Effects of Glycyrrhizae Radix Pharmacopuncture Intravenous Injection on Ischemia-Induced Acute Renal Failure in Rabbits
Hyeong Cheol Kim1, Gyoung Ho Kim2, Guem San Lee2, Hyung Woo Kim2, Se Hyun Lim3, Chi Yeon Lim4, Young Gyun Kim1, Su In Cho2*
1Dong-Eui University College of Oriental Medicine, Busan, Korea
2Pusan National University School of Korean Medicine, Yangsan, Korea
3Department of Nursing, Far East University College of Public Health, Eumseong, Korea
4Department of Medicine, Dongguk University College of Medicine, Seoul, Korea KEY WORDS:
Glycyrrhizae Radix;
pharmacopuncture;
ischemia; renal failure Received : Sep 4, 2011 Revised : Oct 17, 2011 Accepted : Nov 2, 2011
Abstract
Objectives:The present study was undergone to determine whether Glycyrrhizae Radix pharmacop- uncture intravenous injection exerts beneficial effect against the ischemia-induced acute renal failure in rabbits.
Methods: Rabbits were treated with Glycyrrhizae Radix pharmacopuncture via i.v., followed by renal ischemia/reperfusion. The fractional excretion of glucose and phosphate were measured and the mal- ondialdehyde content was also determined. The morphological changes of cortical part of kidney also observed with light microscope.
Results: Renal ischemia/reperfusion caused increase of the fractional excretion of glucose and phos- phate in ischemia-induced animals, which was prevented by Radix Glycyrrhizae extract treatment.
Ischemia/reperfusion increased lipid peroxidation, which was prevented and morphological changes also altered by Radix Glycyrrhizae pharmacopuncture administration.
Conclusions:These results indicate that lipid peroxidation plays a critical role in ischemia-induced acute renal failure and Glycyrrhizae Radix pharmacopuncture exerts the protective effect against acute renal failure induced by renal ischemia/reperfusion.
ⓒ2011 Korean Pharmacopuncture institute http://pharmacopuncture.co.kr
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Corresponding Author
Su In Cho, Division of Pharmacology, School of Korean Medicine, Pusan National University, Yangsan, Korea
Tel: +82-51-510-8457, Fax: +82-51-510-8420 E-mail: [email protected]
cc
김형철1, 김경호2, 이금산2, 김형우2, 임세현3, 임지연4, 김영균1, 조수인2*
1 동의대학교 한의과대학, 2 부산대학교 한의학전문대학원, 3 극동대학교 간호학과, 4 동국대학교 의과대학 의학과 Original Article
허혈로 유발된 토끼의 급성 신부전에 대한 甘草 약침액 정맥 주입의 영향
I . 서론
신부전은 허혈 및 독성 물질로 인해 나타나는 병증 중 하 나로1,2)한약 등과 같은 약물의 사용도 주요한 원인 중 하나 로 손꼽히고 있으며1), 신장 내 혈관 수축과 신혈류량 감소로
사구체 여과율이 저하되어 제 기능을 하지 못하여 체내에 질소 대사 산물 등 노폐물이 축적되고 수분이나 전해질의 불균형이 일어나는 질환이다2,3).
초기에는 메스꺼움, 식욕부진, 피로 등과 같이 자칫 지 나치기 쉬운 증상들이 대부분이어서 초기 진단이 어려우나 심해지면 부종, 호흡곤란, 경련, 혼수 등의 증상이 나타나 게 되며, 심한 경우 약물 요법으로 치료가 되지 않으며 신 장의 기능을 대신해 줄 수 있는 혈액 투석 등과 같은 요법 이 사용되는데3), 한의계에서도 침구 자극 및 약물 요법이 사용될 수 있음을 보이긴 했으나4,5)치료가 쉽지 않은 질환 의 특성으로 인해 활발한 연구와 임상 적용은 아직 부족한 실정이다.
본 연구에서 신부전은 허혈로 유발되었는데, 허혈로 인 해 신장이 손상되면 혈관 수축, 세뇨관 상피 세포의 박리, 세뇨관 내강의 폐쇄 등과 같은 구조적 문제점이 발생되고 이로 인해 세뇨관 내 사구체 여과액의 역류가 나타날 수 있 다6). 이러한 손상이 나타나는 기전에는 세뇨관에서의 세포 내 유리 칼슘의 증가로 인한 세포간 융합막 구조의 결손이 관여하며, 신장 수입 동맥을 결찰하여60분 동안 허혈을 유발시킨 후 재관류하였을 때 토끼의 경우는72시간 동안 허혈로 인한 신장의 손상이 진행하는 것으로 보고되고 있 다7,8).
신부전에 해당하는 한의학에서의 병증으로는 小便不 利·小便不通· 閉·浮腫·中毒·蓄血·虛損·關格 등 이 있으며2,5), 이의 원인으로는 腎元虧虛·肺失肅降·肝失 疏泄·脾氣不升·瘀濁內停 등이 제시되어 있다5).
본 연구의 재료로 사용된 甘草는 콩과(豆科: Legumi- nosae)에 속한 多年生 草本인 光果甘草(유럽감초, G. gla- braL.), 甘草(만주감초, Glycyrrhiza uralensis Fisch.) 및 脹果甘草(G. inflataBat.)등의 根 및 根莖을 건조한 것으로, 和中緩急 및 解毒 등의 효능이 있어 다른 약물 또 는 음식물 등의 중독 증상을 치료하는 주요한 약물로 인식 되어져 왔다9).
甘草에 관해서는 항균 활성10), 멜라닌세포의 증식 억제11), tyrosinase활성 억제 성분에 관한 연구12)등과 같은 감초 의 활성에 관한 연구 결과들이 발표된 바 있으나, 최근 특 히 감초 복용에 의한 급성 신부전 발생 사례가 보고되는 등
13)한약의 안전성에 대한 문제들이 제기되고 있다.
약침의 적용 부위는 經絡 및 經穴의 순행 및 분포 특성 상 피하, 근육 등이 일반적이나 간혹 잘 정제된 약침액의 경우 정맥 주입도 가능하지 않겠느냐는 조심스런 논의가 이루어지고 있을 뿐만 아니라, 저자 등은 선행 연구를 통해 甘草 추출물이 항산화 작용과 함께 허혈로 인한 급성 신부 전을 사구체 여과율 회복 등의 과정을 통해 효과적으로 억 제한다는 연구 결과를 보고한 바 있으며14), 이의 후속 연구
로 약침액의 투여 경로를 정맥으로 선정한 후 허혈/재관류 로 인한 신장의 손상을 억제할 수 있는가를 확인하여 그 결 과를 보고하는 바이다.
II . 재료 및 방법 1. 재료
1.1 동물
실험동물은 체중2.0㎏내외의New Zealand White 종 토끼를 대한실험동물(한국)에서 공급받아 고형사료(삼 양사료, 한국)와 물을 충분히 공급하면서2주일 이상 실험 실 환경에 적응시킨 후 사용하였다.
1.2 약재
본 연구에 사용된 약재는 본 실험에 사용된 甘草는 시중 (광문생약, 광주, 한국)에서 구입하여 정선한 후 사용하였다.
2. 방법
2.1 약침액의 조제
증류수1,000㎖에 甘草80g을30분 이상 담근 후 약탕 기(대웅, DWP-99000T,한국)로2시간 전탕하고 이를 여 과액 약500㎖를 동량의 메탄올과 배합하여 강하게 진탕 한 후 응결된 고형 물질들을 걸러내고, 여액을 감압 농축 및 동결 건조하여5.9g의 추출물을 얻었다. 정맥 주입용으 로는 이를1%농도로 생리 식염수에 녹이고pH를7.2로 조정한 후 800×g로 15분간 원심분리 한 여과액을 Whattman paper No. 1과0.45㎛및0.25㎛pore size membrane filter를 이용하여 순차적으로 여과 및 멸균하 여 사용하였다(Scheme 1).
Scheme 1. Procedure of preparing Glycyrrhizae Radix pharmacopuncture i.v. solution.
2.2 실험군의 선정 및 허혈/재관류로 인한 급성 신부전 의 유발
실험군은 정상군, 대조군 및 실험군으로 나누었으며, 정 상군은sham operation 만을 시행하였고 대조군과 실험 군은 허혈을 유도하였다. 간략히 그 과정을 기술하면 ketamin과xylazine을 각각15㎎/㎏및2.5㎎/㎏농도 로 근육 주사하여 마취를 유도하였으며 이후 각각5㎎/㎏
및1㎎/㎏농도를30분 간격으로 투여하여 마취를 유지시 켰다. 수술을 통하여 개복하고 신장 동맥을 신장 정맥으로 부터 조심스럽게 분리한 후silver clip을 이용하여1시간 동안 신장 동맥을 결찰 함으로써 허혈을 유발하였으며 이 로부터1시간 후에 결찰을 풀어 혈액을 재관류하였다. 실 험군의 경우 수술이 진행되는 동안 甘草 약침액과vehicle 을, 정상군과 대조군의 경우vehicle만을 정맥 내로 주입 하였으며vehicle은 하트만 용액을 사용하였다.
2.3 甘草 약침액의 정맥 내 주입
허혈성 신부전을 유발하기 위한 신장 동맥 결찰1시간 전부터 甘草 약침액을0.2㎖/min/㎏속도로 실험 동물의 귀 정맥을 통해 주입하였으며1시간 동안의 결찰을 통한 허혈 후 재관류를 유지시켰다. 재관류 이후4시간 동안 甘 草 약침액을 계속 주입하였으며 이후 복부를 봉합하여 대 사 케이지에서72시간 동안 실험동물을 관찰하면서 혈액 과 뇨를 채취하였다.
2.4 신장 기능의 평가
채취된 혈액 및 뇨를 이용하여glucose와 무기 phos- phate (Pi)의 배설 분율을 측정하고, 신장 피질을 절편으 로 제작하여 지질 과산화 정도를 확인하였으며, 신장 조직 을 광학현미경으로 관찰함으로써 甘草 약침액의 허혈성 신 부전 억제 효과를 평가하였다.
2.5 신장 피질에서의malondialdehyde (MDA)함량 측정
실험 동물을 희생시킨 후 신장을 들어내어 130mM NaCl, 5mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH 7.4)로 된 차 가운 용액을 신장 동맥에 주입하여 혈액을 제거하고 바깥 의 단단한 피막을 제거한 다음Stadie-Riggs microtome (Tomas Co. USA)으로 약1㎠ 넓이와 약0.3~0.5㎜
두께의 신장 피질 조직 절편을 만들었다. 이 조직 절편을 Uchiyama와 Mihara의 방법15)에 준하여 신장 조직 내 MDA함량을 측정하였다. 그 과정을 간단히 설명하면, 신
장 조직 절편을1% phosphoric acid 3㎖과0.6% thio- barbituric acid 용액1㎖을 첨가한 물에서60분간 가열 하였다. 1-Butanol 4㎖을 첨가하여 완전히 섞은 다음 800×g에서25분간 원심분리 한 후, 상층액의 흡광도를 534nm와510nm에서 측정하였다. MDA 값은 단백질1
㎎당pmoles로 표시하였으며, 단백질 농도는Bradford 의 방법16)으로 측정하였다.
2.6 신장 조직 관찰
적출된 신장의 동맥을 통하여 관류고정을 한 다음4%
paraformaldehyde에24시간 동안 재고정하였다. 신장 조직은paraffin으로 포매한 후microtome을 사용하여 5
㎛두께로 절편하였다. 절편한 조직을slide glass위에 부 착시킨 다음 통상적인 방법으로 파라핀을 제거한 후 함수 과정을 거쳤다. Periodic acid-Schiff (PAS) 염색을 한 다음 hematoxylin으로 대조 염색하고Canada balsam 으로 봉합한 후 카메라 부착 광학현미경(Olympus BX51, Japan)으로 관찰한 후 사진을 촬영하였다.
3. 통계 처리
실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인Sigma plot (Sigma plot for Windows, ver. 9.0, U.S.A.)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 결과의 차이를 검정할 때에는Student's t- test로 검정하여p-값이0.05 미만일 때 유의한 차이가 있 는 것으로 판정하였다.
III . 결과
1.Glucose 및 무기 phosphate (Pi)의 배설 분율 변화
Glucose 배설 분율은 정상군이 0.24±0.05%이었으 며, 대조군이 4.92±0.51%인데 비해 실험군이2.63±
0.31%로 대조군에 비하여 유의하게 감소되었다(Fig. 1).
Pi 배설 분율은 정상군이27.0±4.8%이었으며, 대조군 이120.3±12.2%인데 비해 실험군이92.4±8.6%로 대 조군에 비하여 유의하게 감소되었다(Fig. 2).
2.신장 피질에서 지질 과산화 변화
지질 과산화는 정상군이90.2±5.3 pmole MDA/㎎
protein이었으며, 대조군이 138.0±8.9 pmole MDA/
㎎ protein인데 비해 실험군이 110.4±5.8 pmole MDA/㎎protein로 대조군에 비하여 유의하게 감소하였 다(Fig. 3).
3.신장 조직 변화
정상군에서의 사구체 모세혈관 직경은 비교적 일정한 크기였으며, 이들 모세혈관 사이의 혈관사이세포에서는 PAS-양성 물질들이 미약하게 관찰되었다. 근위 세뇨관의 솔가장자리(brush border)에서는 PAS 양성물질들이 뚜 렷하였으나 원위 세뇨관에서는 관찰되지 않았다(Fig. 4- A). 대조군에서의 사구체는 전반적으로 응축되어서 바깥 벽(parietal layer)과 속벽(visceral layer)사이의 주머니 공간(capsular lumen)이 매우 팽창되어 있었다. 사구체 모세혈관들의 직경은 매우 다양하였으며, 혈관사이세포에 서는PAS-양성 물질들이 정상군에 비하여 다량 침착 되 어 있었다. 대부분의 세뇨관은 매우 팽창되었고, 세뇨관을 구성하는 상피세포들은 핵이 괴사되었거나 솔가장자리가 손상되어 있었으며, PAS-양성물질들이 상피세포 전반에 걸쳐 나타났다 (Fig. 4-B). 실험군에서의 신장은 사구체 모세혈관들의 직경이 다양하게 나타났으나, 대조군에 비하 여 주머니 공간의 팽창과 혈관사이세포의PAS-양성물질 의 침착은 미약하였다. 그러나 정상군에 비해서는 대부분 의 상피세포들이 손상되어 있었다(Fig. 4-C).
Fig. 1. Effect of Glycyrrhizae Radix pharmacopuncture treatment on changes in fractional glucose excre- tion (FE glucose) in ischemia/reperfusion induced acute renal failure. Data are mean±S.E. of five experiments. NOR, normal group; CON, 1 hr of renal ischemia applied group; SAM, 1 hr of renal ischemia and 1% concentration of Glycyrrhizae Radix extract treated group. *, p〈0.05.
Fig. 2. Effect of Glycyrrhizae Radix pharmacopuncture treat- ment on changes in fractional Pi excretion (FE Pi) in ischemia/reperfusion induced acute renal failure.
Data are mean±S.E. of five experiments. NOR, nor- mal group; CON, 1 hr of renal ischemia applied group;
SAM, 1 hr of renal ischemia and 1% concentration of Glycyrrhizae Radix extract treated group. *, p〈0.05.
Fig. 3. Effect of Glycyrrhizae Radix pharmacopuncture treat- ment on changes in lipid peroxidation of cortex of kid- neys in ischemia/reperfusion induced acute renal fail- ure. Data are mean±S.E. of five experiments. NOR, normal group; CON, 1 hr of renal ischemia applied group; SAM, 1 hr of renal ischemia and 1% concentra- tion of Glycyrrhizae Radix extract treated group. *, p
〈0.05.
IV . 고찰
甘草, 光果甘草 및 脹果甘草의 뿌리를 약용하는 한약재인 甘草는 甘平한 性味를 가지고 있으며, 生用하면 解毒하는 효 능으로 인해 瘡瘍腫毒과 咽喉腫痛을 치료하고, 또한 諸藥을 調和하는 效能이 있어 熱藥과 같이 사용하면 그 熱性을 緩和 하고, 寒藥과 같이 쓰면 그 寒性을 緩和하며, 補性을 急하게 이르지 않게 하고, 瀉性을 急하게 이르지 않게 하는 등 그 응 용 범위가 대단히 넓은 약재에 해당한다9). 또한 다양한 처방 에 배합되어 전통적인 경험에 의한 약재의 활용 빈도도 높을 뿐 아니라 항균, 항염 등의 작용이 우수한 것으로 알려져 있 어 최근까지 항염증 효과, 궤양성 대장염 억제 효과 등 다양 한 활성들과 이와 관련된 기전들이 검증되고 있다17,18).
甘草는 한의학 임상에서 뿐만 아니라 식품으로도 유통되 는 까닭으로 인해 민간 의학자를 포함한 일반인들도 식품의 용도가 아닌 질병의 증상 완화를 목적으로 자주 활용되고 있 으며, 전문적인 의학적 지식을 가지지 못한 사람들에 의한 오용 및 남용으로 인해 심각한 부작용들이 보고되고 있다13,19-
21).
甘草는 일반적으로 1일 복용량이2~12g정도이고 大劑 量의 경우에도15~30g내외이며, 大劑量을 사용할 경우에 도 단기간 복용에 그치고 있으나9), 甘草 복용으로 인한 부작
용 사례들을 보면 식사 대용으로 자가 조제한 식품에 감초를 배합하여 사용하여 급성 신부전과 함께 급성 심근경색 및 위 궤양 출혈이 발생한 경우가 있었는데13)이는 식사 대용으로 섭취할 목적이었기 때문에 대량 및 장기간 섭취가 문제를 야 기시킨 것으로 추측되며, 또한 이뇨제를 복용하면서 甘草를 함께 복용한 경우19,20)도 있었는데 이는 甘草의 주성분 중 하 나인 글리시리진산이 체내에서 레닌 및 알도스테론 활성을 저하시켜 부작용이 발생한 것으로 의학적 상식이 있다면 이 뇨제 복용 시에 감초의 사용을 신중히 해야 함을 소홀히 한 것으로 이 역시 비전문가에 의한 투약으로 추측된다. 또 다 른 예로 감초를150g이상4개월 동안200회 복용하여 저 칼륨 혈증이 유발된 사례로21)이 역시 약물 오남용의 예에 해 당되는 것으로 한의원에서 일반적으로 사용하는 상용량과는 거리가 멀다. 또한 甘草와 관련된 연구 보고들을 검색한 결 과 건강한 성인의 경우 한의원에서 사용하는 상용량으로 인 한 부작용 사례는 접할 수 없었으며, 이는 전문가에 의한 甘 草의 적절한 사용 조건 하에서는 별다른 부작용을 수반하지 않는 것으로 추정할 수 있는 근거가 된다.
본 연구에서는 본 연구진의 선행 연구 결과인 甘草 추출 물의 허혈성 신부전 억제 효과를 바탕으로 추가 연구를 수행 하여 약침액의 정맥 경로 적용이 어떠한 영향을 나타낼지를 일부 생화학적 검사 및 조직 소견을 통해 확인함으로써 허혈 로 인한 급성 신부전의 경우 甘草 약침액 정맥 주입이 증상 을 악화시키지 않을 뿐만 아니라 증상을 개선하여 치료 효과 가 있음을 구명하고자 하였다.
급성 신부전은 허혈, 신독성, 신혈관 및 간질 손상 등으로 인해 신장의 기능에 장애가 발생한 것으로, 신장은 단위 중 량에 비하여 혈류량이 많고 산소 요구량이 크며, 용질의 재 흡수와 분비가 이루어지고 용질이 장기간 체류되기 때문에 외부 독성 자극에 대한 감수성이 크다22). 또한 허혈로 손상을 받은 신장에서는 혈관 수축, 세뇨관 세포의 박리, 세뇨관 내 강의 폐쇄 등이 나타나게 되는데, 이러한 허혈성 및 독성 급 성 신부전에서는 세뇨관 세포의 손상과 세뇨관 세포가 괴사 를 일으켜 죽음에 이르는 과정의 병태 생리는 매우 복잡하여 아직 완전히 밝혀지지 않고 있으나 반응성 산소기의 역할이 주요하게 작용할 것이라는 근거가 다수 발표되고 있다6).
본 연구에서는 급성 신부전 모델을 허혈/재관류를 통해 유도하였으며 사용된 약침액은 甘草 추출물을 약침액 제조 용으로 만든 다음1% 농도로 희석하여 허혈/재관류 시간 동 안 정맥으로 주입함으로 인한 급성 신부전 유발을 억제할 수 있을 것인가를 확인하여 보았다.
채취된 혈액과 뇨를 이용하여glucose및Pi의 배설 분율 Fig. 4. Light micrograph of kidney from normal(A),
control(B), and sample(C) groups. G, glomerulus; PT, Proximal tubule; DT, distal tubule. PAS-stain x200.
A
B
C
을 확인하였는데 신장 동맥의 허열/재관류로 인해 근위 세뇨 관의 재흡수와 분비 기능이 악화되었던 것이 甘草 약침액을 주입한 실험군의 경우 급성 신부전에 대한 방어 효과를 나타 내었다(Fig. 1, 2).
지질 과산화는 산화에 의한 세포 손상을 나타내는 표현의 하나로 널리 알려져 있는데23), 허혈/재관류72시간 후 신장 피질에서 지질 과산화는 정상군에 비해 대조군에서 유의하 게 증가하였으며, 이러한 결과는 허혈/재관류에 의한 신부전 경로에 신장 조직 세포막 투과성 변화가 관여한 것을 의미한 다. 甘草 약침액을 주입한 실험군의 경우 대조군에 비해 유 의하게 감소되었다(Fig. 3).
신장 조직에 있어서는 대조군에서의 사구체는 전반적으 로 응축되어서 바깥벽과 속벽 사이의 주머니 공간이 팽창되 었을 뿐만 아니라 혈관 사이 세포에서는PAS-양성 물질들 이 정상군에 비하여 다량 침착 되어 있었는데, 실험군에서는 대조군에 비하여 주머니 공간의 팽창과 혈관사이세포의 PAS-양성물질의 침착이 미약하게 나타났다(Fig. 4).
이상의 연구 결과들을 종합하면 허혈/재관류로 인해glu- cose, Pi의 배설 분율, 지질 과산화 등이 증가되는 등 신부 전이 유발되었으며, 이에 대해 甘草 약침액의 정맥 주입이 효과적으로 작용할 수 있음이 확인되었고, 향후 허혈/재관류 에 대한 甘草의 신장 독성 억제 기전 및 이뇨제와의 병용 투 여 시 사용량 등을 제시하기 위한 약동/약력학적인 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.
V . 결론
본 연구에서는 甘草 약침액의 정맥 내 주입이 허혈/재관류 로 인한 신장의 손상을 억제할 수 있는가를 확인하기 위해 glucose와 무기phosphate (Pi)의 배설 분율 변화, 신피질 절편에서의 지질 과산화 정도 등을 측정하였으며 신장 피질 조직을 광학현미경으로 관찰하여 보았다. 그 결과 甘草 약침 액의 정맥 주입으로 인해glucose, Pi의 배설 분율 상승이 유 의하게 억제되었으며, 역시 신장 피질 조직의 지질 과산화도 유의하게 억제되었다. 신장 조직에 있어서도 조직 손상의 소 견이 甘草 약침액 주입으로 인해 줄어드는 것으로 나타났다.
Acknowledgement
This work was supported by a 2-Year Research
Grant of Pusan National University.
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