II. 실험과정
1) 사용 균주
항균활성을 확인하기 위해 gram 양성균인 Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes 와 gram 음성 균인 Escherichia coli 를 준비하였다.
각 균주 별로 고체배지에 도말하여 하루 동안 37℃ 에서 배양한 뒤, 단일 colony를 취해서 액체배지 3 ㎖에 접종하여 다시 하루 동안 37℃ shaking incubator에서 배양하 였다. 배양된 균들은 10-1, 10-2, 10-3으로 희석하여 고체배지에 도말한 후, 다시 37 ℃ 에서 하루 동안 배양하여, 균주별로 집락이 균일하게 분포하는 농도를 확인한다.
2) 시료의 처리
위에서 분획한 총 23개의 sample들 중 ±MgCl2 broth에서 분획한 BuOH층 sample 4 개 (PB1, PB2, NB1, NB2) 를 제외한 나머지 sample들은 Dimethyl sulfoxide(DMSO) 에 녹여 2 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖, 500 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖ 의 4개의 농도범위로 희석하여 준비하 였으며, 남은 4개의 sample은 증류수에 녹여 같은 농도 범위로 희석하여 준비하였다.
미리 멸균해 둔 disc 위에 준비한 sample을 30 ㎕씩을 천천히 떨어뜨린 후 건조시켜둔 다. 이때, 대조군으로는 DMSO 30 ㎕ (BuOH층 4개의 sample의 경우는 증류수 30 ㎕) 를 사용하였으며, 항균력을 비교하기 위한 비교군으로 Ampicilin을 sample과 같은 농 도로 희석하여 사용하였다.
3) 항균활성 실험
농도가 결정된 균액 50 ㎕를 top Agar 2 ㎖ 과 섞어서 LB plate에 고르게 펴지게 깔아준 뒤 그 위에 미리 sample을 30 ㎕씩 처리하여 말려둔 disc를 올려놓고 37℃에서 배양하였다. 각 균주에 대한 항균 활성의 정도는 24～48시간 배양시킨 후에 sample을 처리한 disc 주위의 clear zone의 범위로써 측정한다.
7. DPPH법에 의한 항산화 소거활성
앞서 준비된 23개의 sample을 각각 2 ㎎/㎖, 1 ㎎/㎖, 500 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 125 ㎍/
㎖, 62.5 ㎍/㎖ 의 6개의 농도로 준비하고, 비교군으로 사용한 ascorbic acid와 BHT 역 시 같은 농도로 준비하였다.
515 ㎚에서의 흡광도가 8.9～1.1 사이가 되도록 희석한 DPPH solution 180 ㎕에 sample 20 ㎕를 가하고 10분간 반응시킨 후에 ELISA Reader를 이용하여 515㎚에서의 흡광도를 측정하여, DPPH 자유라디칼 소거활성 정도를 측정하였다. 그리고, sample 자체의 흡광도를 고려하여, Ethanol(EtOH) 180 ㎕에 sample 20 ㎕의 sample을 섞어, 똑같이 ELISA Reader를 이용하여 515 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
DPPH 흡광도 - {(DPPH+sample 흡광도) -(sample의 흡광도)}
Inhibition = x 100 ( DPPH 흡광도 )
8. Melanin 함량 측정
B16F10 melanoma cell을 2x105 cells/dish가 되도록 60㎜ culture dish에 분주하여 CO2 incubator에서 37℃, 10시간 정도 전배양을 하였다. 10시간 뒤 각 dish 별로 sample을 2 ㎍/㎖ 또는 20 ㎍/㎖의 농도가 되도록 처리를 하고, CO2 incubator에서 37℃, 3일간 배양하였다.
Sample 처리 마지막날 0.25% Trypsin-EDTA용액을 처리하여 세포를 수집하고, 각 처리군별로 200 ㎕의 1N NaOH용액을 넣고 세포를 녹였다(95℃, 5분간). 합성 멜라닌 (Sigma Chemical Co.) 10mg을 1N NaOH에 녹여 stock solution(1 ㎎/㎖)을 제조한 뒤 700 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 7 ㎍/㎖, 3 ㎍/㎖, 1 ㎍/
㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 standard solution을 제조하였다. Sample과 standard solution을 96well plate에 넣고 450 ㎚에서 분광광도계로 흡광도를 측정한
후 측정된 흡광도 값은 합성 멜라닌으로 작성된 표준 직선에 적용하여 멜라닌 양으로 환산하였다.
9. 세포의 Viability 측정 (MTT assay)
B16F10 melanoma cell을 5x104 cells/well이 되도록 96 well-plate에 분주하여 CO2
incubator에서 37℃, 10시간 정도 전배양을 하였다. 세포가 바닥에 부착이 되면, well 당 sample을 2 ㎍/㎖ 또는 20 ㎍/㎖의 농도가 되도록 처리를 하고 CO2 Incubator에서 37℃, 3일간 배양하였다.
3일 뒤 MTT solution (50㎎/㎖)을 well당 50 ㎕씩 분주한 뒤, 4시간 동안 37℃에서 반 응시킨 후, 얻어진 formazan을 DMSO로 녹인후 ELISA Reader를 이용하여 540 ㎚에 서의 흡광도를 측정하였다.
또한, 정상세포에서의 세포 독성을 비교해 보기 위하여 Detroit-551 fibroblast cell 에 대해서도 2x104 cells/ml의 농도로 상기와 같은 방법으로 MTT assay를 수행하여 세포의 viability를 측정하였다.
III. 실험결과 및 고찰
1. Streptomyces sp. JR1의 균사와 배지색 변화에 미치는 화합물의 영향
Difco manual에 따라 Marin Broth의 성분 화합물들 중 탄소원를 제외한 나머지 성 분들에서 각각 하나의 성분들을 제외한 배지를 제작하여 Streptomyces sp. JR1을 도 말하여 27℃에서 일주일간 배양해본 결과, 다른 배지 성분들은 기존의 Marin Broth와 마찬가지로 균사와 배지 모두 적갈색을 띄면서 자란 반면, 배지 성분들 중 MgCl2를 제외한 배지(negative) 에서만 균사와 배지 색이 변하지 않음을 확인 할 수 있었다 (Table 4).
Table 4. Chemicals dependence of medium color of streptomyces sp. JR1 Removed chemicals Color change Removed chemicals Color change
Ferric Citrate + Potassium Bromide +
Sodium Chloride + Strontium Chloride +
Magnessium Chloride - Boric Acid +
Sodium Sulfate + Sodium silicate +
Calcium Chloride + Sodium fluoride +
Potassium chloride + Ammonium Nitrate +
Sodium Bicarbonate + Disodium phosphate +
* comlplete Marin Broth change to red-brown color
** + : color change - : no color change
상기 결과의 확인은 Streptomyces sp. JR1을 Marin Broth (positive broth)와 MgCl2
성분을 제거한 Marin Broth (negative broth)에서 27℃에서 일주일을 배양한 결과, MgCl2성분이 함유되어있는 배지에서 자란 Streptomyces sp. JR1은 균사와 배지색이
모두 적갈색을 띄는 반면, MgCl2 성분을 제외시킨 negative broth에서는 균사와 배지 색에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1, 2).
Fig. 1. Streptomyces sp. JR1 on the agar plate added MgCl2 (left) or removed MgCl2 (right)
Fig. 2. Streptomyces sp. JR1 on the Marin broth added MgCl2 (left) and removed MgCl2 (right).
2. Streptomyces sp. JR1의 growth rate와 pigmentation의 경시적
Fig. 4. Time course of Pigmentation produced by Streptomyces sp. JR1
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
1 2 3 4 5 6 7 8
days
abs<450nm>
positive negative
* Pigmentation of Streptomyces sp. JR1 was measured at positive or negative broth everyday. Pigment was determined with UV/VIS spectrophotometer at 450㎚.
Fig. 5. Visible Difference Spectrum of pigmentation at ±MgCl2 broth
*Visible difference spectrum of pigments produced by Streptomyces sp. JR1 against marine broth after 7 days culture. λmax of pigment at negative broth was 420 ㎚, while that at positive broth was 510 ㎚.
3. 배양액의 초기 pH에 의한 pigmentation의 변화
Red-brown pigmentation이 나타나는 Marin Broth를 pH 5.0에서 pH 9.0까지 0.5 간 격으로 제조하여 각 배지별로 Streptomyces sp. JR1을 동일량 접종하여 27℃에서 일 주일간을 배양하면서 pigmentation을 변화를 관찰해 본 결과 배지 조건이 중성 및 약 염기성인 경우에 red-brown pigmentation이 더 잘 나타났다(Fig 6).
배지의 초기 pH별로 경시적인 pigmentation의 변화율을 확인해 본 결과 조금씩 차 이는 있지만, 대체적으로 시간이 지남에 따라, 5일째까지는 흡광도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig 7).
또한, 7일 경과후의 각 pH별 배양액의 최종 pH를 확인해 본 결과, 대체적으로 pH가 7.8～8.2 정도의 염기성을 띄는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본래 방선균이 유래한 해 수의 pH가 8.0 정도 이므로 최적의 서식 조건을 위한 방선균 자체 pH 조절의 영향으 로 보여 지며, pH 8.0 정도에서 pigmentation이 잘 생성되는 것으로 보여 진다.
Fig. 6. Effect of initial pH on the pigment production
* Streptomyces sp. JR1 was cultured at different initial pH for 6 days at 27℃.
Fig. 7. Time dependence of pigmentation at different Inhitial pH of
2) Gram 음성세균에 대한 항균 활성 검색
실험에 사용된 Streptomyces sp. JR1의 acetone 추출물과 Marin Broth의 각 분획물 들을 Gram 음성균인 Escherichia coli 에 대해 항균활성을 검색한 결과 전혀 항균력을 나타내지 않았다.
Table 5. Results of tests of antibacterial activity (units : ㎜)
sample (2㎎/㎖)
gram postive gram negative
S.aures B.cereus B.subtilis St.pyogenes E.coli
Ampr 16～20 7～8 2～4 16～20
a-1 - - - -
-b-1 - - 0.5～1 -
-b-2 - - - -
-c-1 - 2 (0.1) -
-c-2 - (2) - -
-e-1 - 0.5(3) (0.1) -
-e-2 - 0.5(2) (0.1) -
-a-3 - - - -
-b-3 - - - -
-c-3 - (2) - -
-e-3 (0.1) - (2)
a: acetone ext., b: BuOH ext., c: CHCl3 ext., e: EtOAc ext.
5. DPPH 자유 radical 소거 활성
Fig. 8. DPPH free radical scavenging effects of Marin Broth extracts.
6. 배양 상등액 분획 시료의 melanin 함량
배양 상등액 분획 sample들의 melanin 억제 효과(미백 효과)를 확인하기 위하여 B16F10 melanoma cell을 이용하여 melanin contrents를 조사한 결과는 control에 대한 상대적인 값으로 Fig 10, 11에 나타내었다. 세포에 적은 양(2 ㎍/㎖)의 sample을 처리 하였을 때는 a-3과 c-1의 melanin 생성 저해 효과가 좋게 나타나는 것을 확인 하였으 며, 오히려 흑화작용을 보였던 Arbutin과 비교를 하자면, 흑화 작용을 보였던 b-1과 b-2를 제외한 나머지 sample 모두 melanin 생성 저해 효과가 좋음을 확인하였다 (Fig. 10-a.).
또한, 세포에 많은 양 (20 ㎍/㎖)의 sample을 처리하였을 때는 Arbutin과 비교하여 c-1의 melanin 생성 저해 효과가 높게 나타남을 확인하였으며, b-1, b-2의 melanin 생 성 저해 효과는 Arbutin과 비슷한 수준임을 확인하였다(Fig. 10-b.).
그리고 MgCl2의 가감 여부에 따라서 배양한 배양액에서의 분획물인 경우, MgCl2가 첨가된 배양액에서의 분획물들이 MgCl2가 제거된 배양액에서의 분획물들보다 melanin 저해활성이 높게 나타남을 확인하였으며, 특히, CHCl3 와 EtOAc 분획층에서 melanin 저해 효과가 높게 나타남을 확인하였다(Fig. 11.).
a.
a.
7. Cell viability (MTT assay)
B16F10 melanoma cell에 대한 각 분획 sample별 melanin 생성 저해 효과에 따른 세포독성을 보기 위한 MTT assay는, melanin contents측정 결과와 마찬가지로, control을 기준으로 한 상대적인 값으로 Fig. 12에 나타내었다.
세포에 적은 양(2 ㎍/㎖)의 sample을 처리하였을 때는 a-3, e-3, c-2의 세포독성이 높게 나타났으며, a-1, b-1, e-1도 어느 정도의 세포독성을 보이고 b-3, c-3, b-2, c-1 의 경우, 세포독성이 없고, 오히려 세포를 증식시키는 것을 확인하였다(Fig. 12-a). 반 면, 세포에 많은 양(20 ㎍/㎖)의 sample을 처리하였을 때는 a-1, b-1, c-2에서 약간의 세포독성을 보였으나, Arbutin에 비해서는 적었다. e-2의 경우는 세포독성이 없고, 오 히려 cell을 증식시키는 것을 확인할 수가 있었다(Fig. 12-b).
그리고 암세포인 B16F10 melanoma cell 외에 정상 세포인 Detroit-551 fibroblast cell line에 대한 각 분획 sample별 세포 독성을 MTT assay를 통하여 확인해 본 결과 를 control을 기준으로 한 상대적인 값으로 Fig. 13 에 나타내었다.
c-1, e-1, e-3의 경우, 세포독성이 있긴 하였으나, 50% 미만이었으며, 전반적으로 정 상세포에 대한 세포독성은 크지 않은 편이었다.
a.
a.
IV. 결론
즉, Streptomyces sp. JR1의 적갈색의 pigment 생성은 Marin Broth의 MgCl2 성분이
이들 sample들이 정상세포에 미치는 영향을 보기 위하여 Detroit-551 cell에 대해서 도 MTT assay를 수행하였다. 그 결과 눈에 띄게 높은 값을 보이는 c-1, e-1의 경우 도 50% 미만의 수준으로 대체적으로 세포독성은 높지 않았다.
이상의 결과들로 봤을 때, 적은 양으로도 melanin 생성 저해 효과가 높고, 세포독성 도 적은 b-3, c-3, c-1 sample에 대해서는 미백제로의 개발 가능성에 대하여 차후 in vivo 실험등을 통한 미백효과에 대한 검증이 더 필요할 것으로 보여진다.
이상의 결과들로서, Streptomyces sp. JR1의 이차대사물질들에서 항생제, 항산화제, 미백제로의 유용성분의 연구 및 개발 가능성을 보여주는 기초 자료로 이용될 수 있다 고 사료된다.
V. 참고문헌
1. 특별논단 : 방선균 유래 항생․항암 물질 생합성 연구의 최근 연구동향 - 명지대학 교 생명과학부, 현창구․홍순광( (주)아트만바이오사이언스 ). Life Science &
Biotechnology.
2. Moustafa Y. El-Naggar Maha A. Hassan and Wafa Y. Said. 2001., Isolation and characterisation of an antimicrobial substance produced by Streptomyces violatus., Egyptial Jaurnal of Biology. vol. 3. p11-21.
3. Maha A. Hassan Moustafa Y. El-Naggar and Wafa Y. Said. 2001., Physiological factors affecting the production of an antimicrobial substance by Streptomyces violatus in batch cultures., Egyptial Jaurnal of Biology. vol. 3. p of Antimicrobial Activity from the Marin-Derived Fungus)., Kor. J. pharmacogn., 34(2) : 142～144
10. 김창진. 1997., 특집 : 산업적 유용미생물(IV) - 산업적 유용 방선균의 분리 및 분 류., 생물산업 vol. 10, No.2 : 34-43
11. 김기은 ․ 조문구, 1994, 한국 근해 연안저토에서 분리한 해양 방선균이 생성하는
색소의 분리., Kor. J. Biotechnol. Bioeng. Vol.9. No.5 : 464-468
12. 문성훈․하상철․이동선․김종국․홍순덕., 1995. Angiotensin Converting Enzyme(ACE) 저해제를 생성하는 방선균 분리주의 동정 및 최적 발효조건., Kor. J.
Appl. Microbiol. Biotechnol., vol.23. No.4 : 439-445
13. 김창진․이강현․아끼라 시마즈․유익동., 1994., 다수 배지의 사용에 따른 방선균
13. 김창진․이강현․아끼라 시마즈․유익동., 1994., 다수 배지의 사용에 따른 방선균