1) 세포 생존율 및 산화스트레스로부터 세포 보호 효과
산딸나무 열매 추출물을 HepG2 세포에 단독으로 처리하였을 때 생존율에 미치 는 영향은 25, 50, 100, 200, 400 µg/mL 농도에서 모든 추출물 처리군이 85% 이 상의 생존율을 보였다(Fig. 7). 따라서 TBHP에 의하여 산화스트레스가 유도된 HepG2 세포의 보호 효과를 확인하기 위해서 추출물은 20 µg/mL 농도 이하로 처 리하였다(Table 12). 100 µM TBHP를 단독으로 처리하였을 때 세포 생존율은 20.90%로 무처리군에 비하여 유의적인 세포독성을 나타내었다. 산딸나무 열매 에 탄올 농도별 추출물은 5~20 µg/mL 범위 내에서 농도 의존적으로 세포 생존율이 증대하였다. 5 µg/mL 농도에서는 40, 60% 에탄올 추출물 처리군을 제외한 다른 추출물 처리군은 TBHP 단독 처리군과 비교하였을 때 세포 생존율의 유의적인 차이는 보이지 않았다. 따라서 40, 60% 에탄올 추출물 처리군에서 단독으로 세포 보호 효과를 보였다. 10 µg/mL 농도에서는 모든 추출물에서 세포 보호효과를 나 타냈으며 그 중 40, 60% 에탄올 추출물에서의 세포 생존율은 각각 63.97, 68.20%
로 가장 높은 보호 효과를 보였다. 20 µg/mL 농도에서 60% 에탄올 추출물의 세 포 생존율은 84.60%로 모든 추출물 중 가장 높은 보호 효과를 나타내었다. 따라 서 5~20 µg/mL 농도범위에서 세포 생존율이 가장 높은 60% 에탄올 추출물이 TBHP에 의해 유도된 산화 스트레스로부터 가장 우수한 세포 보호 효과를 가지 는 것으로 사료된다.
Fig. 7. HepG2 cell viability of the Cornus kousa fruit extracted in different ethanol concentrations.
Table 12. Hepatoprotective effect on TBHP-induced cytotoxicity of the Cornus kousa fruit extracted in different ethanol concentrations.
Extracts
Concentration(µg/mL)
Control TBHP 5 10 20
Distilled water
100.62 ± 3.65 a
20.90 ± 0.70 d 16.96 ± 3.34 dC 44.41 ± 4.67 cD 59.44 ± 2.02 bD 20% EtOH 20.90 ± 0.70 d 24.97 ± 1.74 dB 55.45 ± 1.52 cBC 78.36 ± 2.78 bB 40% EtOH 20.90 ± 0.70 e 33.00 ± 4.88 dA 63.97 ± 2.77 cAB 70.07 ± 3.27 bC 60% EtOH 20.90 ± 0.70 e 31.34 ± 3.55 dA 68.20 ± 5.21 cA 84.60 ± 3.08 bA 80% EtOH 20.90 ± 0.70 d 17.06 ± 1.13 dC 41.25 ± 4.32 cD 69.53 ± 1.53 bC 100% EtOH 20.90 ± 0.70 d 22.31 ± 1.74 dBC 46.24 ± 9.18 cCD 73.98 ± 4.28 bBC
Means with varying letters (a-e) in the same row are significantly different by Duncan multiple range test (p < 0.05).
Means with varying letters (A-D) in the same column are significantly different by Duncan multiple range test (p < 0.05).
2) 세포 내 활성산소종(ROS) 생성 억제능
체내에서 ROS가 증가하게 되면 세포와 조직에 산화스트레스를 유발하여
손상을 가한다. 따라서 ROS가 노화, 염증, 당뇨 등의 만성질환에 직접적으로 영향을 미치기 때문에 세포내 대사에서 ROS의 조절작용이 필요하다(Tak et al., 2014). 비극성인 2’,7’-dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA)는 세포막을 통과 하여 세포내로 들어가게 되면 세포 내 존재하는 esterase 효소가 작용하여 2’,7’-dichlorodihydrofluorescin (DCFH)로 분해되며 DCFH는 TBHP에 의해 생성된 ROS와 반응함으로써 형광을 띄는 2’,7’-dichlorofluorescein (DCF)로 전환된다 (Jeong et al., 2016). 따라서 ROS 생성량이 많은 경우에 형광값이 증가하게 되므 로 ROS를 억제하는 물질과 반응할 때 감소하는 형광값을 토대로 ROS 생성 억제 능을 측정하였다. 무처리군의 ROS량을 1로 설정하였을 때 TBHP 단독 처리군의 ROS량은 4.83배 증가하였다(Table 13). 산딸나무 열매 추출물은 모든 추출물에서 농도 의존적으로 ROS 생성을 억제하는 것으로 확인되었다. 또한 5, 10 µg/mL 농 도에서 ROS 생성 억제능은 60% 에탄올 추출물이 다른 추출물들에 비해 가장 우 수한 활성을 보였으며 20 µg/mL 농도에서는 40~80% 에탄올 추출물이 가장 우수 한 활성을 보였다. 결론적으로 산딸나무 열매 추출물은 HepG2 세포내에서 TBHP 처리에 의한 ROS 생성량을 효과적으로 억제하는 것이 확인되었다.
Table 13. Intracellular reactive oxygen species (ROS) scavenging activity of the Cornus kousa fruit extracted in different ethanol concentrations.
Extracts
Concentration(µg/mL)
Control TBHP 5 10 20
Distilled water
1.00 ± 0.02 a 4.83 ± 0.03 e
3.79 ± 0.36 dC 3.44 ± 0.16 cE 2.41 ± 0.04 bB
20% EtOH 3.62 ± 0.39 dBC 3.08 ± 0.03 cD 2.26 ± 0.36 bB
40% EtOH 3.10 ± 0.13 dAB 2.51 ± 0.08 cB 1.89 ± 0.13 bA
60% EtOH 2.96 ± 0.18 dA 2.23 ± 0.04 cA 1.66 ± 0.07 bA
80% EtOH 3.54 ± 0.17 dBC 2.48 ± 0.01 cB 1.73 ± 0.08 bA
100% EtOH 3.53 ± 0.38 dBC 2.91 ± 0.04 cC 2.52 ± 0.15 bB
Means with varying letters (a-e) in the same row are significantly different by Duncan multiple range test (p < 0.05).
Means with varying letters (A-E) in the same column are significantly different by Duncan multiple range test (p < 0.05).