Bishpenol A와 인체 위해 연구를 위한 시료 용기에 대한 재고 1

C

PREVENTION RESEARCH □ ORIGINAL ARTICLE □

208 책임저자：양미희, 󰂕 140-742, 서울시 용산구 청파동 53-12번지

숙명여자대학교 약학대학 독성학교실 Tel: 02-2077-7179, Fax: 02-710-9871 E-mail: myang@sm.ac.kr

접수일：2009년 7월 2일, 게재승인일：2009년 7월 15일

Correspondence to：Mihi Yang

Department of Toxicology, Sookmyung Women’s University College of Medicine, 53-12, Cheongpa-dong, Yongsan-gu, Seoul 140-742, Korea Tel: ＋82-2-2077-7179, Fax: ＋82-2-710-9871

E-mail: myang@sm.ac.kr

Bishpenol A와 인체 위해 연구를 위한 시료 용기에 대한 재고

1숙명여자대학교 약학대학 독성학교실, ²국립의료원 소아청소년과

이호선¹ㆍ신혜정²ㆍ양미희¹

Consideration of Biospecimen Containers for Bisphenol A and Human Risk Studies

Ho-Sun Lee¹, Hye Jung Shin² and Mihi Yang¹

1Department of Toxicology, Sookmyung Women's University College of Pharmacy, Seoul 140-742,

2Department of Pediatric, National Medical Center, Seoul 100-799, Korea

Bisphenol A (BPA), an endocrine disruptor, has been emphasized due to its epigenetic characteristics and potential to increase prostate cancer through second hit mechanism. However, its end points in human have not been clarified, yet. Thus, the continuous biomonitoring of BPA is an alternative strategy for prevention of BPA-related cancer. For the proper biomonitoring of BPA, BPA-contamination, which confounds real exposure of BPA, should be excluded. Most of exposed BPAs to human are metabolized into conjugated BPA in urine and the conjugated BPA in urine reflects real exposure to BPA. On the other hand, free BPA reflects contamination of BPA through handling process rather than real exposure.

In the present study, we focused on container-induced BPA and compared free BPA levels in urine samples, which were stored in the plastic tubes (Conical tube 50050, PP, SPL, Pocheon, Korea), to those in BPA free-glass tubes (N=16). We quantified BPA with reverse phase-HPLC/FD methods. As a result, we found that free BPA were not detected in urine samples. Thus, the plastic containers are suitable for future BPA biomonitoring. (Cancer Prev Res 14, 208-211, 2009)

Key Words: Bisphenol A, Plastic, Glass, Biomonitoring

서 론

BPA (bisphenol A, BPA)는 아세톤과 2분자의 페놀 축합 으로 합성하며 에폭시 수지의 기본 원료로 사용하거나 폴리카보네이트, 폴리에스터-스티렌 등 플라스틱의 합 성에 사용되는 단량체이다. 따라서, BPA는 식품 포장재, 캔, 병마개, PET (polyethylene terephthalate)병, 치과용 수지 등에 폭넓게 사용된다. 또한, BPA는 in vitro, in vivo 실험에 서 에스트로겐 활성이 보고되어 있을 뿐 아니라, 생식기 계 장애, 면역기계 위해, DNA adduct 형성 등 다양한 독

성이 보고 되었다.^1,2) 사람의 경우, BPA는 비만, 자궁내막 증, 다낭성 난포증후군, 여성의 성조숙증 등과 관련성이 있는 것으로 역학연구에서 보고되었고, 제2형 당뇨, 전 립선암, 유방암과 같은 호르몬 관련 암에 대한 잠재성에 관심이 모아지고 있다.^3∼5) 그러나, 남성생식기 독성과 관련하여 hormesis 등 상반된 BPA의 독성결과가 보고된 바와 같이,^6,7) BPA의 인체위해를 증명하는 증거에 근거 한 반응 종말점에 대하여는 일치된 결론을 얻어내지 못 한 실정이다. 최근에는 BPA의 발암성 기전을 후생유전 학적 측면⁸⁾과 second hit theory^9,10)를 가지고 구명하려는 노력이 주도적이다. 특히, second hit theory는 소아기 BPA

이호선 외 2인：Bishpenol A와 인체 위해 연구를 위한 시료 용기에 대한 재고 209

노출이 성인이 되어 발암원에 노출시, 암 발현을 증대시 킨다는 견해로 내분비장애물질의 고감수성 인구인 소아 인구에서 암예방을 위한 BPA의 노출모니터링의 필요성 을 강조한다.

생물학적 노출모니터링(biomonitoring)은 혈액, 소변, 모발 등 생체시료로부터 유해물질 그 자체, 또는 유해물 질의 대사산물 또는 생화학적 변화산물 등 ‘생물학적 노 출지표’를 정량 분석하여 유해물질 노출에 의한 인체 위 해성을 평가하는데 필수적이다. 대부분의 BPA는 장간의 sulfotransferase (SULTs), uridine diphosphate glucuronyltrans- ferase (UGTs) 등의 효소에 의해서 포합체 형태로 대사되 고 유리형 BPA만이 estrogen receptor와 결합하여 에스트 로겐 성 효과를 가진다고 보고되었다.^11,12) 또한, 소변을 중심한 BPA의 biomonitoring의 경우, 유리형 BPA는 포합 형 BPA가 실제 노출을 반영하는데 반하여, 채뇨, 보관, 전처리, 정량분석 과정 등 총 분석과정에서 취급과 관련 한 오염으로 추정된다.¹³⁾ BPA의 용도를 고려할 때, 그 함 유여부가 우려되는 채뇨 용기에서 BPA 오염은, 적절한 BPA의 biomonitoring을 수행하기 위하여 반드시 고려해 야 할 요인이 된다. 따라서, 본 연구에서는 BPA의 biomo- nitoring을 위하여 채집된 뇨의 용기 재질에 따른 BPA의 오염여부를 조사하여 향후 바람직한 biomonitoring을 위 한 기초연구를 실시하였다.

재료 및 방법 1. 연구대상자

국립의료원 IRB를 통과한 프로토콜에 따라, 2008년 4 월 국립의료원 소아 청소년과를 방문한 여자 어린이 (N=16)을 대상으로 하였다. 동일한 대상자들의 아침식 전 한 시점(one spot)뇨는 각각 50 ml의 BPA 없는 유리 재질의 공전시험관(OMG, Seoul, Korea)과 플라스틱 코니 칼튜브(Conical Tube 50050. Polypropylene, SPL, Pocheon, Korea)에 약 40 ml씩 채집하였다. 채집 이후 뇨는 분석 전까지 −20^oC에 보관하였다

2. 시료의 전처리

BPA가 함유되지 않은 15 ml의 유리 시험관에 각기 다 른 용기에 보관된 뇨 시료 1 ml를 가하고, 1.00μg/ml 농 도의 내부표준물질인 BPB (Tokyo Kasei Kogyo Co., Tokyo, Japan)를 0.1 ml 가하고, 2.0 M CH3COONa 60μl을 가한 다. 총 BPA 분석을 위해서는 β-glucuronidase (Sigma Che- mical Co., St. Louis, MO, U.S.A.) 2,774 U를 첨가하였고, 유리형 BPA 분석을 위하여는 효소를 가하지 않고 각각

진탕 항온 수조에서 37^oC에서 5시간 반응시켰다. 반응이 끝나면, 2 N HCl 200μl를 가한 후 ethylacetate 5 ml로 10 분 간 추출한 뒤, 상등액 2 ml을 취하였다. 추출 작업을 2회 반복하여 얻은 4 ml의 ethylacetate 분액을 증발 농축 시켜 잔사를 60% acetonitrile 300μl에 녹였다. 원심분리 (14,000 rpm, 10분)후, 상등액을 취하여 그 중 50μl를 HPLC에 주입하였다.

3. HPLC/FD법

뇨 시료 중 유리형 및 총 BPA (포합형+유리형 BPA)는 본 연구진이 발표한 역상 HPLC/FD를 이용하여 정량하 였다.¹⁴⁾ HPLC/FD 시스템은 SP930D pump (Younglin Instru- ment, Seoul, Korea), Type 830 autosampler (MIDAS, AJ Emmen, Netherlands), FP-2020 Plus Intelligent FD (Jasco, Tokyo, Japan), X-Terra C18 column (5μm, 4.6×250 mm, Waters, Wexford, Ireland)으로 구성되었다. 기울기 용리법 (gradient법: 개시, 물:acetonitrile, 70:30; 0∼30분, 50:50; 30∼

40분, 0:100; 40∼45분, 0:100; 45∼50분, 70:30; 50∼65분, 70:30)으로 유속은 1 ml/min로, 형광 여기 파장은 225 nm, 방출파장은 305 nm에서 분석하였다. 모든 시료는 2회 중 복실험하여 정량하였다(분석시료, 총 64개).

결 과 1. 피험자의 특성

피험자 어린이의 나이는 6.66±0.27세, 신장 평균은 119.03±5.22 cm, 그리고 체중은 23.53±4.27 kg였다.

2. 검량선 작성

검량선은 내부 표준물질인 BPB의 면적에 대한 BPA의 피크 면적 비를 가지고 작성하였다. 그 결과, Fig. 1에 나 타낸 바와 같이 최소 자승법에 의해 구한 BPA의 직선 회귀식은 검량선 작성 범위인 0.96∼600 ppb에서 y=

0.0089×−0.0269이었으며, 결정계수는 0.99 이상으로 작 성 농도범위에서 BPA의 농도와 area 간에 직선적 양의 상관관계가 인정되었다. 검량선 농도 범위에서 변동계 수(C.V.)는 모두 10% 이하로 나타났고 회수율은 82∼

117%이었다.

3. 용기에 따른 BPA의 농도 비교

내부 표준물질의 피크 면적에 대한 BPA의 피크 면적 비를 구하여 작성 된 검량선에서 뇨 중 유리형 및 총 BPA의 농도를 구하였다. 유리와 플라스틱 용기에 보관 한 각각 16시료의 중복실험(N=64)에서 유리형 BPA는

210 Cancer Prevention Research Vol. 14, No. 3, 2009

Table 1. Comparison of BPA levels between plastic and glass tubes^a

Free BPA Conjugated BPA

N.D. N.D. Detectable (#I.D.)

Plastic 16 15 1 (#8)

Glass 16 15 1 (#8)

aData mean number of samples.

N.D.: non datectable, #I.D.: I.D. number of thesample.

Fig. 1. The calibration curve of BPA in spiked urine (N=3 for each concentration).

검출 되지 않았다(Table 1). 따라서, 본 실험에 사용한 polypropylene 소재의 코 니칼 튜브는 BPA의 침출이 없는, 또는 BPA를 소재로 사용하지 않은 것으로 사료되어 향 후 BPA의 biomonitoring 연구에 적절한 채뇨 용기로 이용 될 수 있다고 판단되었다.

한편, 결합형 BPA분석을 통하여 보관용기를 달리한 16시료 중 한 시료(I.D. number=8)에서 두 용기에서 공통 으로 검출되었다(Table 1). 그 값은 유리시험관과 플라스 틱 시험관 보관시료에서 각각 1.70±0.05 ppb와 1.83±0.05 ppb로 정량되었다. 두 값의 평균인 1.76 ppb에 대하여 C.V. (coefficient of variation)이 8.7%로 나타나, 본 정량 분 석법의 재현성(C.V. ＜15%)을 확인하였고, 또한, 플라스 틱 시험관에서 BPA가 유래하지 않음을 다시 확인하였 다.

고 찰

인체에서, BPA의 노출 경로는 주로 식품에 의한 것으 로 이는 경구 섭취 되어 간 대사를 거쳐 해독화 기전으 로 거의 포합형으로 변화되어 소변으로 배설된다.⁵⁾ 반 면, 대사되지 않은 유리형 BPA는 radical 생성, DNA- ad- duct 등 돌연변이, 나아가 암화를 유발할 것으로 우려된 다. Ye 등은 biomonitoring 시료의 10% 정도에서 평균 0.3 μg/l 농도의 유리형 BPA를 검출하였다.¹⁵⁾ 한편, Tsukioka 등은 91개중 11개의 뇨에서 0.01∼0.27μg/l 범위에서 유 리형 BPA를 검출하였고,¹⁶⁾ Fukata 등은 52개 중 2개의 샘 플에서 0.24∼0.35μg/l의 유리형 BPA를 측정 하였다.¹⁷⁾ 그러나, 이러한 유리형 BPA level은, BPA의 대사특성- 즉, 100% 가까운 포합체형 배설을 고려할 때 노출에 의한

대사되지 않고 배설된 것으로 보기 어렵다. 본 연구진은 이러한 이유로 인하여 BPA 노출모니터링 지표로 총 BPA에서 유리형을 뺀 포합형만을 인정하여 왔다.¹⁸⁾ 그 러나, 임신, 미성숙 등 대사에 결함을 주는 요인에 의하 여 독성이 큰 유리형 BPA가 뇨 중 배설될 가능성을 완전 히 배제할 수는 없다. 이에 대하여 본 실험결과, 6세 소 아의 뇨에서 포합형 BPA가 검출된 시료에서 유리형 BPA는 검출되지 않음을 확인하였으므로, 6세의 건강한 소아에서는 BPA를 포합체형으로 배설하는 해독능을 보 유함을 확인하였다. 이는 향후 인구수를 확대하여 확인 되어야 할 것으로 사료된다. 또한, 본 실험에서 사용한 우리나라에서 제조된 한 polypropylene tube의 경우, BPA 오염으로부터 안전함을 Table 1의 결과로부터 확인하였 다.

BPA를 biomonitoring 하는데 어려운 점은 폭 넓은 BPA 사용(소비)으로 분석과정에서 사용되는 다양한 기구 (appartus)에서 BPA오염을 제거하여 BPA free 환경을 확립 하는 일이다. 이 작업은 실험실 환경에 따라 오염원을 찾는데 수개월을 소모하기도 하여 많은 연구자들이 애 로를 토로하는 부분이다. 최근 LC/MS/MS를 통한 BPA 분 석법의 개발로 날로 BPA 정량법은 그 신뢰도가 높아지 고 있지만 본 연구에서 살펴본 바와 같이 채뇨 용기 등 철저한 BPA free 환경이 확보되지 않으면 얻어진 BPA biomonitoring 결과에도 의문이 가게 된다.

결 론

우리나라 6∼7세 여자 소아 16명에서 한 시점, 즉, 아 침식전, 뇨를 한국산 한 polypropylene 소재의 플라스틱 tube와 유리 공전시험관에 나누어 각각 보관 후, 보관 된 뇨에서 유리 BPA level을 비교하였다. 그 결과, polypro- pylene 소재의 플라스틱 튜브에 보관한 뇨와 BPA free 유 리 시험관에 보관 한 동일한 뇨시료에서 유리형 BPA는 모두 검출 되지 않았다.

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또한 결합형 BPA 분석결과, 한 시료에서만 두 용기 모 두에서 검출 되었고, 그 값은 유리시험관과 플라스틱 시 험관 보관시료에서 각각 1.70±0.05 ppb와 1.83±0.05 ppb 로 평균인 1.765 ppb에 대하여 C.V. (coefficient of variation) 이 8.7%로 나타나, 본 정량 분석법의 재현성 (C.V.

＜15%)을 확인 하였고, 또한, 플라스틱 시험관에서 BPA 가 유래하지 않음을 재확인하였다.

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