2주. 배지의 제조
[1] 배지 제조법
1. 배지(culture medium)란?
미생물이 필요로 하는 각종 영양소를 골고루 함유하는 물질.
미생물의 영양소에는 탄소원, 질소원, 비타민류, 무기염 등이 있다.
미생물의 종류와 성질에 따라 사용하는 배지의 조성은 각각 다르다.
곰팡이와 효모용 배지는 pH 5.0∼6.0, 세균용 배지는 pH 7.0∼8.0으로 조절하는 것이 좋다. 배지의 pH가 최적 pH에서 지나치게 벗어나면 미생물의 생육은 거의 중지된다.
조제된 배지는 건조나 변질을 막기 위하여 항상 빛이 들지 않는 찬 곳에 보존한다.
미생물은 생리적 성질과 이용 목적에 알맞은 조건에서 배양하여야 한다.
2. 배지의 종류
(1) 성분종류에 따른 분류
천연배지: 천연물질로 만든 배지로 미생물의 증식, 분리, 배양에 사용 Ex) 국즙(koji extract), 맥아즙: 효모나 곰팡이
감자배지: 곰팡이 육즙(meat extract): 세균증식용 배지
합성배지: 화학적 성분이 분명한 순수한 물질로 제조한 최소영양배지로 최소영양배지로 미생물의 생화학적 성상, 균체성분, 대사 및 유전 등에 사용
(2) 물리적 성상에 따른 분류
액체배지(liquid medium, broth): agar를 첨가하지 않은 배지로 미생물의 증식, 당분해, 생화학적 성상, 대사산물 검출 등에 사용
배양도중에 pH 변화나 교반이 필요한 경우.
미생물의 대량 배양, 생리 화학적 연구에 이용.
Ex) Nutrient broth
고체배지(solid medium): 고형화를 위해 agar를 첨가한 배지로 집락의 형태관찰, 순수분리, 장기보관 등에 사용
액체배지에 한천, 젤라틴 등을 첨가하여 제조한 것.
미생물의 순수분리, 보존, 배양 등에 이용.
종류로는 평판배지, 고층배지, 사면 배지 등이 있다.
Ex) Nutrient agar
* 멸균 후 냉각, 고화시킬 때 목적에 따라 사면배지, 고층배지, 평판배지 등으로 만든다.
▶평판배지: colony 를 형성시켜 미생물을 순수 분리할 때 사용
▶사면배지: 호기성세균의 배양 및 보존에 사용
▶고층배지: 젖산균 등의 혐기성균의 배양에 사용
평판배지(plate medium): Petri dish에 4 mm (15-20 mL) 두께로 굳힌 것으로 미생물 분 리, 배양, 집락관찰, 용혈능 및 항생제 감수성 검사 등
사면배지(slant medium): 시험관에 고체배지를 30°경사로 굳힌 것으로 호기성 미생물 증식 및 보존, 생화학 검사 등
고층배지(stab medium): 시험관에 고체배지를 수직으로 굳힌 것으로 미호기성균과 혐 기성균 배양, 균주보존, 세균 운동성 시험 등
[Fig. 1] 고체배지의 종류
반고체배지(semisolid medium): 젤리 같은 형상으로 소량(0.3-0,5%)의 agar를 첨가하여 세균의 설탕 이용성이나 운동성 관찰에 사용
(3) 사용목적에 따라
증식배지(growth medium): 여러 영양소를 적당량 함유하여 미생물 증식, 순수배양. 보존 등 일반적인 목적에 사용
증균배지(enrichment medium): 많은 균 중에서 특정 균종만을 빨리 증식시켜 분리하고자 특정 물질(증식 촉진 혹은 억제)을 첨가
선택배지(selective medium): 목적하는 미생물의 생육을 증진시키고 다른 미생물은 생육을 억제하도록 만든 배지.
감별배지(differential medium): 미생물의 생화학적 성질을 이용하여 여러 미생물이 혼재되어 있는 곳에서 목적하는 미생물을 판별 또는 확인하기 위해서 만들어진 배지로 특정 지시약 등을 배지에 첨가하여 균을 분리.Ex) 장내 세균 분별- EMB배지
3. 배지 제조법 실습 – 액체배지, 평판배지
: 실험 전 무균대(clean bench) 살균 - 70% 알코올, 자외선 등
(1) 액체배지 만드는 법
준비물: 미량 저울(balance), 비커나 삼각 플라스크, 메스실린더, 자석교반기 + magnetic bar, 테스트 튜브, 튜브마개, 호일, autoclave(고압 증기 멸균기), 무균대(clean bench), 알코올램프, 소독용 알코올
방법① 칭량: 미량 저울을 이용하여 배지재료와 증류수를 칭량– 비커나 삼각플라스크 사용
② 용해: 증류수를 일부 넣는다.
자석교반기와 마그네틱 바를 이용하여 잘 섞어준다.
자석을 이용하여 magnetic bar를 꺼낸 후 나머지 증류수를 넣는다.
③ 분주: 삼각플라스크나 테스트 튜브에 분주한다.
통기성 마개로 막고 호일로 감싸준다.
④ 멸균: autoclave에 넣고 121℃, 15min 간 살균한다.
압력이 내려가면 오토클레이브에서 꺼낸 후 70% 소독용 알코올로 표면을 살균한 뒤 무균상에 넣는다.
⑤ 실험 시 알코올램프로 입구를 살균하여 사용한다.
(2) 고체 배지 만드는 법
준비물: 액체배지용 기구와 동일+ 페트리디쉬(petri dish),
방법① 칭량 ② 용해: 증류수를 넣고 자석교반기와 마그네틱 바를 이용하여 잘 섞어준다.
③ 가열: 열을 가하여 한천을 녹인다. 자석을 이용하여 magnetic bar를 꺼낸다.
평판배지: 통기성 마개로 플라스크 입구를 막고 호일로 감싸준다.
사면배지나 고층배지: 테스트 튜브에 분주한 후 통기성 마개로 막고 호일로 감싸준다.④ 멸균: autoclave에 넣고 121℃, 15min 간 살균한다.
⑤ 멸균이 끝나면 오토클레이브에서 꺼낸 후 70% 소독용 알코올로 표면을 살균한 뒤 무균상에 넣는다.
⑥ 굳히기
평판배지: 적당히 식힌 후 호일을 벗기고 삼각플라스크 입구를 알코올램프 불꽃으로 화염살균한 후 패트리디쉬에 분주한다.배지가 적당히 굳을 때까지 패트리디쉬 뚜껑을 조금 열어 두었다가 굳으면 완전히 덮어서 보관한다.
사면배지: 테스트 튜브를 유리봉과 같은 적당한 장치로 경사지게 하여 굳힌다.
균주보존용으로 많이 사용
고층배지: 시험관대에 꽂아 반드시 세워서 굳힌다. 혐기성균의 배양에 사용.
⑦ 바로 사용하지 않을 경우 냉장 보관한다.
(3) 제조 시 주의사항
① 배지를 담을 용기는 깨끗한 것으로 준비
② 특별히 언급하지 않으면 증류수 사용
③ 상품화된 배지는 보관법, 기간, 제조법, 멸균법 등을 준수
④ 장시간 가열 또는 필요이상의 온도와 압력에서 배지성분 파괴주의
⑤ 중탕 또는 가열한 배지는 투명해야 함(필요 시 여과)
⑥ 멸균 시 거품으로 넘칠 수 있기에 용기는 두 배 용량을 선택
⑦ 시험관에 배지를 부을 때 위쪽 벽면에 묻지 않도록 주의
⑧ 시험관 입구는 멸균 시 반드시 봉함