토끼에서 냉동 보관한 동종 종건 이식술 후 이식 건의 변화
가톨릭대학교 의과대학 성빈센트병원 정형외과학교실
강용구・이한용・고해석・송주현・유기원・정진영・전광남
자가건-골 이식술후 이식 건의 변화를 관찰하면, 이식편의 모든 세포가 죽고, 서서히 재순환이 되어 새로운 조직 으로 대치되는 것으로 보고되고 있다. 이 같은 사실은 인대 재건술에서 자가 건 뿐 아니라 동종건 이식술도 가능 할 것이라는 사실을 시사하는 것이다.
동종 조직 이식술후의 성공 여부는 이식 조직의 조직 적합성( b i o c o m p a t a b i l i t y )에 따라 결정되는데 건, 골과 같 은 결체 조직 이식술에는 이식 조직의 항원성을 낮추기 위해 이식편을 냉동처리 혹은 동결건조 하는 방법이 추천 되고 있다. 이에 저자들은 토기에서 냉동 보관한 동종 건 이식술 후 이식 건의 변화를 관찰하였다.
체중 3.0 kg 내외의 건강한 흰토끼를 암수 구별 없이 2 8마리를 사용하였다. 아무런 조작을 하지 않은 7마리를 대조군으로 하고, 실험군은 우측 족관절부 종건(Achilles tendon)을 떼어 냉동시켰다가 4주 후 다른 토끼에 이 식하는 수술방법을 선택하고, 실험 동물은 수술후 4주, 8주, 16주에 각각 7마리씩 도살하여 육안 및 조직학적 관 찰을 하였다.
조직학적 결과에서 이식 건은 술 후 4주에 종 방향으로 잘 분화되었던 교원질 다발이 무정형( a m o r p h o u s )의 교 원질로 변화되어 있으며 건 세포는 완전히 소실되어 이식된 건은 무혈성 괴사(vascular necrosis)가 일어났다는 것을 알 수 있었다. 술 후 8주에는 이식 건 내에 혈관이 관찰되기 시작하여 괴사된 건에 혈관이 자라기 시작하고 교원질 사이에 새로운 세포들이 나타나기 시작하였다. 술 후 1 6주에는 이식 건은 완전히 새로운 건으로 대치 ( r e p l a c e )되어 있었으나 신생 건 내에서는 많은 량의 혈관이 자라 들어간 것을 관찰할 수 있었다. 신생 건은 상 대적으로 덜 분화된 양상으로 세포가 정상보다 훨씬 많은 수로 관찰되었으며, 교원질의 종 방향 분화도 아직 이 루어지지 않은 상태이었다. 혈관 주위에 군데군데 임파구가 관찰되나 거부반응을 시사하는 염증반응은 없었다.
색인 단어: 동종 종건, 이식
Changes in Frozen Allogenic Achilles Tendon Graft in Rabbits
Yong-Koo Kang, M.D., Han-Yong Lee, M.D., Hae-Seok Koh, M.D., Joo-Hyoun Song, M.D., Kee-Won Rhyu, M.D., Jin Young Jeong, M.D., Kwang Nam Chun, M.D.
Department of Orthopedic Surgery, St. Vincent’s Hospital The Catholic University of Korea
* Address for Correspondence : Han-Yong Lee, M.D.
Department of Orthopedic Surgery, St. Vincent’s Hospital
The Catholic University of Korea, 93-6 Jee-dong Paldal-gu, Suwon, Gyeonggi-do, 442-723 Tel : 82-31-249-7186, Fax : 82-31-254-7186, E-mail : hylee@vincent.cuk.ac.kr
서 론
관절의 인대손상은 적절히 수복되지 않으면 관절
Marshall 1969, Marshall과 Olsson 1971), 만성적인 인대 손상에서 불안정성 및 이차적인 퇴행 성 관절염을 예방하기 위해 시행하는 재건술은 임상
The use of autogenous patella tendon graft has been advocated for intra-articular replacement of the anterior cruciate ligament. However the amount of tissue available for substitution is restricted by the need to avoid a serious defect at the donar site. Previous experimental studies have shown that they are completely avascular at the follow-up time after transplantation, and are essentially free grafts. These raises the necessity of using a free patellar tendon allograft as a replacement for the anterior cruciate ligament. Freezing has been shown to minimize the anti- genicity of connective tissues. Also deep-freezing dose not significantly alter the biomaterial properties of ligament tissues.
The purpose of this study was to evaluate the morphological changes of Achilles tendon-bone graft in rabbits.
Twenty-eight rabbits weighing 3.0 kg were used. Seven were used for normal control which are not operated animals. Twenty-one which were experimental animals were operated in right ankle, and 7 were sacrificed at postoperative 4, 8, 16 weeks each. For experimental animals, an Achilles tendon was harvested from 3 cm proximal to insertion with 5 mm bone fragment of cal- caneous insertion.
The harvested tendon-bone unit was preserved below -80℃ for 4 weeks.
The preserved tendon-bone unit was transplanted in the defect of Achilles
tendon defect in another rabbit After skin closure, the rabbit was immobilized for 4 weeks with long leg cast.
At postoperative 4, 8, 16 weeks each, 7 rabbits were sacrificed for histological evaluation.
The results were as follows.
1. In control, well organized collagen bundle oriented longitudinally, and tenocytes between the collagen bundle were observed. A hypervascular areolar tissue was observed in the outer surface of the tendon.
2. In postoperative 4 weeks, tenocytes were disappeared completely with an amorphous degen- eration of collagen bundle. The vascular areolar tissue in outer surface of tendon was detached and disappearing.
3. In postoperative 8 weeks, the new vessels with plenty of spindle cells between the collagen bundle were observed in the central part of the grafted tendon.
4. In postoperative 16 weeks, newly formed fibrous tissue with numerous spindle cells were observed. However the tissue was not organized. There was no evidence of inflammatory reac- tion.
Based on these results, the cryopreserved Achilles tendon-bone graft can be used for ligament reconstruction with protection for certain time periods.
Key Words: Allogenic Achilles Tendon, Graft
(Arnoczky et al. 1982). 이 중에서 슬관절의 십자인대 재건술로는 자가 슬개건-골 이식술이 가장 많이 이용되고 있다. 인대 재건술에서 건 만을 이식 하는 경우에는 이식 건을 골에 고정하기 어려운 문 제점이 있기 때문에 건을 채취할 때 골을 함께 떼어 내 이식 건을 골에 부착하기 용이하게 하는 건-골 이식술이 보편적으로 이용되고 있다.
슬관절의 십자인대 재건술에 이용되는 자가 슬개 건-골 이식술은 공여부의 건파열, 공여부 동통 등 의 합병증과 공여 조직이 제한되어 있다는 단점이 있 다 (Bonamo et al. 1984) 또 한 A r n o c z k y ( 1 9 8 6 )등은 동물실험에서 자가건-골 이 식술 후 이식 건의 변화를 관찰한 결과, 이식편의 모든 세포가 죽고, 서서히 재순환이 되어 새로운 조 직으로 대치된다고 보고하였다. 이 같은 사실은 건 재건술에서 자가 건 뿐 아니라 동종 건 이식술도 가 능할 것이라는 사실을 시사하는 것이다.
동종 조직 이식술후의 성공 여부는 이식 조직의 조직 적합성( b i o c o m p a t a b i l i t y )에 따라 결정 되는 데 건, 골과 같은 결체 조직 이식술에는 이식 조직 의 항원성을 낮추기 위해 이식편을 냉동처리 혹은 동결건조 하는 방법이 시행되고 있다. 그중에서 냉 동처리법은 - 8 0℃ 냉동고에 이식조직을 일정한 기 간 보관하는 비교적 쉬운 방법으로 임상에서 손쉽게 이용할 수 있는 방법이다(Barad et al. 1982, Friedlander et al. 1976).
이에 저자들은 토끼에서 냉동 보관한 동종 건 이 식술후 이식 건의 변화를 관찰하기 위하여 본 실험 을 하였다.
재료 및 방법
1. 실험동물
체중 3.0 kg 내외의 건강한 흰토끼를 암수 구별 없이 2 8마리를 사용하였다. 토끼는 실험 1주일 전 부터 사육사내의 동일한 조건하에서 사육하였다. 아 무런 조작을 하지 않은 7마리를 대조군으로 하고, 실험군은 우측 족관절부 종건(Achilles tendon)을 떼어 냉동시켰다가 4주후 다른 토끼에 이식하는 수
술방법을 선택하였다. 실험동물은 수술 후 4주, 8 주, 16주에 각각 7마리씩 도살하여 육안적 관찰 및 조직학적 관찰을 하였다.
2. 실험 방법
1) 이식편 적출
체중 1 kg 당 2 mg의 t h i o p e n t a l을 실험 동물 의 이개정맥에 주입하여 전신마취를 유도하고, ket- a m i n e을 체중 1 kg당 3 mg을 근육 주사하여 마 취 상태를 유지하였다. 이식편 적출은 강승범과 강 용구( 1 9 9 4 )의 방법에 따라, 수술대 위에서의 체위 는 복와위로 하여 우측 하퇴를 무균적으로 수술하였 다. 사지를 고정시킨 후 우측 종골로부터 근위부 약 4 cm까지 종절개를 가한 후 족저근을 외측으로 견 인하여 종건을 노출시켰다. 노출된 종건을 종골 부 착부의 근위부 3 cm에서 단연하고, 종골은 종건 부착부의 원위부 5 mm에서 절골하여 종건-골 (Achilles tendon-bone)이식편을 적출하였다.
2) 이식편 보존
적출한 이식편은 생리식염수와 penicillin G 2 5 0단위를 혼합한 용액에 적신 가아제로 싸서 소독 된 밀폐용기에 넣어 영하 8 0℃에서 4주간 냉동 보 관하였다.
3) 이식 수술
냉동 보관된 이식건-골을 실온으로 꺼내서 생리 식염수에 약 1시간 담갔다. 이식 수술을 받을 토끼 도 같은 방법으로 우측 족관절을 노출시켜 종건-골 을 적출하여 냉동 보관하고, 적출하고 남은 자리에 생리식염수에 담가 녹이고 있는 동종 아킬레스건-골 이식편을 이식하였다.
이때 공여부의 종골편은 수용부의 종골에 K -강선 을 이용하여 고정하고 공여부와 수용부의 종건 말단 은 nylon 봉합사를 이용하여 변형된 Kessler 방법 으로 봉합하였다.
모든 실험동물은 불필요한 관절운동으로 이식 골 의 불 유합이나 이식 건의 전위를 막기 위하여 피부 봉합 후 슬관절에서 족관절에 이르는 장하지 석고붕
대를 시행하여 4주간 고정하였다. 또한 모든 실험동 물은 정확한 골 정복 여부를 확인하기 위하여 수술 직후 단순방사선 촬영을 시행하였다. 수술 후 4주에 석고붕대와 K -강선은 제거하였다.
3. 관찰방법
실험군은 술 후 4주, 8주, 16주에 각각 7마리를 도살하여 이식편의 건 유합과 골 유합을 육안적으로 관찰하고 이식된 종건-골을 적출하였다. 적출한 이 식편은 10% formalin 액에 2 ~ 3일간 고정한 후 20% 수용성 포름산/10% 구연산나트륨( 2 0 % formation acid./10% sodium citrate) 혼합액 에서 3 ~ 4일간 탈회시켰다. 이식편은 건 섬유에 평 행한 방향으로 절단하여 p a r a f f i n에 호매하여 6μ m 두께의 조직표본을 만들었다. 조직 표본은 hematoxylin-eosin 염색법으로 염색하여 광학현 미경 하에서 2 0배 및 1 0 0배 배율로 관찰하였다.
결 과
1. 육안적 결과
실험동물은 4주간 석고고정 중에는 보행에 불편 이 심하여 활동이 제한되었으나, 석고고정과 K -강 선 제거후에는 토끼장내에서 자유롭게 활동하였다.
채취한 조직 관찰 중 수술후 4주군에서 2마리, 8주 군에서 1마리의 감염이 인지되어 성적관찰에서 제 외하였다. 실험군 전체 2 1마리중 3마리( 1 4 % )의 감염율을 보였다. 감염이 인지되었던 3마리를 제외 한 모든 실험 동물에서 아킬레스건의 유합이 관찰되 었다. 다만 4마리의 토끼에서 아킬레스건 봉합부위 건이 1 cm 정도 늘어난 상태로 유합되어 있었다.
종골 절골부위도 감염이 있던 3례를 제외하면 모든 시험 동물에서 골 유합이 관찰되었다.
2. 조직학적 결과
1) 정상 Achilles 건
잘 분화된 교원질 다발(collagen bundle)이 종 방향(longitudinal direction)으로 배열되어 있으 며 교원질 다발 사이에는 건세포( t e n o c y t e )가 위치 하고 있었다. 건의 외측에는 덜 분화된 교원질과 혈 관이 풍부한 그물 모양의 조직( a r e o l a r )으로 덮여 있고, 내측에는 단층의 lining 세포로 덮혀 있었다 (Fig. 1A,B).
2) 이식 건의 변화 (1) 술후 4주
이식 건의 위축되어 있으며, 외측의 그물조직은 벗겨지며 소실되었다. 종방향으로 잘 분화되었던 교 원질 다발이 무정형( a m o r p h o u s )의 교원질로 변화
Fig. 1. (A, B) Microscopic findings of longitudinal section of Achilles tendon in normal control(A:×20, B:×100).
A B
되어 있으며, 건세포는 완전히 소실되어 이식된 건 은 무혈성 괴사(avascular necrosis)가 일어났다 는 것을 알 수 있다. 내측의 lining 세포도 소실되 었다(Fig. 1C,D).
(2) 술후 8주
이식 건 내에 혈관이 관찰되기 시작하여 괴사된 건에 혈관이 자라기 시작하고 교원질 사이에 새로운 세포들이 나타나기 시작하였다. 건의 외측에는 신생 조직이 나타나기 시작하고 있으나 이식 건의 중심부 는 아직도 원래의 건이 괴사된 상태가 남아 있다.
새로 나타난 세포는 대부분 방추형세포( s p i n d l e c e l l )로 건세포와 유사한 형태인데, 신생혈관 주위 에는 군데군데에 임파구로 추정되는 둥근 세포들이
관찰되었다. 그러나 조직 거부 반응을 시사할 만한 염증성 변화는 없었다(Fig. 1E,F).
(3) 술후 1 6주
이식 건은 완전히 새로운 건으로 대치( r e p l a c e ) 되어 있었으나 신생건 내에서는 많은 량의 혈관이 자라 들어간 것을 관찰할 수 있었다. 신생건은 상대 적으로 덜 분화된 양상으로 세포가 정상보다 훨씬 많은 수로 관찰되었으며, 교원질의 종방향 분화도 아직 이루어지지 않은 상태이었다. 혈관 주위에 군 데군데 임파구가 관찰되나 거부반응을 시사하는 염 증반응은 없었다(Fig. 1G,H).
Fig. 1. (C, D) Microscopic findings of longitudinal section of the grafted tendon at postoperative 4 weeks. Avascular necrosis of the tendon with loss of tenocytes and amorphous collagen was observed.
C D
Fig. 1. (E, F ) Microscopic findings of longitudinal section of the grafted tendon at postoperative 8 weeks.
Revascularization and spindle shaped cells were observed.
E F
고 찰
슬관절 인대재건술은 오랜 기간동안 꾸준히 발전 하여 최근에는 자가 슬개건-골 이식술이 가장 좋은 방법으로 받아 들여지고 있다(Noyes et al 1983, 1984, Bonamo et al. 1984). 그러나 자가 슬개 건-골 이식술은 공여조직이 제한되어 있다는 단점이 있어 동종건을 이용하는 방법이 모색되고 있다.
현대 동종건 이식술은 수술받고자 하는 슬관절에 더 이상의 조직 손상을 안주고 싶은 경우와 이미 인 대 재건술을 시행하여 반대측 슬개건을 사용한 병력 이 있는 경우에 동종건 이식하는 방법이 추천되고 있다. 동종건을 이용하는 재건술에서 예상되는 합병 증은 이식 건의 감염, 조직부적합성과 관계된 면역 학적 반응, 그리고 이식된 건의 생역학적 강도의 감 소등을 들 수 있다(Butler et al 1979, Shino et al. 1984).
동종골 이식후 감염에 대하여 Tomford 들은 동 종골 이식술후에 1 0 %라고 보고 하였는데, 본 연구 에서 감염율은 1 4 %로 다른 연구의 결과와 비슷하 였다.
최근의 동물실험 보고에 의하면 이식 건을 일정한 기간 냉동보관시켰다가 이식술을 시행하면 이식조직 의 면역성을 현전히 감소시켜 생역학적 강도를 유지 하면서 성공적인 이식이 가능하다고 보고하였다. 저 자들은 공여자의 인대를 채취한 즉시 - 8 0℃로 4주
간 보관시키는 Tomford 방법으로 냉동보관을 시행 하였다. 냉동보관은 4주 이상 1년이내 보관이 가능 한데 골수와 건의 항원성을 감소시켜 건유합과 골유 합을 촉진하고, 조직거부 반응을 감소시킨다고 보고 되고 있다. 본 실험에서도 감염이 있던 3마리를 제 외하면 모든 실험동물에서 건유합과 골유합을 얻을 수 있었으며 1 6주간 관찰하는 동안 조직 거부반응 은 관찰되지 않아 성공적인 이식이 가능하였다.
냉동보관으로 항원성이 감소하는 기전은 완전히 밝혀져 있지는 않다. 1986년 N i k o l a o u들은 급속 냉동과 녹임(freezing and thawing)으로 조직내 의 세포를 파괴시키고 결과적으로 세포표면의 조직 적합성 항원(histocompatibility antigen)을 무 력화시키는 효과를 얻게 되는데, 이 과정에서 교원 섬유의 구조적인 틀은 그대로 남아 생역학적 강도를 유지한다고 설명하고 있다. 본 실험에서는 세포면역 학적인 검사를 시행하지는 못하였으나, 이식된 건의 조직학적 소견을 관찰한 결과 이식 건에 거부반응을 시사하는 염증반응이 나타나지는 않았다.
동종건 이식술 후 건의 변화에 대하여 A r n o c z k y 들(1986), Noyes(1974)들은 개실험에서 이식 건 은 일단 무혈성 괴사에 빠지고 난후 재순환 ( r e v o s c u l a r i z a t i o n )이 되어 가면서 이식 건이 새 로운 건으로 대치가 된다고 보고하였다. 본 실험에 서도 4주에는 모든 이식조직이 무혈성 괴사되었고 8주에 신생혈관 이 자라 들어가며 새로운 건세포들
G H
이 침착되기 시작하여 1 6주에는 이식 건이 새로운 건으로 대치되는 소견을 보였다. 다만 술 후 8주까 지는 원래의 조직이 가진 종방향성을 유지하고 있었 으나 1 6주에는 종방향성을 거의 찾아보기 어려웠고 신생혈관이 자라들어가면서 교원질의 분화는 거의 없는 상태를 보였다.
이식 건의 강도에 대하여 많은 학자들은 냉동보관 으로 이식 건의 강도는 변화가 없어 정상 건의 9 6 %의 강도를 보인다고 보고하였다. 그러나 이식 술후 시간경과에 따른 변화에 대해서는 보고자들마 다 다르게 보고하고 있다.
J a c k s o n들( 1 9 9 3 )은 양을 이용한 동물실험에서 이식 건의 강도가 술후에 서서히 감소하여 1년에는 정상의 2 1 ~ 3 5 %로 약화된다고 보고하였으며, V a s s e u r들은 수술후 8 ~ 2 4주 관찰에서 정상건의 2 5 % ~ 5 9 %의 강도를 나타내었다고 보고하였다.
그러나 N i k o l a o u들은 개실험에서 수술후 3 6주 에 이식 건은 정상건의 9 0 %까지 강화된다고 보고 하였다. 본 실험에서 건의 강도를 알기 위한 인장시 험을 하지는 않았으나 신생조직의 교원질은 종방향 성이 아직 이루어져 있지 않아 생역학적으로 대단히 약화되었을 것이라는 것을 알 수 있었다.
이들의 결과를 참고로 판단해 볼 때 본 실험에서도 토끼를 장기간 추시하면 교원섬유의 종방향성의 회복 이 기대되며, 인장강도도 증가할 것으로 예상된다.
이것에 대해서는 계속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
결 론
슬관절의 십자인대 재건술에 이용되는 자가 슬개 건-골 이식술은 공여부의 건파열, 공여부 동통등의 합병증과 공여 조직이 제한되어 있다는 단점이 있 다. 또한 A r n o c z k y ( 1 9 8 6 )등은 동물실험에서 자 가건-골 이식술후 이식 건의 변화를 관찰한 결과, 이식편의 모든 세포가 죽고, 서서히 재순환이 되어 새로운 조직으로 대치된다고 보고하였다. 이 같은 사실은 건 재건술에서 자가 건 뿐 아니라 동종건 이 식술도 가능할 것이라는 사실을 시사하는 것이다.
동종 조직 이식술후의 성공 여부는 이식 조직의
조직 적합성( b i o c o m p a t a b i l i t y )에 따라 결정되는 데 건, 골과 같은 결체 조직 이식술에는 이식 조직 의 항원성을 낮추기 위해 이식편을 냉동처리 혹은 동결건조 하는 방법이 추천되고 있다.
이에 저자들은 토기에서 냉동 보관한 동종 건 이 식술후 이식 건의 변화를 관찰하기 위하여 본 실험 을 하였다.
체중 3.0 kg 내외의 건강한 흰토끼를 암수 구별 없이 2 8마리를 사용하였다. 아무런 조작을 하지 않 은 7마리를 대조군으로 하고, 실험군은 우측 족관절 부 종건(Achilles tendon)을 떼어 냉동시켰다가 4주 후 다른 토끼에 이식하는 수술방법을 선택하였 다. 실험 동물은 수술후 4주, 8주, 16주에 각각 7 마리씩 도살하여 육안적 관찰 및 조직학적 관찰을 하였다.
조직학적 결과에서 이식 건은 술후 4주에 종방향 으로 잘 분화되었던 교원질 다발이 무정형( a m o r- p h o u s )의 교원질로 변화되어 있으며 건세포는 완 전히 소실되어 이식된 건은 무혈성 괴사( v a s c u l a r n e c r o s i s )가 일어났다는 것을 알 수 있었다. 술후 8주에는 이식 건 내에 혈관이 관찰되기 시작하여 괴 사된 건에 혈관이 자라기 시작하고 교원질 사이에 새로운 세포들이 나타나기 시작하였다. 술후 1 6주 에는 이식 건은 완전히 새로운 건으로 대치 ( r e p l a c e )되어 있었으나 신생건 내에서는 많은 량 의 혈관이 자라 들어간 것을 관찰할 수 있었다. 신 생건은 상대적으로 덜 분화된 양상으로 세포가 정상 보다 훨씬 많은 수로 관찰되었으며, 교원질의 종방 향 분화도 아직 이루어지지 않은 상태이었다. 혈관 주위에 군데군데 임파구가 관찰되나 거부반응을 시 사하는 염증반응은 없었다.
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