고찰 - 담배연기 추출물에 의한 황색포도상구균 분비 단백체 연구

본 연구에서는 황색포도상구균이 담배연기 추출물에 직접 노출되었을 때 세포 외부로 분비하는 분비 단백체의 구성이 어떻게 달라지는지 단백체 분석을 통해 비교하였다. 정상대조군과 천식환자의 비강에서 분리한 황색포도상구균에 담배추출물을 각각 노출시켰을 때 Spls, LeukotoxinD, CHIPs, Lipase, α-hemolysin, Iron-regulated surface determinant proteins등이 공통적으로 유의미하게 증가하였다. 이 단백질 들은 포도상구균이 숙주에 감염되는 단계에서 필요하여 활성 또는 분비가 증가하는 단백질로, 대부분 병원성 단백질로도 분류된다.³¹ 또한 기본 배양 상태에서부터 대조군 보다 환자군에서 분리한 포도상구균의 단백체에 더 많은 병원성 단백질들이 의미 있게 증가되어 있었다. 특이한 점은 유의미한 차이를 보이는 단백 물질 중 spls의 차이가 두드러져 아직 생물학적 기전이 잘 알려져 있지는 않지만 중요한 역할을 할 가능성이 있다고 생각된다.

기존 연구들에 의하면 흡연자의 천식 중증도 지표가 비흡연자 보다 높게 관찰되어 흡연이 천식의 중요한 위험인자로 여겨지고 있으며, 특정 천식 유형에 있어서는 천식의 발생에도 관여할 것으로 생각된다.³² 또 흡연력이 있거나 흡연중인 천식환자가 비흡연자 천식 환자에 비해 SE-IgE 감작이 더 빈번하게 관찰된다.³³ 이 같은 현상은 담배연기가 기도 상피세포의 결합을 파괴하여 포도상구균의 군집 형성을 증가시키고 상피하층으로 SEs을 침투시키기 쉽게 만들기 때문이라고 생각된다. 이와 같이 담배연기가 숙주의 환경을 변화시켜 질병의 중증도를 높이는 것에 대한 연구가 일부 이루어져

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있는 반면 황색포도상구균이 직접적으로 담배연기추출물에 노출되었을 때 균이 일으키는 변화에 대한 연구는 주로 유전자 레벨에서의 연구로 단백체 연구는 찾기 어렵다. 또한 황색포도상구균은 상재균 이자 기회감염균의 특성이 있어 건강한 대조군에서 분리한 균과 중증 천식환자에서 분리한 균은 이미 숙주와의 상호작용으로 인해 단백체의 구성에 변화가 나타날 수 있다고 예상된다.

기존 담배연기와 균의 상호작용에 관한 연구들 에서는 담배연기추출물에 의한 생존율이나 성장 저해능 또는 표면 전하와 부착력 변화 같은 물리적 특성을 서술하거나²⁰ 유전자 레벨에서 독성 유전자의 증가,³⁴ 정족수감지에 의한 조절유전자의 변화를 관찰하였다.²¹ 그러나 본 연구에서는 담배연기에 의해 직접적으로 황색포도상구균이 분비하는 단백체에 어떤 차이가 있는지 단백질 레벨에서 비교 분석하였고 Spls와 같이 질병에서의 중요성이 인식되나 생물학적 기전이 잘 알려지지 않은 새로운 단백질의 의미 있는 변화를 관찰하였다.

또 흥미로운 점은 담배연기에 의해 변화한 단백질 구성 외에 기본 배양 상태에서의 정상 대조군과 환자군에서 분리한 균의 분비 단백체 에서도 차이가 나타난 것인데, 환자군에서 분리한 균주 들이 정상 대조군에 비해 개인차가 크고 독성단백질도 더 다양하게 분비하고 있다. 그리고 담배연기에 의해서는 변화의 방향이 유사한데 환자군의 균주가 정상 대조군의 균주에 비해 병원성 단백질과 세포 부착에 관여하는 단백질들의 증가 폭이 더 크게 나타났다. 이는 대조군의 포도상구균도 비강에 상재 해 있지만 환자군의 포도상구균이 상대적으로 숙주 면역계와 상호작용을 더 많이 하고 있을 것이라 사료된다.

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하지만 본 연구에는 여러 제한점이 있는데 첫번째는 전체 분비단백체에서 잘 알려진 병원성 분비 물질인 SEs들이 측정되지 않은 것이다. SE는 매우 적은 양으로도 림프구에 지속적이고 큰 효과를 줄 수 있기 때문에 상대적으로 적은 양 때문에 실험적으로 검출되지 못했을 수 있다고 생각되며 모든 황색포도상구균 균주가 SE를 분비하는 것은 아니기 때문에 분비하지 않는 균주 일 가능성도 추측할 수 있다. 두번째는 단백체 분석 실험에 사용한 담배추출물의 농도 결정에 표준 균주를 사용한 것인데, 사람으로부터 분리한 균주 샘플이 표준 균주와 그리고 사람 간의 차이가 이정도로 클 줄 예상치 못한 것에 기인한다. 단백체 분석 실험에 일괄적인 10%의 담배연기추출물을 사용한 결과 일부 샘플에서 제대로 성장하지 못하는 경우가 있었고 이는 분석에서 제외시킬 수밖에 없었다. 세번째는 측정 레벨 이하의 또는 특정 상황에서 유도되는 단백질의 경우 기본 상태 abundance값이 0으로 나타나는 부분을 담배연기추출물에 의한 변화를 fold change로 나타내기 위해 매우 작은 특정 값(0.5)으로 치환하여 계산했다. 따라서 유도되는 단백질의 경우 FC 값이 고평가 되는 경향이 있으며 FC값 자체를 양적인 의미로 비교, 해석하는 데에는 주의를 기울여야한다.

본 연구는 담배연기 추출물이 황색포도상구균과 접촉하여 병원성 단백질의 분비를 촉진하는 결과를 관찰하였고 건강 대조군의 균주보다 중증 천식 환자 의 균주에서 더 다양하고 많은 병원성 단백질이 증가하는 경향을 보이는 것으 로 나타났다. 담배연기추출물에 의해 증가한 병원성 단백질들은 숙주세포에 부착하거나 침투할 때 주로 필요한 단백질 들인 것으로 분석되었고 전체적으 로는 기존 유전체 연구에서의 결과들과 일맥상통하면서도 새롭게는 세균의 기 능적 차이가 질병 발생과 관련될 가능성을 시사하였다. 또 두드러진 증가를

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보이는 단백 물질 중 알레르기 질환과의 임상적 관련성과 병인론적 기전이 비 교적 잘 알려진 Spls가 포함되어 있으며 그중 splD는 최근 직접적인 알레르기 염증 촉진 효과를 나타낼 수 있음이 알려져 있다. 본 실험에서 흡연하는 천식 환자군 에서만 담배 추출물에 의해 유의한 증가가 관찰되었고 다른 타입의 Spls들도 천식환자군에서 증가하거나 담배추출물에 의해 증가하는 경향을 보 였다. 이 같은 결과로 볼 때 흡연 자극이 Spls과 같은 알레르기 염증 촉진 단 백 물질 분비를 직접 증가시킬 수 있을 것으로 생각되며 나아가 이전 역학 연 구들에서 흡연력 있는 천식 환자의 SE-IgE가 높게 관찰되었던 현상을 설명할 근거가 된다. 또한 황색포도상구균의 담배연기와의 직접 상호작용이 흡연 연 관 천식의 중증도 기전과 천식의 임상 결과 해석에 기여할 것으로 생각된다.

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영문 요약

Staphylococcus aureus

(SA) colonization is positively associated with prevalence or severity of chronic allergic diseases. SA can drive type 2 inflammation by producing staphylococcal enterotoxins (SEs) and serine protease-like proteins (Spls); but these toxins and proteins may also act like allergens in patients with specific IgE. Interestingly, SE-specific IgE levels are significantly higher in more severe asthmatic patients with smoking history than mild asthmatics without smoking history.

We hypothesize that cigarette smoke exposure may directly interact with SA and increase the release of pro-allergic proteins. This study examined differences in SA secretome profiles before and after cigarette smoke extract (CSE) stimulation

in vitro

, using proteomic analyses.

We isolated SA in the nasal swabs obtained from 12 non-asthmatic controls and 14 asthmatic patients. SA was cultured

in vitro

for 3 or 10 hours, with or without CSE stimulation. Culture supernatants were analyzed for SA secretome using high resolution LC-MS/MS system Label-free MS1 quantification (Proteome Discoverer 2.2).

A total of 487 S. aureus proteins were identified. Principal component analyses showed that secretome profiles were distinct between patients and controls, but also markedly different according to CSE stimulation. Secreted SA proteins were up-regulated by CSE treatments (defined by p value < 0.05 and > 2-fold change) and belonged to different domains, including structure, metabolism, or virulence

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