세기도 낮아졌다. 결과적으로 (b)는 Fig. 14(b)의 전산기 시늉 결과에 가 장 근접한 특징을 가지고 있고, 특히 시료(물)의 두께가 19μm인 실험 결과와 비교해 볼 때 빛의 세기의 분포가 더 왼쪽으로 이동하였음을 확인할 수 있다. 이는 Fig. 10에 서 시료의 두께가 증가할수록 빛의 세기 분포가 왼쪽으로 이동하는 모습을 보여준 전 산기 시늉 결과와 일치하는 것이다. 또한 Fig. 12의 전산기 시늉 결과와 같이 위상 보 정이 되었을 때는 두께에 상관없이 빛의 세기가 일정하게 나타나고 있음을 관찰 할 수 있었다.
Fig. 23은 실제 생물세포에 근접한 실험을 하기 위하여 시료를 물 대신 생체식염수 를 사용하였을 경우 깊이가 19μm인 시료를 가지고 실험한 실험 결과이다. (a)는 빛 의 최대 세기를 중심으로 대칭 형태를 이루고 있고 (b),(c),(d)와 비교해 볼 때 빛의 최대 세기도 가장 크게 나타나고 있었다. 특히, 물을 사용하였을 때의 실험 결과인 Fig. 15, Fig. 16과 비교해 볼 때 빛의 세기분포가 왼쪽으로 이동하여 나타나고 있다.
이는 물 보다 생체식염수의 굴절률이 크기 때문에 유효 광경로(effective optical length)가 짧아져서 초점이 음의 방향으로 이동했기 때문이라 사료된다. 이러한 결과 는 Fig. 8과 Fig. 9 그리고 Fig. 13, Fig 14의 전산기 시늉 결과와 일치하는 것이다.
(b)는 광경로 차에 의해 발생하는 side-lobe의 영향으로 (a)와 비교해 선폭이 증가하 고 있으며 빛의 최대 세기 또한 감소하고 있다. (c),(d)의 경우도 Herschel 조건을 만 족시키지 못함으로써 빛의 최대 세기도 감소하는 양상을 보여 주고 있다.
Fig. 25는 시료(생체 식염수)의 깊이가 33μm인 경우에 광축 방향으로 시료를 이동 하면서 빛의 세기를 측정한 것이다. (a)를 (b),(c),(d)와 비교해 볼 때 side-lobe의 영향 도 가장 적고 빛의 최대 세기도 가장 크게 나타났다. 또한 시료의 깊이가 19μm인 실
험 결과와 비교해 볼 때 빛의 세기 분포가 왼쪽에 치우쳐 있음을 볼 수 있었다. 이는 Fig 13와 Fig 14에서 보였던 전산기 시늉 결과와 일치한다. 따라서 (a)의 결과가 side-lobe의 영향이 가장 적은 부분임을 알 수 있다.
0 10 20 30 40
0 10 20 30 40 50
0 10 20 30 40