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Shock Protein 27의 발현 양상
Expression of Heat Shock Protein 27 according to Gleason Score and Pathologic Stage of Prostate Cancer
Seung Wook Lee, Eun Kyung Kim1, Sang Soo Kim2, Hong Sun Uh3, Kyung Suk Cha, Tag Keun Yoo
From the Departments of Urology and 1Pathology, Eulji University School of Medicine, 2Department of Biological Science, Hanyang University College of Natural Science, 3Uh’s Urologic Clinic Office, Seoul, Korea
Purpose: Heat shock protein 27 (HSP27) is induced by heat shock and other pathophysiologic stresses. We examined the relationship between HSP27 expression and Gleason score and pathologic stage of prostate cancer.
Materials and Methods: Fifty-three men were treated by radical prosta- tectomy for prostate cancer diagnosed from May 2004 to April 2007.
Prostate tissues (n=53) were obtained from radical prostatectomy speci- mens of prostate cancer. The overall percentage of cancer cells showing staining (0% to 100%) was indicated by visual scoring. Specimens were graded from ＋1 to ＋3 intensity representing the range of staining area, for which below 5% is ＋1 grade, 5-50% is ＋2 grade, over 50% is ＋3 grade and focal reaction is ＋0.5 grade.
Results: An HSP27-positive reaction was seen in 2 of 11 cases (18.2%) with a Gleason score of 4-6, 11 of 19 cases (57.9%) with a Gleason score 7, 6 of 10 cases (60.0%) with a Gleason score 8, 12 of 13 cases (92.3%) with a Gleason score of 9 (p=0.001); the mean HSP27 reaction scores were 0.27, 0.86, 0.83, and 1.54 respectively (p=0.006). An HSP27-positive reaction was seen in 17 of 37 cases (46.0%) with pathologic stage T2, 10 of 12 cases (83.3%) with pathologic stage T3, and 4 of 4 cases (100%) with pathologic stage T4 (p=0.0032); the mean HSP27 reaction scores were 0.64, 1.17, and 2, respectively (p=0.007). HSP27 expression was not statistically significant according to age.
Conclusions: There is correlation between HSP27 expression and Gleason score, pathologic stage of prostate cancer. (Korean J Urol 2009;50:547-552)
Key Words: HSP27 heat-shock proteins, Prostatic neoplasms
Korean Journal of Urology Vol. 50 No. 6: 547-552, June 2009
DOI: 10.4111/kju.2009.50.6.547
을지대학교 의과대학 을지병원
비뇨기과학교실, 1병리학교실,
2한양대학교 자연과학대학
생명과학과, 3어비뇨기과
이승욱ㆍ김은경1ㆍ김상수2
어홍선3ㆍ차경석ㆍ유탁근
Received：April 2, 2009 Accepted：May 22, 2009
Correspondence to: Tag Keun Yoo Department of Urology, Eulji Hospital, Eulji University School of Medicine, 14, Hangeulbiseok- gil, Nowon-gu, Seoul 139-711, Korea
TEL: 02-970-8305 FAX: 02-970-8349 E-mail: ytk5202@eulji.ac.kr
Ⓒ The Korean Urological Association, 2009
서 론
Heat shock protein (HSP)은 진화과정 동안에도 비교적 잘 보존된 단백으로서 세포생물학적 측면에서 매우 중요한 역 할을 한다. HSP는 heat shock, 자외선 조사, 중금속, 산화제 등과 같은 환경적 자극이나 감염, 염증, 저산소증, 조직손 상, 종양 등의 생물학적 자극에 의해 유도된다.1,2 특히 종양 에서 세포자멸사 조절, 면역반응 조절 및 약물 내성 등 세포
보호에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.3 HSP의 종류는 분자량에 따라 15-90 kDa으로 다양하며, 이 중에 HSP27은 신호전달, 분화, 증식 등의 세포기능뿐만 아 니라 체온조절에도 관여하는 것으로 알려져 있으며, 세포 성장과 이동에도 중요한 역할을 한다. 최근 연구에 따르면, HSP27은 caspase 3과 관련된 세포자멸사 신호전달 과정에 서 중요한 역할을 한다고 한다. HSP27은 procaspase 9 pathway에서 사립체의 cytochrome c의 분비를 방해하거나, cytochrome c 또는 procaspase 3에 작용하여 caspase 3 활성과
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apoptosome 형성을 방해함으로써 세포자연고사 (apoptosis) 를 억제하는 것으로 알려져 있다.1 유방암종, 난소종양 및 구강 내 편평상피세포암종에서 HSP27이 높게 발현되면 종 양의 성장속도가 빠르고 침윤 정도도 심한 것으로 알려져 있다.4-6 HSP27의 발현이 apoptosis를 억제한다는 보고가 있 었으며,7 이전 연구에서 전립선암의 일종인 LNCap 세포주 가 호르몬 저항성을 획득하는데 있어 HSP27이 관여한다는 연구결과가 있었다.8 본 저자들이 전립선암에서 HSP27 발 현도에 대해 연구하게된 것은 HSP27의 발현과 전립선암의 관계에 대한 연구보고가 많지 않았기 때문이다. 본 연구에 서는 면역화학적 방법을 이용하여 전립선암에서 근치적전 립선절제술 후 Gleason score, 병기, 연령에 따른 HSP27의 발현 양상을 분석하였다.
대상 및 방법 1. 연구대상
2004년 5월에서 2007년 4월까지 전립선암으로 진단받고 근치적전립선절제술을 시행 받은 53례의 전립선암 및 10례 의 전립선비대증 환자를 대상으로 하였다. 환자의 연령, 종 양의 병기, 종양의 Gleason score, 림프절 전이 유무, 원격 장기 전이 유무 등을 조사했다. 통상의 방법으로 제작된 H&E 염색표본을 한 명의 병리의사가 광학현미경으로 관찰 하였다. 병리학적 소견으로는 원발 종양 병기, 종양의 Gleason score를 관찰하였다. 병리학적 병기는 2002년 개정 된 TNM 병기 분류법에 따라 분류하였다.
2. 면역조직화학 염색
수술 후 얻은 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 후 제작된 파라핀 포매를 5μm 두께로 잘라서 연속절편을 만들고, 이들을 슬라이드에 부착시킨 후 충분히 건조시켰 다. 탈 파라핀 과정과 함수과정을 거친 파라핀 절편은 조직 내의 peroxidase가 활성화되지 않도록 3% 과산화수소에 10 분간 처리하고, 10 mM citrate buffer (pH 6.0)를 넣은 압력기 구에서 10분간 끓였다. Phosphate-buffered saline (PBS)으로 2분씩 3회 세척한 후, 배경의 비특이적 결합을 방지하기 위 해서 blocking solution으로 10분간 전처치하였다. 그런 다음 일차항체 HSP27 (1:100, SPA-800, Stressgen Bioreagents, Victoria, BC, Canada)을 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 Tris buffer로 씻어냈다. Biotinylated secondary antibody와 streptavidin-HRP conjugate (Dako LSAB Kit, K0675, Carpin- teria, USA)를 각 10분간 처리하여 Tris buffer로 수세하였다.
3,3′-diaminobenzidine (Sigma Chemical, St. Louis, USA)으로 발색하여 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하였다. HSP27
의 면역조직화학 염색의 결과는 종양세포의 세포질에서 발 현되는 것을 관찰하였으며 국소반응 이상의 경우에서 양성 으로 판정하였다. 또한 100배 현미경 시야에서 양성 세포를 계수하였고, 3회 반복하여 평균값을 내어 백분율 (퍼센트) 로 나타낸 후 양성 발현 정도가 계수한 종양세포의 5% 범 위 이하에서 반응을 보인 경우 ＋1, 5-50%의 범위에서 반응 을 보인 경우 ＋2, 50% 이상의 범위에서 반응을 보인 경우
＋3으로 표시하였다. 국소적으로 반응을 보인 경우 ＋0.5로 수치화하여 평가하였다 (Fig. 1).
3. 통계처리
전립선암종에서의 HSP27의 positive reaction rate와 Gleason score, 종양 병소의 병기와의 연관성을 chi-square test를 이용 하여 분석하였다. 또한 HSP27의 average reaction score와의 연관성 분석을 위해 ANOVA와 사후적으로 집단적 비교를 위해 Duncan 법을 이용하였다. 통계 분석에 사용된 프로그 램은 version 12.0 SPSS (SPSS Inc., Chicago, USA)로 p값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 의미가 있다고 판단하였다.
결 과
환자의 평균연령은 67.5±16.2세였다. 환자들의 원발 종양 병소의 병기를 살펴 보면 T2가 37례 (69%), T3가 12례 (23%), T4가 4례 (8%)였다. Gleason score에 따라 4-6점이 11 례 (21%), 7점이 19례 (36%), 8점이 10례 (19%), 9점이 13례 (24%)였다. 53례 중 4례 (8%)의 환자에서 림프절 전이가 관 찰되었으며, 원격전이가 관찰된 환자는 없었다 (Table 1).
HSP27 양성반응은 Gleason score 4-6점인 11례 중 2례 (18.2%), 7점인 19례 중 11례 (57.9%), 8점인 10례 중 6례 (60.0%), 9점인 13례 중 12례 (92.3%)에서 관찰되었으며 (p=
0.001), 병기 T2인 37례 중 17례 (46.0%), T3인 12례 중 10례 (83.3%), T4인 4례 중 4례 (100%)가 관찰되었다 (p=0.0032) (Table 2). 각각의 HSP27 반응 범위 점수의 평균은 Gleason score 4-6점, 7점, 8점, 9점에서 0.27, 0.86, 0.83, 1.54였으며 (p=
0.006), 병기 T2, T3, T4에서 0.64, 1.17, 2.00이었다 (p=0.007) (Table 3). 사후검정을 통한 각 군 간의 비교에서 Gleason score 4-6점과 9점인 군 사이에서 Gleason score와 비례하여 HSP27 평균 반응점수가 증가하였으며, 병기 T2인 군과 T4 인 군에서 병기와 비례하여 HSP27 평균 반응점수가 증가하 였다. 전립선암에서 림프절 전이가 있는 4례 중 모두에서, 림 프절 전이가 없는 49례 중 26례 (53%)에서 HSP27 단백이 발 현되었으며 림프절 전이와 HSP27 단백의 발현 양상 사이에 통계학적 유의성이 관찰되었다 (p＜0.001). 모든 환자에서 원 격 장기 전이는 관찰되지 않아 이에 대한 비교는 시행하지
Fig. 1. HSP27 expression in prostate tissues (A: no reaction-0, B: local reaction-0.5, C: below 5% reaction-1, D: 5-50% reaction-2, E:
above 50% reaction-3, F: no reaction in BPH). Specimens were graded from 0 to ＋3 intensity representing the range from no staining to heavy staining by visual scoring. HSP27: heat shock protein 27, BPH: benign prostatic hyperplasia (Immunohistochemical stain, x200).
못했다. 대조군으로 설정한 전립선비대증 조직에서 HSP27의 발현은 관찰되지 않았다 (Fig. 1). 연령에 따른 HSP27 양성반 응 정도와 반응범위 점수의 유의한 차이는 없었다.
고 찰
HSP는 다양한 스트레스성 자극에 반응하여 생성된다.
HSP의 발현은 세포손상에 대한 저항성을 증가시킨다.
HSP27의 주요 역할은 actin의 역동적 변화와 세포자멸사를 억제하는 것이다. HSP27의 세포자멸사의 억제작용은 proc- aspase 9 경로에서 cytochrome c/Apaf-1/dATP complex와 작 용하거나 Fas와 Ask1의 daxx protein과의 연계성을 부분적 으로 방해함으로써 가능한 것으로 알려져 있다.9 또한, procaspase 9 pathway에서 사립체에서 cytochrome c의 분비
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Table 1. Patient characteristics (n=53) Variable
Age (years) 67.5 (±16.2)
Gleason score No. of patients (%)
4-6 11 (21)
7 19 (36)
8 10 (19)
9 13 (24)
T stage
T2 37 (69)
T3 12 (23)
T4 4 (8)
Lymph node metastasis
No 49 (92)
Yes 4 (8)
Distant metastasis
No 53 (100)
Yes 0 (0)
Table 3. Average reaction score of HSP27 expression according to clinicopathological data of prostate cancer
No. of Average
Variables p-value
patients (%) reaction score Gleason score
4-6 11 (21) 0.27 0.006
7 19 (36) 0.86
8 10 (19) 0.83
9a 13 (24) 1.54
Tumor stage
T2 37 (69) 0.64 0.007
T3 12 (23) 1.17
T4b 4 (8) 2.00
HSP27: heat shock protein 27, a: vs. Gleason score 4-6, p＜0.05,
b: vs. Tumor stage T2, p＜0.05
Table 2. HSP27 expression and clinicopathological data of pro- state cancer
HSP27 No. of
Variables patients (%) (－) (＋) p-value
Gleason score
4-6 11 (21) 9 (81.8) 2 (18.2) 0.001 7 19 (36) 8 (42.1) 11 (57.9) 8 10 (19) 4 (40.0) 6 (60) 9 13 (24) 1 (7.7) 12 (92.3) Tumor stage
T2 37 (69) 10 (54.0) 17 (46.0) 0.0032 T3 12 (23) 2 (16.7) 10 (83.3)
T4 4 (8) 0 (0) 4 (100) HSP27: heat shock protein 27
를 방해하거나, cytochrome c 또는 procaspase 3에 작용하여 caspase 3 활성과 apoptosome 형성을 방해한다고 알려져 있 다.10 과거 수년 동안 HSP는 종양 면역능에 중요한 역할을 해온 것으로 알려져 있다. 예를 들면 chaperone antigenic peptides에 작용하여 위험신호를 개시하거나, antigen-pre- senting cells이 죽은 종양세포에서 유리된 HSP-peptide com- plex를 획득하게 함으로써 종양세포로부터 보호하는 면역 반응을 유도한다. 또한 HSP는 종양세포에 내재된 항원을 처리하고 전달하는 능력을 향상시켜서 세포독성 T 림프구 가 잘 인식하도록 하는 것으로 알려져 있다.11
전립선암에서의 HSP27이 과다 발현되는 것이 무엇을 의 미 하는지에 대해서는 아직도 밝혀야 할 부분이 많다.
HSP27은 세포의 성장과 분화에 영향을 미치고, 세포자멸사
를 방해하고, 전립선암의 증식에도 관여하는 것으로 알려 져 있다. 최근 연구에서는 HSP27의 발현을 억제하는 방법 을 사용하여 HSP27을 발현하는 종양을 치료하는 가능성을 제시하고 있는데, HSP27에 대한 안티센스를 사용하여 세포 자연고사를 유도하면 종양 치료에 유용하리라고 보고하였
다.12,13 Miyake 등14은 근치적 전립선절제술을 시행 받은 172
명을 대상으로 시행한 연구에서 HSP27, HSP70, HSP90 등 이 모두 전립선암과 연관되어 반응을 보이나 HSP27만이 종 양의 병기 및 Gleason score에 따라 통계적으로 유의한 반응 을 보였으며, 특히 HSP27의 발현 정도가 근치적 전립선절 제술을 시행 받은 환자에서 생화학적 재발을 예측할 수 있 는 가장 유용한 예측인자라고 보고했다. Rocchi 등7,15은 전 립선암에서의 호르몬박탈요법 후 HSP27의 증가가 남성호르 몬 비의존성 종양으로 발전하는 과정에 있어 세포를 보호하 는 역할을 한다고 설명하였으며, antisense oligonucleotides (ASOs)-induced silencing이 종양의 자연고사 (apoptosis)를 촉진시키고, 종양의 진행을 늦추며, 호르몬박탈요법 후에 강력한 치료의 목적이 되는 세포자연고사의 조절자로서 HSP27이 역할을 한다고 발표하였다. Teimourian 등16은 HSP27의 발현을 감소시킨 전립선암 세포주가 그렇지 않은 전립선암 세포주에 비해 감마선을 72시간 조사한 후의 생 존력이 의미 있게 감소한다는 것을 보고하였다. 이는 전립 선암에 있어 HSP27의 발현을 억제하는 것이 치료 효과를 향상시키는데 도움이 된다는 것을 나타낸다.
본 연구 결과 HSP27은 양성전립선비대증 조직에서는 관 찰되지 않았으나 전립선암종에서 발현되는 경향을 보였다.
또한 전립선암에서 병기와 Gleason score에 따라 발현강도 가 증가함을 나타냈다. 이를 통해 HSP27의 양성 발현 정도 는 원발 종양의 병기, 원발 병소의 성상, 림프절 전이와 연관
성이 있음을 알 수 있다. 국내의 전립선암에서 HSP 발현에 대한 연구 발표는 아직 없었으며, 전립선 외 다른 암종에 관 한 연구로는 방광암, 신세포암 등에 관한 연구발표가 있었다.
Choi 등17은 방광암에서의 heat shock protein 70 (HSP70)의 발 현연구를 통해 방광종양에서 HSP70은 종양의 병기와 관계 가 없으나, 분화도와의 상관 관계가 있다고 보고하였다.
Yoon18은 HSP27이 정상 신조직보다 신세포암종에서 더 많 이 발현되는 경향을 보이나 HSP27의 발현과 세포자멸사 사 이에 통계적 유의성은 없는 것으로 보고하였다. Lee 등19은 신장암 Caki 세포주에서 arisostatins A에 의한 heat shock protein 70의 발현과 조절기전에 대한 연구에서 arisostatin A 가 세포고사를 유도하였으며 동시에 HSP70의 발현이 증가 하였다고 보고하였다. 그 외 HSP가 스트레스 상황과의 연 관성에 대한 연구로 Jeong 등20은 일측요관부분폐색 흰쥐의 동측 신장에서 HSP70의 발현에 관한 연구에서 요관의 부분 적인 폐색으로 인하여 신장 내 HSP70의 발현이 정상 신장 에서보다 부분적으로 요관폐색이 있는 신장조직에서 더 강 하게 관찰되었으므로, 이는 부분요관폐색이 신장조직에 손 상을 줄 수 있음을 보고 하였다. Park 등21은 고온에 노출된 고환은 정자생성능력이 감소될 뿐만 아니라 HSP70 단백이 현저히 증가하여 고온에 대한 방어기전으로 HSP70 단백이 과발현되며, 고온 직후 저온에 노출했을 때 정자생성능력 이 보존되었고 HSP70 단백의 발현이 대조군과 유사한 소견 을 보였는데, 이러한 결과는 온도의 변화가 고환에서 HSP70 단백발현에 영향을 미치는 것이라고 보고하였다.
본 연구는 전립선암의 증례 수가 아주 적은 것은 아니나 대부분의 예에서 림프절 전이가 일어나지 않았으며 원격전 이된 예는 하나도 없었다. 따라서 HSP27 단백 발현 여부와 다양한 병리학적 인자들과의 연관성을 찾기에는 연구대상 의 수가 적다는 한계가 있었다. 그러므로 HSP27과 전립선 암의 상관성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각 한다.
결 론
전립선암에서 Gleason score, 종양의 병기와 HSP27 양성 반응 정도 및 반응 범위점수가 연관이 있는 것으로 나타났 다. 향후 연구에서는 HSP27이 전립선암종의 개시, 촉진, 면 역 조절과 호르몬불응성 등의 과정 중 어떤 부분에서 역할 을 하는지를 연구할 필요가 있다고 생각한다.
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