가. 세포생존율
동백잎과 꽃의 70% 에탄올 추출물이 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 미치 는 영향을 알아보기 위해 1 - 1,000 μg/㎖까지 다양한 농도로 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과 그림 4에서 보는 바와 같이 추출물의 처리 농도가 증가 할수록 농도 의존 적으로 세포 독성이 증가하는 것을 관찰하였다. 동백잎 추출물의 경우 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 및 1,000 μg/㎖ 동백잎 추출물의 농도에서 각각 100.00 ± 2.59%, 100.82 ± 0.52%, 101.77 ± 0.63%, 101.72 ± 0.88%, 100.89 ± 0.02%, 91.46 ± 4.34%, 94.19 ± 0.68%, 81.92 ± 2.35%, 66.77 ± 0.52% 및 50.62 ± 5.12%의 RAW 264.7 대식세 포의 생존율을 나타나 100 μg/㎖ 이상의 동백잎 추출물 농도에서 부터는 농도 의존적 으로 약한 세포독성이 있는 것으로 확인되었다. 동백꽃 추출물에서는 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 및 1,000 μg/㎖ 동백꽃 추출물의 농도에서 각각 100.00 ± 1.24%, 99.47 ± 0.78%, 98.87 ± 1.48%, 98.08 ± 0.78%, 95.90 ± 0.12%, 89.05 ± 6.40%, 88.53 ± 1.52%, 88.18 ± 0.49%, 78.24 ± 3.90% 및 50.60 ± 4.24%로 나타나 추출물의 농도가 증 가함에 따라 유의적으로 세포생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 동백잎 과 꽃의 70% 에탄올 추출물의 경우 100 μg/㎖ 농도 이상의 고농도에서는 세포독성이 있어 90% 이하의 세포 생존율이 확인됨으로 이에 다음 실험에 적용할 동백잎 및 꽃 추출물 시료의 농도는 생존율이 88% 이상이 되는 1, 5, 10, 20, 50 및 100 μg/㎖ 농도 를 적용하였다.
Fig 4. Effects of camellia extracts on cell viability in RAW 264.7 cells. The cells were treated with the indicated concentrations 0 to 1000 ug/mL extracts for 24h.
Cell viability was evaluated using a colorimetric assay based on MTT assay.
Values represent means ± SD (n=3). Means in the same column are significantly different each other as determined by ANOVA and Turkey’s multiple range test (*p < 0.05).
나. NO 저해 효과
최근 자외선과 같은 외부 환경요인에 의해 과다 생성되어 과색소 생성 및 염증 유발 에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO생성에 대한 동백 시료의 효과를 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포에 LPS로 자극을 주고 세포 독성이 없는 농도의 동백잎과 꽃 추출물 시료를 각각 처리하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO 생성량을 확인하였다.
추출물 시료는 1 - 100 μg/㎖의 농도로 처리하였으며 대조군으로는 동백잎과 꽃 추출 물 대신 PBS를 사용하여 LPS를 처리한 control과 추출물 시료 및 LPS를 처리하지 않 은 blank를 사용하였다. 그림 5에서 보는 바와 같이 LPS를 처리한 control은 NO 생성 량은 동백잎과 꽃 추출물에서 각각 5.02 ± 0.02, 5.34 ± 0.09μM로 나타났으며 LPS를 처리하지 않은 blank는 NO의 생성량이 각각 0.08 ± 0.03, 0.04 ± 0.01μM로 상대적으로 매우 낮게 나타났다. LPS에 의해 염증 반응이 유도된 마우스 대식세포에 동백잎 추출 물 시료를 농도별로 1, 5, 10, 20, 50 및 100 μg/㎖로 처리한 결과 각각 5.02 ± 0.02, 3.37 ± 0.12, 2.72 ± 0.14, 2.66 ± 0.17, 2.55 ± 0.15, 2.09 ± 0.14, 1.42 ± 0.12μM로 NO 생성량이 농도 의존적으로 감소하였으며 동백꽃 추출물 시료에서는 동일한 농도별로 처리한 결과 각각 5.34 ± 0.09, 4.64 ± 0.14, 4.25 ± 0.09, 3.77 ± 0.06, 3.49 ± 0.09, 2.04
± 0.19, 1.51 ± 0.05μM까지 NO 생성량이 감소하였다. 동백잎과 꽃 추출물 70% 에탄올 추출물을 처리한 경우 NO 생성량은 LPS를 처리한 경우와 비교하여 두 추출물 모두 농도 의존적으로 유의적인 감소 경향을 확인할 수 있었다. 특히, 동백잎 추출물에서는 1 μg/㎖의 농도로 처리한 이후부터 LPS를 단독처리한 경우와 비교 33% 이상 50 μg/
㎖의 농도 이상에서는 59% 이상의 NO 생성량 감소를 확인할 수 있었으며 동백꽃 추 출물에서는 20 μg/㎖의 농도까지는 35%, 50 μg/㎖ 이상의 농도에서는 62% 이상의 NO 생성량 감소를 확인할 수 있었다. 100 μg/㎖의 농도에서는 동백잎과 꽃 추출물에 서 동일하게 72%의 매우 우수한 NO 생성량 감소를 확인할 수 있었다.
Figure 5. Inhibitory effects of Camellia japonica L ethanolic extracts on NO production in LPS stimulated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were treated with or without LPS (200 ng/㎖) and then with extract and incubated for 24 h. The culture media of the treated cells were used to measure NO level. Values are mean
± SD of triplicate determinations. Means in the same column are significantly different each other as determined by ANOVA and Turkey’s multiple range test (*p < 0.05).