mGluR7K889R 에 myctag을 달아서 myc-mGluR7,myc-mGluR7K889R 을 제작하였고, SUMO-1과 SUMO-2/3에 HA tag을 달아서
나누어지는데 어떤 종류의 수모 단백질에 의해 mGluR7수용체의 수모화 반응이 일어나는지에 대해 조사하기 위해서, mGluR7을 과발현시킨 HEK293T 세포를 면역침강법과 웨스턴 블로팅을 수행하여 조사하였다.
실험을 통해 확인해본 결과,mGluR7 수용체의 수모화 반응이 SUMO-1 과 SUMO-2/3단백질에 의해 일어나는 것을 확인하였다(그림 2,3).
그림.2.mGluR7 수용체를 과발현시킨 HEK293T 세포에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응은 mGluR7-말단의 라이신 889잔기에서 일어남.
HEK293T 세포에 myc-mGluR7,myc-mGluR7K889R (수모화 반응이 일 어나는 라이신잔기가 결핍된 돌연변이), myc-GluR6, HA-SUMO-2/3, Ubc9을 같이 형질주입 시켰다.1% TX,0.1% SDS TNE 버퍼로 용해 하여 4℃에서 30분 동안 incubation 한 후 4℃를 유지하여 16,000g 로 15분 동안 원심분리하였다.그리고 myc항체로 면역침강 방법을 수행하 여 HA 항체로 웨스턴 블로팅을 수행하여 mGluR7수용체가 수모화 반응 이 일어나는지 여부를 확인하였다.
그림.3.mGluR7 수용체를 과발현시킨 HEK293T 세포에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응은 SUMO-1과 SUMO-2/3에 의해 일어남.
SUMO-1,SUMO-2/3 단백질에 의한 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 일어나는지를 조사하기 위해서 HEK293T 세포에 myc-mGluR7, myc-mGluR7K889R,HA-SUMO-1,HA-SUMO-2/3,Ubc9을 같이 형질 주입 시켰다.1% TX,0.1% SDS TNE 버퍼로 용해하여 4℃에서 30분 동안 incubation한 후 4℃를 유지하여 16,000g로 15분동안 원심분리하 였다.그리고 myc항체로 면역침강 방법을 수행하여 HA 항체로 웨스턴 블로팅을 수행하여 mGluR7 수용체가 수모화 반응이 일어나는지 여부를 확인하였다.
B.SENP-1에 의한 mGluR7수용체의 수모화 반응 억제
수모화 반응이 일어나는데 필요한 수모 단백질은 새로 합성을 하거나 수모화되어 있는 수모 단백질을 기질 단백질로부터 가져와야 한다.기질 단백질로부터 수모를 가져오기 위해서,수모 단백질과 기질 단백질 사이 의 isopeptide결합을 절단해야 하는데 이 때 SENP라는 절단효소가 필요 하다.mGluR7 수용체의 수모화 반응이 일어나는지 재확인 하기 위해서, 절단효소인 SENP로 인해 탈수모화 (deSUMOylation)반응이 일어나는지 조사했다. HEK293T 세포에 수모화 반응이 일어날 수 있도록 mGluR7을 형질주입하고 또한,SENP을 함께 형질주입하여 수모화된 mGluR7 수용 체가 SENP에 의해 탈수모화 반응이 일어나는지를 관찰하였다.그 결과, 절단효소인 SENP에 의해 mGluR7 수용체가 탈수모화 반응이 일어나는 것을 관찰하였다.또한,SENP가 절단효소의 역할을 할 수 없도록 클로닝 하여 제작한 catalyticinactivedomain (SENPC603S)돌연변이를 제작하 여 확인했을 때,SENP에 의한 mGluR7 수용체의 탈수모화 반응과 비교 하여 SENPC603S에 의한 mGluR7 수용체의 탈수모화 반응이 억제 되는 것을 확인하였다.그림 4의 실험을 통해,mGluR7 수용체의 수모화 반응 이 일어나는 것을 명확히 확인하였다.
그림.4.mGluR7 수용체를 과발현시킨 HEK293T 세포에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 SENP-1에 의해 감소됨.
mGluR7수용체의 수모화 반응이 SENP (SUMO-specificprotease)에 의 해서 감소되는지 여부를 조사하기 위하여 HEK293T 세포에 myc-mGluR7, myc-mGluR7K889R, HA-SUMO-2/3, Ubc9, FLAG-SENP1,FLAG-SENPC603S (catalytic inactive domain)를 같이 형질주입 시켰다.1% TX,0.1% SDS TNE 버퍼로 용해하여 4℃에서 30분동안 incubation한 후 4℃를 유지하여 16,000g로 15분동안 원심분 리하였다.그리고 myc항체로 면역침강 방법을 수행하여 HA 항체로 웨 스턴 블로팅을 수행하여 mGluR7수용체가 수모화 반응이 일어나는지 여 부를 확인하였다.
C.대뇌조직에서 일어나는 mGluR7수용체의 수모화 반응
mGluR7 수용체가 과발현된 HEK293T 세포에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 mGluR7C-말단의 라이신 889잔기에서 일어나는 것을 확 인하였으므로,mGluR7 수용체의 trafficking이 수모화 반응에 의해 조절 되는 가능성을 확인하는 실험을 진행하였다.먼저,mGluR7 수용체가 과 발현시킨 조건이 아닌 신경세포에서 endogenousmGluR7수용체가 수모 화 반응이 일어나는지 조사하기 위해 쥐의 대뇌를 추출하여 1% TX,0.1
% SDS TNE버퍼로 대뇌조직을 용해하여 용해액을 얻었다.그 후 용해액 을 이용하여 면역침강법과 웨스턴블로팅을 통하여 확인해본 결과,대뇌조 직에서도 mGluR7수용체의 수모화 반응이 일어난다는 것을 확인 하였다 (그림 5).또한,cysteineisopeptidaseinhibitor로써 SENP의 역할을 억제 하는 물질인 NEM을 lysisbuffer에 첨가하여 면역침강법과 웨스턴블로팅 수행하였다.그 결과,NEM이 첨가된 용해버퍼로 용해했을때 mGluR7수 용체의 수모화 반응이 확인되었지만 NEM이 첨가되지 않은 용해버퍼로 용해했을때에는 mGluR7 수용체의 수모화 반응이 확인되지 않았다.
mGluR7수용체의 수모화 반응은 NEM이 있을 때 일어나는 것을 확인할 수 있었다(그림 5B).
그림.5.대뇌조직에서 mGluR7수용체의 수모화 반응은 NEM이 존재 할 때 일어남.
쥐에서 얻은 대뇌조직을 1% TX,0.1% SDS TNE 버퍼를 이용하여 용 해하여 4℃에 30분동안 incubation 한 후 4℃를 유지하여 16,000g 로 15 분동안 원심분리하였다.용해액을 얻어 mGluR7항체로 면역침강법을 수 행하여 SUMO-1,SUMO-2/3 항체로 웨스턴블로팅하였다 (A).20uM NEM이 첨가된 1% TX,0.1% SDS TNE로 용해하여 얻은 용해액을 SUMO-1항체로 면역침강법을 수행하여 mGluR7항체로 웨스턴 블로팅 하였다 (B,C).
D.L-AP4에 의해 유도되는 mGluR7수용체의 탈수모화 반응
쥐의 대뇌에서 mGluR7수용체의 수모화 반응이 일어나는 것을 확인 하였기 때문에,mGluR7 수용체의 수모화 반응의 역할을 조사하기 위해 연구를 진행하였다.mGluR7수용체의 traffcking을 조절하는 기작을 확인 하기 위해 쥐에서 얻은 신경세포에 mGluR7 수용체의 agonist인 L-AP4 를 처리한 후 면역침강법과 웨스턴 블로팅을 수행하여 mGluR7수용체의 수모화 반응을 관찰하였다.그 결과,신경세포에 400uM L-AP4를 처리 하였을 때 mGluR7수용체의 탈수모화 반응이 일어나는 것을 확인하였다 (그림 6). 또한 mGluR7 수용체의 trafficking에 조절하는 탈인산화 (dephosphorylation)반응을 mGluR7수용체의 수모화 반응과 같이 관찰하 였을때,탈수모화 반응이 탈인산화 반응과 같이 일어나는 것을 발견하였 다. 또한, 이전 보고에 의하면 mGluR7 수용체의 탈인산화 반응은 mGluR7 수용체를 세포내로 유입시킨다고 보고되어 (Suh 등, 2008), mGluR7수용체의 수모화 반응과 인산화 반응이 같이 일어나 mGluR7수 용체의 trafficking을 조절할 것이라고 추측하였다.
그림.6.신경세포에서 mGluR7 수용체의 수모화 반응은 L-AP4 에 의해 감소됨.
쥐에서 얻은 신경세포에 400uM L-AP4를 15분 동안 처리한 후 1X PBS 로 세척하여 실험을 수행하였다.1% TX,0.1% SDS TNE 버퍼를 이용 해 용해하여 4℃에 30분동안 incubation 한 후 4℃를 유지하여 16,000 g 로 15분동안 원심분리하였다.용해액을 얻어 mGluR7항체로 면역침강법 을 수행하여 SUMO-1,SUMO-2/3,mGluR7-S862,mGluR7항체로 웨스 턴 블로팅하였다 (A).(B,C)그래프는 Graghpad프로그램을 사용하여 나
타내었다.means± SEM;***p<0.001,n.sindicated notsignificant.(D) 용해액을 얻어 SUMO-1 항체로 면역침강법을 수행하여 mGluR7 항체로 웨스턴 블로팅하였다.
E.mGluR7수용체의 탈수모화 반응에 의한 trafficking 조절
mGluR7수용체는 L-AP4에 의하여 탈수모화 반응이 일어나는데,탈수 모화 반응이 mGluR7수용체를 세포내로 유입시키는지 확인하였다.먼저 mGluR7,mGluR7K889R를 과발현시킨 신경세포에 L-AP4를 처리한 후 internalization assay를 수행하여 공초점 형광현미경으로 관찰하였다.그 결과,mGluR7수용체가 과발현된 신경세포는 L-AP4에 의해 탈수모화 반 응이 일어나 mGluR7수용체가 세포내로 유입되는 양이 증가하였음을 확 인하였다 (그림 7).또한,mGluR7K889R 수용체가 과발현된 신경세포에서 도 세포내로 유입되는 mGluR7수용체의 양이 증가하는 것을 관찰하였다 (그림 7).이러한 결과로 보아 mGluR7수용체의 trafficking이 수모화 반 응에 의해 조절되는 것을 확인할수 있다.
그림.7.신경세포에서 mGluR7 수용체가 mGluR7의 수용체의 탈수모 화 반응에 의해 세포내로 유입되는 양이 증가함.
쥐에서 얻은 신경세포에 mGluR7을 과발현 시킨 후 endocytosis를 측정 할수 있는 internalizationassay를 수행하였다.뉴런세포는 400uM L-AP4 를 15분 동안 처리한조건,mGluR7-K889R를 과발현 시킨 조건 등,각각 의 조건에서 mGluR7수용체를 염색한 후 공초점 형광현미경(LSM 510)을 이용하여 실험하였다.red(빨강)는 신경세포의 표면에 있는 mGluR7수용 체를 나타내고,green(녹색)은 뉴런세포의 표면에서 세포안으로 유입된 mGluR7수용체를 나타낸다.
F.mGluR7수용체의 인산화 반응과 수모화 반응
그림 6에서 확인한 바에 의하면 L-AP4에 의해 mGluR7수용체가 탈수 모화 반응과 탈인산화 반응이 같이 일어나는 것을 확인하였다. mGluR7 의 탈수모화 반응과 탈인산화 반응의 연관성이 있다는 것을 예측하였다.
mGluR7 수용체의 탈수모화 반응과 탈인산화 반응의 연관성을 확인하기 위해, HEK293T 세포에 mGluR7수용체를 과발현 시킨 후,인산화 반응 의 활성자인 PMA를 처리하여 면역침강법과 웨스턴 블로팅 실험을 통해 mGluR7 수용체에서 발생하는 수모화 반응의 변화를 관찰하였다 (그림 8).그 결과,PMA를 처리하여 인산화 반응을 유도하면 mGluR7수용체의 수모화 반응이 증가 하는 것을 발견하였다.
그림.8.mGluR7 수용체를 과발현시킨 HEK293T 세포에서 mGluR7 수용체가 PMA에 의해 증가함
그림.8.mGluR7 수용체를 과발현시킨 HEK293T 세포에서 mGluR7 수용체가 PMA에 의해 증가함