Effects of Mixture of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus on the Change of HPA-Axis and Catecholamine System in the Forced Swimming Test

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Objectives : In this study the antidepressant effects of mixture of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus on the change of HPA -Axis and Catecholamine system was investigated

Methods : The forced swimming test was performed. The expression of CRF, c-Fos in the PVN, and TH in the VTA and LC were measured with immunohistochemical method. And the experimental groups were divided into the Extraction after Mix group(A) and Mix after Extraction group(B). The effects of both group were compared.

Results : The duration of immobility in the FST was decreased significantly in three groups except B100(P<0.01). B100 was shown the significant increase(P<0.05). The expression of CRF in

地骨皮와 梔子合劑가 강제수영부하실험에서 HPA-Axis와 Catecholamine system에 미치는 영향

오정진, 이태희

가천대학교 한의과대학 방제학교실

ABSTRACT

Effects of Mixture of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus on the Change of HPA-Axis and Catecholamine System in the

Forced Swimming Test

Jeong-Jin Oh, Tae-Hee Lee

Formulae Pharmacology Dept. School of Oriental Medicine, Ga-Chon University

5)

•교신저자 : 이태희

•경기도 성남시 수정구 성남대로 1342 가천대학교 한의과대학 방제학교실

•Tel : 031-750-5418 Fax : 031-750-5416

•접수 : 2012/ 05/ 30 수정 : 2012/ 06/ 13 채택 : 2012/ 06/ 15

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PVN was decreased significantly in all group(P<0.05〜P<0.01). The expression of c-Fos in PVN was decreased in A100, A400 and was increased significantly in B100, B400(P<0.05). The expression of TH in VTA and LC were decreased significantly in all group(P<0.001).

Conclusions : Effects of Extraction after Mix group(A) and Mix after Extraction group(B) on the HPA-Axis system and Catecholamine system were validated.

Key word : Mixture of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus, Extraction after Mix(A), Mix after Extraction(B), FST, HPA-Axis system, Catecholamine system

Ⅰ. 서 론

인체 내 스트레스 시스템은 어떤 종류의 스트 레스에 대한 유기체의 적응반응을 조정한다. 이러 한 인체 내 스트레스 시스템의 주요 구성요소는 corticotropin-releasing hormon(CRH) 및 locos coeruleus-norepinephrine(LC/NE)-autonomic system과 이들의 말초에 대한 영향들, 뇌하수체- 부신 축 및 자율시스템의 가지이다. 이런 스트레 스 시스템의 활성화는 항상성(Homeostasis)조절과 생존에 대한 기회를 증대시키고 유기체의 능력을 향상시키는 행동 및 주변 변화로 연계된다 ¹⁾ .

주요우울장애(Major depression)는 유전적, 발달 적, 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 발병되는 것으로서, 주요 특징은 우울한 기분(슬픔), 즐거움 을 경험할 수 있는 능력의 손상(melancholy, 울 증)이다. 그리고 수면 장애(불면 혹은 기면) 및 심한 피곤함이 매우 공통적으로 나타난다 ²⁾ .

우울증 episode가 많은 경우 다양한 형태의 스 트레스가 있는 정황에서 일어난다는 점은 비록 stress가 우울증을 일으키는 충분조건으로 작용하 지는 않을지라도 그것이 우울증 발현에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다. ³⁾ 이러한 관점에서

우리 몸에서 stress에 대응하는 중요한 요소인 HPA axis system과 catecholamine system은 우울 증 연구에 있어서 오랫동안 관심의 초점이 되어 왔다 ⁴⁾ .

韓醫學에서는 氣가 停滯되어 發散하지 못하는 증상을 총칭하여 鬱症이라고 하는데 鬱은 일반적 으로 氣鬱을 가리키며 이것은 抑壓되고 沈鬱한 마 음으로 인하여 모든 生理기능이 沈滯되는 현상으 로서 肝氣鬱結이 대표적이다. 이는 발산할 수 없 는 欲求不滿이나 지속되는 憂愁, 지나친 思慮나 悲嘆등이 원인되는 수가 많다 ⁵⁾ . 肝氣鬱結이란 정 신적 긴장과 정서의 과도한 변화로 肝의 疎泄 작 용이 失調되고 氣血이 鬱滯되어 나타나는 병리적 현상으로서, 현대의학적 의미로는 스트레스로 인 해 뇌하수체와 부신피질에서 호르몬의 분비가 촉 진되어 혈압 상승, 맥박 증가, 체온 상승 등의 자 율 신경계 실조 증상으로서 나타내는 것이라 할 수 있다 ⁶⁾ .

조와 이 ⁷⁾ 는 이러한 病症에 주로 사용하는 柴胡

抑肝湯에 抗憂鬱 효과가 있다고 보고하였는데 柴

胡抑肝湯은 柴胡, 赤芍藥, 牧丹皮, 靑皮, 地骨皮,

香附子, 梔子, 蒼朮, 神曲, 川芎, 連翹, 生地黃, 甘

草로 구성되어 있다.

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그 중 地骨皮(Lycii Radicis Cortex)는 味가 甘淡하고 性은 寒하며 淸熱凉血, 退虛熱하는 효능 을 가지고 있어 骨蒸潮熱을 다스리는 대표적인 藥 으로 사용하여 왔다. 梔子(Gardeniae Fructus)는 味가 苦하고 性은 寒하며 淸熱瀉火, 涼血解毒하는 효능을 가지고 있어 濕熱로 인한 黃疸 등 각종 炎症을 치료하며 熱毒으로 인한 煩燥 등을 다스리는 데 널리 쓰이고 있다 ⁸⁾ .

이와 같은 地骨皮와 梔子의 抗憂鬱 효과에 대 한 보고로 高와 李 ⁹⁾ , 具와 李 ¹⁰ 는 地骨皮를 이용한 실험에서 CRF와 c-Fos, TH 발현 억제를 통해 抗憂鬱 작용을 보고하였으며, 朴과 李 ¹¹⁾ 는 梔子를 이용한 실험에서 TH와 ACTH의 억제 작용을 통 해 抗憂鬱 작용이 있음을 보고하였다.

이에 저자는 柴胡抑肝湯의 구성약물인 地骨皮 와 梔子가 각각 抗憂鬱 작용을 나타난 것을 보고 方劑는 개별 약재의 合劑이므로 地骨皮와 梔子合劑(합제 후 추출과 추출 후 합제)가 憂鬱행동에 미치는 효능을 확인하기 위해 흰쥐에게 강제 수영 부하시험을 실시하여 행동변화를 살펴보았다.

만성적인 스트레스 상황 즉 憂鬱症에서는 HPA 체계가 실조 상태가 되어서, 병리생리학적인 변화 가 초래되게 되는데, 이것은 결국 주요 우울증 등 의 여러 다양한 질병들을 야기하게 된다 ¹²⁾ . 그래 서 免疫化學法으로 HPA axis와 관련하여 시상하 부의 실방핵(Para-Ventricular Nucleus, PVN)에서 CRF(Corticotropine-Releasing Factor)와 c-Fos의 발현을 측정하였다. Catecholamine계에 미치는 영 향을 확인하기 위하여 복측피개야(Ventral Tegmental Area, VTA)와 청반(Locus Coeruleus, LC)에서 dopamine과 norepinephrine의 대사에 관여하는 것 으로 알려진 TH(Tyrosine Hydroxylase)를 측정하 였다. 이에 유의성 있는 결과를 얻어서 보고하는 바이다.

Ⅱ. 실험재료 및 방법

1. 실험 재료 1) 실험동물

중량 200g 내외의 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐 (Orien사)를 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후, 실험에 사용 하였다. 낮과 밤 주기는 오전 7시에서부터 오후 7 시까지를 낮으로, 다른 12시간을 밤으로 하여 자 동 조절하였다. 그리고 온도는 20∼24℃, 습도는 60±10%로 유지하였다.

2) 한약재

연구에 사용한 한약재는 地骨皮(Lycii Radicis Cortex)와 梔子(Gardeniae Fructus)를 HMAX사 (제천, 충북)에서 구입하였다. 합제 후 추출(Extraction after Mixture)을 A라 하고, 추출 후 합제(Mixture after Extraction)를 B라고 하였다. 柴胡抑肝湯에 서 1錢은 4g으로 환산하였다.

(1) 地骨皮와 梔子 합제 후 추출(Extraction after Mix: A)

柴胡抑肝湯에서의 비율에 따라 地骨皮와 梔子 를 각 200g씩 400g을 Round Flask에 넣고 10배 (w/v)량의 증류수를 가해 환류 추출한 다음 동결 건조하였다.

(2) 地骨皮와 梔子 추출 후 합제(Mix after Extraction: B)

地骨皮 400g, 梔子 400g을 10배(w/v)량의 증류 수에 가하여 환류 추출한 다음 동결 건조하였다.

地骨皮는 19.65g, 梔子는 54g으로 추출되어 각각 4.91%, 13.5%의 수득율을 보였다. 합제는 柴胡抑肝湯에서의 地骨皮와 梔子양의 비율대로 1:1의 비 율이 되게 합했다.

투약할 때에는 건조된 약재를 분량에 맞게

saline을 첨가하여 용액을 만들었다.

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2. 실험 방법 1) 실험군

실험은 두 단계로 나뉘어 실시하였으며 대조군 및 地骨皮와 梔子 합제 후 추출 100mg/kg 투여군 (A100), 地骨皮와 梔子 합제 후 추출 400mg/kg 투여군(A400), 地骨皮와 梔子 추출 후 합제 100 mg/kg 투여군(B100), 地骨皮와 梔子 추출 후 합 제 400mg/kg 투여군(B400)의 다섯 그룹으로 나누 어 실시하였으며, 약물은 15분간의 pre-swimming test를 실시한 다음 본 실험에 맞추어 실험 시작 24시간 전, 5시간 전, 1시간 전 등 총 3회에 걸쳐 구강(p. o.)으로 강제 투여하였다.

2) 강제수영부하실험

본 실험에서는 절망행동검사(Behavioral despair test)라고도 하는 표준화된 검사법인 FST를 이용

하였다 ^13,14) . 이 검사법은 약물개발시의 抗憂鬱 효

과를 검색하는 기본적인 실험으로 알려져 있다.

이 실험은 적응실험과 본 실험 두 번으로 나누어 실시하였다. 적응실험은 높이 50cm, 지름 20cm이 투명한 아크릴 원통형 수조에 30cm 높이로 22℃

의 물을 채워, 흰쥐의 꼬리가 바닥에 닿지 않을 정도의 물높이에 강제로 빠뜨린 다음 15분간 있게 하였다. 적응실험 24시간 후에는 본 실험을 실시 하였는데, 5분간 같은 환경에서 강제 수영을 시키 고, 여기서 기어오르기(climbing), 수영(swimming), 부동(immobility) 세 가지를 측정한다. 전형적인 부동(immobility)이란 흰쥐가 얼굴을 포함한 상체 의 일부분만 수면위로 드러낸 채 몸의 균형을 유 지하기 위하여 약간의 움직임만을 나타낼 뿐 물 위에 떠 있는 상태이다. 한편, 수영(swimming)은 흰쥐가 수면 위를 돌면서 움직이고, 간혹 물밑으로 잠수하기도 하는 상태이다. 기어오르기(climbing) 는 가장 격렬한 운동 상태인데, 앞발을 적극적으 로 사용하여 아크릴 원통위로 올라오려고 사지를 다 쓰는 상태이다. 실수와 사람에 의한 오차를 줄 이기 위해 비디오카메라로 측정하여 자료를 확보 하였다.

Pre-swimming test(For 15min)

↓

1st drugs treatment(After pre-swimming) before 24hrs

↓

2nd drugs treatment before 5hrs

↓

3rd drugs treatment before 1hr Swimming test(For 5 min) ↓

Fig. 1. Experimental Scheme of the Forced Swimming Test

3) 면역조직화학법 (1) CRF 발현측정 ¹⁵⁾

강제수영 부하시험이 끝난 흰쥐를 Sodium Pentobarbital(80mg/kg, i.p.)로 마취시킨 후 0.9%

Saline 200ml에 이어 Phosphate Buffer로 준비한 4% Formalin 용액 100ml를 심장을 통해 관류하였 다. 고정액의 처음 300ml는 2분간, 나머지 700ml는 25분간에 걸쳐 관류하였다. 고정이 끝난 쥐는 뇌 를 꺼내 같은 고정액으로 2시간 후 고정시키고 20% Sucrose가 함유된 Phosphate Buffered Saline (PBS)에 넣어 4℃에서 보관하였다. 다음날 뇌를 급속 냉각한 후 뇌 조직을 30㎛의 두께로 잘랐다.

PBS로 몇 차례 씻고, CRF expression에 가장 널리 사용되는 Goat anti-CRF(Santa Cruz Biotechnology., Santa Cruz., CA., USA)에 담구었다. Primary Antibody는 0.3% Triton-X100(PBST)에서 2%

Normal Donkey Serum과 0.001% Keyhole Limpet

Hemocyanin으로 2000배 희석하여 준비하였다. 뇌

조직은 Primary Antiserum에서 72시간 배양하였

다. 그 후 뇌 조직을 PBST로 씻은 다음, 2시간

동안 실온에서 2% Normal Donkey Serum을 함유

하는 PBST에서 200배로 희석한 Biotinylated Goat

Anti-Goat Serum(Santa Cruz Biotechnology., Santa

Cruz., CA., USA)에 반응시켰다. PBST로 씻은 다

(5)

음 뇌 조직은 실온에서 1시간동안 Vectastain ABC Reagent(Vectastain, Sigma., Saint Louis., MO., USA)에 담구어 반응시켰다. PBST로 몇 번 헹군 다음, 뇌 조직을 착색제인 Diaminobenzidine을 사 용하여 발색시켰다. 발색이 끝난 조직은 slide에 올려 2시간동안 실온에서 건조시킨 후, Xylene으 로 투명하게 하여 Polymount로 봉입하였다. 뇌 조 직의 각 부위는 염색성을 광학 현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위 의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도 ¹⁶⁾ 를 참고하였다. 현상된 사진에서 격자(2×2 cm)를 이 용하여 동일한 지역에서, 일정한 영역에 반응되어 나타난 염색성의 정도를 counting하였다.

(2) c-Fos 발현 측정 ¹⁵⁾

강제수영 부하시험이 끝난 흰쥐를 Sodium Pentobarbital(80mg/kg. i.p.)로 마취시킨 후, 0.9%

Saline 200ml에 이어 Phosphate Buffer로 준비한 4% Formalin 용액 100ml을 심장을 통해 관류하였 다. 고정액의 처음 300ml은 2분간, 나머지 700ml은 25분간에 걸쳐 관류하였다. 고정이 끝난 쥐는 뇌 를 꺼내 같은 고정액으로 2시간 후 고정시키고, 20% Sucrose가 함유된 Phosphate Bufferd Saline (PBS)에 넣어 4℃에서 보관하였다. 다음날 뇌를 급속냉동한 후 뇌 조직을 30um의 크기로 잘랐다.

PBS 로 몇 차례 씻고, c-Fos expression에 가장 널리 사용되는 Rabbit anti c-Fos(Santa Cruz Biotechnology., Santa Cruse., CA., USA)에 담구었다. Primary Antibody는 0.3% Triton X100(PBST)에서 2%

Normal Goat Serum과 0.001% Keyhole Limpet Hemocyanin으로 2000배 희석하여 준비하였다. 뇌 조직은 Primary Antiserum에서 72시간 배양하였 다. 그 후 뇌 조직을 PBST로 씻은 다음, 2시간 동안 실온에서 2% Normal Goat Serum을 함유하 는 PBST에서 200배로 희석한 Biotinylated Goat anti-Rabbit Serum(Santa Cruz Biotechnology., Santa Cruz., CA., USA)에 반응시켰다. 다시 PBST로 씻 은 다음 뇌 조직은 실온에서 1시간 동안 Vectastain

ABC Reagent(Vectastain., Sigma., Saint Louis., MO., USA)에 담구어 반응시켰다. PBST로 몇 번 헹군 다음 뇌 조직을 착색제인 Diaminobenzidine 을 사용하여 발색시켰다. 발색이 끝난 조직은 slide에 올려 2시간 동안 실온에서 건조시킨 후, Xylene으로 투명화시켜 Polymount로 봉합하였다.

뇌 조직의 각 부위는 염색성을 광학 현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도

16) 를 참고하였다. 현상된 사진에서 격자(2×2 cm) 을 이용하여 동일한 지역에서 일정한 영역에 반응 되어 나타난 염색성의 정도를 counting하였다.

(3) TH(Tyrosine Hydroxylase) 발현 측정 ¹⁷⁾ 강제수영 부하시험이 끝난 흰쥐를 Sodium Pentobarbital(80 mg/kg. i.p.)로 마취시킨 후, 0.9% Saline 200ml에 이어 Phosphate Buffer로 준 비한 4% Formalin 용액 100ml을 심장을 통해 관 류하였다. 고정액의 처음 300ml은 2분간, 나머지 700ml은 25분간에 걸쳐 관류하였다. 고정이 끝난 쥐는 뇌를 꺼내 같은 고정액으로 2시간 후 고정시 키고, 20% Sucrose가 함유된 Phosphate Buffered Saline(PBS)에 넣어 4℃에서 보관하였다. 다음날 뇌를 급속 냉동한 후 뇌 조직을 30㎛의 크기로 잘 랐다. PBS로 몇 차례 씻고, TH expression에 가장 널리 사용되는 Mouse anti-Tyrosine Hydroxylase (Zymed Laboratories, San-Francisco, CA., USA)에 담구었다. Primary Antibody는 0.3% Triton-X100 (PBST)에서 2% Normal Goat Serum과 0.001%

Keyhole Limpet Hemocyanin으로 2000배 희석하 여 준비하였다. 뇌 조직은 Primary anti-Serum에 서 72시간 배양하였다. 10% BSA Buffer에 10%

Mouse FITC 2nd Antibody를 실온에서 2시간 배 양한 후, 형광 Mountant를 이용하여 봉입하였다.

뇌 조직의 각 부위는 염색성을 형광 현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도

16) 를 참고하였다. 현상된 사진에서 격자(2×2 cm)

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를 이용하여 동일한 지역에서 일정한 영역에 반응 되어 나타난 염색성의 정도를 counting하였다.

4) 통계처리

모든 측정값은(평균값±표준오차)로 표시하였고, 각 실험군의 통계학적 분석은 window용 SPSS 15.0를 이용하였다. 행동실험 결과 및 면역조직화 학법에 대한 통계분석은 one-way ANOVA로 분석 하였으며, 집단 간 차이분석을 위해 사후 검정은 LSD를 통해 검증하였으며, P값이 0.05미만인 것 을 통계적으로 유의한 것으로 인정하였다.

Ⅲ. 실험 결과

1. 강제수영 부하실험

FST의 결과는 Fig. 2와 같다. Control에서 부동 행동이 4.5±0.65 sec를 나타낸 것과 비교해서 A100 에서는 2.83±0.87 sec, A400에서는 3.33±1.61 sec를 나타내고 B100에서는 5.5±2.94 sec, B400에서는 2.4

±1.18 sec로 나타나 B100에서 부동행동이 유의성 있게 증가하였고 그 외 나머지 그룹에서는 유의성 있게 감소하였다[Clim : F(4,31)=7.027, P<0.001 / Swim :F(4,31)=8.086, P<0.001 / Imo :F(4,31)=

5.789, P<0.01].

Fig. 2. Effect of Mixture of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus in the Forced Swimming Test.

Saline and Mixture of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus was ingested intragastically 24hrs, 5hrs, 1hr before the FST. Behaviors of the rodents were tested in the FST.

Value are presented as Mean ± S.E. of 6 animals/group.

Control group was ingested with normal saline. A100 was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). A400 was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg).

B100 was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). B400 was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg).

* : Significant difference compared with the control group(* : P<0.05)

** : Significant difference compared with the control group(** : P<0.01)

*** : Significant difference compared with the control group(***: P<0.001)

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Fig. 3. Effect of Mixture of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus in the Forced Swimming Test.

Saline and Mixture of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus was ingested intragastically 24hrs, 5hrs, 1hr before the FST. Behaviors of the rodents were tested in the FST.

Value are presented as Mean ± S.E. of 6 animals/group.

Control group was ingested with normal saline. A100 was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). A400 was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg).

B100 was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). B400 was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg).

2. 면역조직화학법 결과

1) 실방핵(PVN)에서 CRF 발현

FST 실시 후, PVN 내에서의 CRF를 발현한 세포 수는 Fig. 4, Fig. 5.와 같다. Control에서는 5±0.71, A100에서는 3±0.41, A400에서는 2.75±0.48,

B100에서는 3.5±0.29, B400에서는 2.5±0.29로 나타 나 모든 실험군에서 PVN내에서의 CRF의 발현이 유의성 있게 감소되었고 특히 B400에서 더욱 감 소되었음을 알 수 있었다[F(4,19)=4.647, P<0.05〜

P<0.01].

Fig. 4. Expression of CRF- immunoreactive cells in the PVN.

Saline and Mixture of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus were ingested intragastically at 24hrs, 5hrs, 1hr before the FST.

Expression of CRF was measured after the FST.

Values are presented as Mean ± S.E. of 4 animals/group.

Control group was ingested with normal saline. A100 was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg).

A400 was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg). B100 was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). B400 was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg).

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Fig. 5. Photograph of CRF-immunoreactive cells in the PVN (scale bar represent 200 um).

A(Control group) was ingested with normal saline. B(A100) was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). C(A400) was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg). D(B100) was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/gk). E(B400) was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg) and the FST.

2) 실방핵(PVN)에서의 c-Fos의 발현

FST 실시 후, PVN 내에서의 c-Fos 발현 세포 수는 Fig. 6, Fig. 7과 같다.

Control에서는 14.20±1.59, A100에서는 9.71±1.46,

A400에서는 10.63±1.88, B100에서는 24.25±2.78, B400 에서는 25.80±4.41로 나타나 A100, A400에서는 감 소하고 B100, B400에서는 증가하는 변화를 볼 수 있었다[F(4,28)=9.294, P<0.001].

Fig. 6. Expression of c-Fos-immunoreactive cells in the PVN.

Saline and Mixture of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus were administered intragastically at 24hrs, 5hrs, 1hr before the FST.

Expression of c-Fos was measured after the FST.

Control group was ingested with normal saline. A100 was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). A400 was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg). B100 was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). B400 was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg) and the FST.

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Fig. 7. Photograph of c-Fos-immunoreactive cells in the PVN(scale bar represents 200um).

Control group(A) was ingested with normal saline. A100(B) was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). A400(C) was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg). B100(D) was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). B400(E) was ingested with Mix after Extracion of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg) and the FST.

3) 복측피개야(VTA)와 청반(LC)에서의 TH 발현 FST실시 후 VTA와 LC내에서의 TH발현 세포 수는 Fig. 8, Fig. 9, Fig. 10과 같다. VTA에서는 Control에서 27.0±0.9, A100에서 13.6±1.20, A400에 서 18.5±0.70, B100에서 16.3±0.60, B400에서 18.6±

0.80을 나타내 A그룹과 B그룹 모두 감소하였는데 농도에 비례하여 약간 증가하는 모습을 보였다.

LC 에서는 Control에서 14.2±1.0, A100에서는 6.0±

1.20, A400에서는 5.0±0.70, B100에서는 5.1±0.50, B400에서는 6.2±0.50을 나타냄으로서 TH의 발현 이 모두 감소하였는데 A그룹은 농도에 비례하여 더 감소하고 B그룹은 농도에 비례하여 약간 증가 하는 모습을 보였다[VTA: F(4,38)=10.559, P<0.001, LC: F(4,34)=22.402, P<0.001].

Fig. 8. Expression of TH-immunoreactive cells in the VTA and LC.

Expression of TH in VTA was measured after the FST.

Saline and Mixture Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus were administered intragastically at 24hrs, 5hrs, 1hr before the FST.

Control group was ingested with normal saline. A100 was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). A400 was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg). B100 was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). B400 was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg).

*** : Significant difference compared with the control group(***: P<0.001)

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Fig. 9. Photograph of TH-immunoreactive cells in the VTA.(scale bar represents 200um).

A(Control group) was ingested with normal saline. B(A100) was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). C(A400) was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg). D(B100) was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). E(B400) was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg).

Fig. 10. Photograph of TH-immunoreactive cells in the LC.(scale bar represents 200um).

A(Control group) was ingested with normal saline. B(A100) was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). C(A400) was ingested with Extraction after Mix of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg). D(B100) was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(100 mg/kg). E(B400) was ingested with Mix after Extraction of Lycii Radicis Cortex and Gardeniae Fructus(400 mg/kg).

Ⅳ. 고 찰

臨床에서 兩脇脹痛 혹은 刺痛, 乳房脹痛, 躁急易怒, 혹은 精神抑鬱, 食慾不振, 月經不調 등의 증 상으로 나타나는 肝氣鬱結 ¹⁸⁾ 에 적용되는 대표적인

처방인 柴胡抑肝湯은 매우 효과적인 항스트레스 작용을 가지고 있으며 <醫學入門婦人玉尺>에 수 록되어 있다 ¹⁹⁾ .

이 柴胡抑肝湯에 대한 실험으로는 金과 李 ²⁰⁾ 가

구속 스트레스에 노출된 생쥐에서 상승된 혈중

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corticosteron 농도를 감소시키는 유의한 효과를 보 았으며, 安과 李 ²¹⁾ 는 柴胡抑肝湯의 항스트레스 효 과로서 신경전달물질에 대한 작용을 보고하였고, 朴과 李 ¹¹⁾ 는 스트레스로 인한 기억력 저하와 우울 행동을 억제하는 효과가 있다고 하였다.

地骨皮와 梔子는 柴胡抑肝湯의 구성약물로서 모두 火와 熱을 다스리는 작용을 가지고 있다. 地骨皮에 관해서는 高와 李 ⁹⁾ 의 地骨皮가 VTA와 LC에서 TH의 발현을 억제시킴으로서 抗憂鬱 작 용을 가진다는 보고가 있었고, 具와 李 ¹⁰⁾ 는 地骨皮가 HPA-Axis system에서 유의한 억제작용을 하 여 抗憂鬱 효과가 있다는 보고를 하였으며, 成 등

22) 은 地骨皮가 解熱과 血壓降下작용에서 모두 유 의성 있다고 보고하였다.

梔子에 관해서는 朴과 李 ¹¹⁾ 가 梔子가 PVN에서 의 CRF발현과 c-Fos의 발현, 그리고 VTA와 LC 에서 TH의 발현을 억제하는 抗憂鬱 효과가 있음 을 보고하였다.

위와 같이 地骨皮와 梔子 각각의 약물에 대한 보고는 있지만 합제방식에 대한 연구는 없어 저자 는 흰쥐의 우울 행동에 미치는 효과를 살펴보려고 地骨皮와 梔子를 합제 후 추출하여 흰쥐의 抗憂鬱 효과를 확인했다. 본 연구에서는 흰쥐의 우울행동 을 유발하기 위하여 FST를 사용하였는데, 이 실 험방법은 우울증의 동물모델로 널리 쓰이고 있다.

본 실험의 결과를 보면 FST에서 地骨皮와 梔子合劑(A100, A400, B100, B400)를 투여했을 때, B100을 제외한 나머지 실험방법에서 흰 쥐의 부 동행동이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러 나 朴과 李 ¹¹⁾ 가 FST를 실시하여 부동행동 시간을 관찰한 바 梔子투여군이 대조군에 비해 유의성 있 게 감소하다가 오히려 고농도 즉 A400에서 증가 하였음을 보고하였고, 高와 李 ⁹⁾ , 具와 李 ¹⁰⁾ 에서는 地骨皮의 FST에서 부동행동이 농도에 비례하여 더 감소함을 보고하였다.

그런데 본 실험에서는 A방법에서 부동행동이 농도에 비례하여 약간 증가하였고, B방법에서 농

도에 비례하여 더 감소하는 경향이 보였다. 그러 므로 A방법에서는 梔子의 효능이 주도적이고 B방 법에서는 地骨皮의 효능이 주도적인 것으로 사료 된다.

스트레스에 대한 적응반응은 크게 두 가지 과 정을 거쳐 신체에 작용한다. 하나는 sympatho- adrenergic-noradrenergic system(SAN)이고, 다른 하나는 limbic-hypothalamo-pituitary-adrenal system (L-HPA)이다 ¹²⁾ .

SAN 체계는 adrenaline 생합성 및 adrenaline과 noradrenaline의 분비인데, 이는 중추신경계의 청 반핵(nucleus locus coeruleus)과 자율신경계의 교 감신경계 분절에 의해서 각각 규제된다. L-HPA체 계는 HPA Axis 및 이와 함께 연관되어 있는 소 뇌 편도체(amygdala)와 해마(hippocampus)와 같 은 변연계를 포함한다. SAN체계와 L-HPA 체계 는 서로 촉진하는 작용에 참여하므로 한 체계의 활성화는 다른 체계의 활성화를 일으키게 된다 ²³⁾ .

우울증에서는 HPA Axis의 기능이 항진되며 혈 중 cortisol의 농도가 높고 해마에 있는 cortisol 수 용체 장애가 발견되기도 한다 ²⁴⁾ .

본 실험에서는 地骨皮와 梔子 합제가 FST에서 흰쥐의 우울 행동을 억제하는 것이 HPA Axis와 Catecholamine계와 관련 있는지를 확인해 보기 위 해 각각 시상하부의 PVN에서 CRF, c-Fos의 발현 과 VTA와 LC에서 TH의 발현을 측정해 보았다.

본 연구에서 CRF와 c-Fos 발현물질을 관찰했던 PVN은 우울증에 반응하는 부위로서, corticotropin -releasing factor(CRF)를 분비하는 뉴런이 집중되 어 있으므로 우울증 반응연구에 객관적인 지표가 되고 있다 ²⁵⁾ . CRF는 시상하부 및 변연계의 여러 신경핵 등에서 분비되며 ²⁶⁾ CRF를 흰쥐의 뇌실 내 에 주입한 후 HPA-Axis가 항진된다는 보고 ²⁷⁾ 도 있었다.

c-Fos 단백질은 여러 약물이나 스트레스를 포함

한 생리적 자극에 의하여 초기에 발현되므로 스트

레스 및 스트레스와 관련된 우울증 연구에서 자주

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관찰되는 지표이다 ²⁸⁾ .

본 실험의 결과 PVN에서의 CRF 발현은 대조 군보다 유의성 있게 감소하는데 합제 후 추출한 A방법과 추출 후 합제한 B방법 모두에서 농도에 비례하여 더 감소하는 경향을 보였다. 이는 具와 李 ¹⁰⁾ 가 보고한 바에 의하면 地骨皮가 PVN내에서 의 CRF 발현을 농도에 비례하여 더 감소시킨 경 향을 보인 데 반해 朴과 李 ¹¹⁾ 의 보고에 의하면 梔子가 오히려 농도에 비례하여 약간 증가하는 경향 을 보인 것과 비교가 가능하다. 그러므로 PVN내 에서의 CRF 발현에 대한 효과에서는 梔子보다 地骨皮의 효능이 더 주도적인 것으로 사료된다.

PVN에서 梔子는 朴과 李 ¹¹⁾ 에서와 같이 대조군 보다 c-Fos의 발현이 처음에는 감소하였다가 농도 에 비례하여 약간 증가하였다고 보고되었고, 地骨皮는 具와 李 ¹⁰⁾ 에서와 같이 대조군보다 c-Fos의 발현이 감소하는데 농도에 비례하여 더 감소하였 다고 보고되었다. 그런데, 본 연구에서는 c-Fos의 발현이 A100과 A400에서 대조군보다 감소하지만 A400에서 A100보다 증가하는 경향을 보이고 있고, B100과 B400에서 대조군보다 증가하는데 농도에 비례하여 더 증가하는 경향을 보이므로 A, B방법 모두 梔子의 효능이 주도적인 것으로 사료된다.

憂鬱症 상황에서는 도파민의 수준은 감소하고 상대적으로 도파민 대사에 관여하는 TH의 수준은 증가하는 현상이 보고된 바 있다 ²⁹⁾ .

VTA신경세포들은 도파민계 대사에 관여하는데 VTA에서의 TH발현은 우울증에 관여하는 도파민 대사를 조절하는 중요한 요소이다 ³⁰⁾ . LC는 뇌간에 위치하고 憂鬱症에 행동학적, 생리학적으로 반응 하는 세포핵으로서 감정적 질환과 연관된다고 한 다 ³¹⁾ . LC는 抗憂鬱劑 효과를 평가하는데 주로 이 용되며 이곳에서의 TH의 조절 정도가 실험에서 흔히 이용된다. TH는 여러 신경전달물질에 의해 조절되며, 여러 protein kinase에 의한 인산화 과정 을 통해 여러 신경활동을 갖는다 ³²⁾ .

본 실험의 결과 VTA에서의 TH발현은 합제 후

추출(A)과 추출 후 합제(B) 모두 전체적으로 감 소하였는데 A방법과 B방법 모두 농도에 비례하여 약간 증가하는 경향을 보였다. 이는 高와 李 ⁹⁾ 의 地骨皮가 VTA에서 TH발현을 억제하는데 농도에 비례하여 더 증가한다는 보고와 유사하였다. 반면 朴과 李 ¹¹⁾ 에서 梔子는 VTA에서 TH 발현을 억제 시키는데 감소시키는 경향을 보인다고 보고하였 다. 따라서 A, B 방법 모두 VTA에서 TH발현에 대한 효과에서는 地骨皮의 효능이 주도적이다.

본 실험에서 LC에서의 TH발현은 합제 후 추 출한 A방법과 추출 후 합제한 B방법 모두 감소하 는 경향을 보였는데 A방법은 농도에 비례하여 더 감소하는 경향을 보였고 B방법은 농도에 비례하 여 약간 증가하는 경향을 보였다. 이는 高와 李 ⁹⁾ 가 地骨皮가 LC에서 TH의 발현을 억제시키지만 농도에 비례하여 약간 증가하는 경향을 보고하였 고 또한 朴과 李 ¹¹⁾ 는 梔子가 LC의 TH의 발현을 관찰한 실험에서 농도에 비례하여 더 감소하는 결 과를 보고한 바와 비교할 수 있었다. 그러므로 본 실험과 비교해볼 때 A방법에서는 梔子의 효능이 주도적이고, B방법에서는 地骨皮의 효능이 주도적 인 것으로 사료된다.

본 연구를 종합하면 강제수영검사에서의 부동 행동의 지속시간(FST)은 A방법에서는 梔子의 주 도적인 영향을 보였고 B방법에서는 地骨皮의 주 도적인 영향을 보였으며, PVN에서의 CRF의 발현 은 모든 방법에서 地骨皮의 주도적인 영향을 보였 다. 또한, PVN에서의 c-Fos의 발현은 모든 방법 에서 梔子의 주도적인 영향을 보였으며, VTA의 TH발현은 모든 방법에서 地骨皮의 주도적인 영향 을 보였고, LC에서의 TH발현은 A방법에서는 梔子의 주도적인 영향을 보였고 B방법에서는 地骨皮의 주도적인 영향을 보였음을 알 수 있다.

이상과 같은 실험결과로 볼 때 합제방식에 따

라, 항목별로 주된 영향을 미치는(지배적인 효과

를 발휘하는) 약물이 각각 다름을 알 수 있었고

이는 개별약물의 합제가 발현하는 서로 다른 기전

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을 설명하는 것으로 처방배합의 이유를 설명할 수 있는 데이터로 사료된다.

Ⅴ. 결 론

地骨皮와 梔子 합제[합제 후 추출(A100, A400), 추출 후 합제(B100, B400)]가 흰쥐의 우울행동에 미치는 효과를 알아보기 위해 FST를 실시하여 행 동변화에 미치는 영향을 살펴보고, 면역조직화학 법으로 FST가 끝난 흰쥐의 시상하부의 PVN에서 CRF와 c-Fos의 발현을 측정하였으며 면역조직화 학법으로 VTA와 LC에서 TH를 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 강제수영검사에서의 부동행동의 지속시간은 B100 을 제외한 나머지 세 방법에서 유의성 있게 감 소했다(P<0.01). B100에서는 유의성 있게 증가 하였다(P<0.05).

2. PVN에서의 CRF의 발현은 A, B 모든 방법에 서 유의성 있게 감소하였다(P<0.05〜P<0.01).

3. PVN에서의 c-Fos의 발현은 A, B 모든 방법에 서 유의성 있게 감소하였다.(P<0.05).

4. VTA와 LC에서의 TH발현은 A, B 모든 방법에 서 유의성 있게 감소하였다(P<0.001)

地骨皮와 梔子 합제가 HPA-Axis system과 Catecholamine system의 경로를 통하여 抗憂鬱 효 과를 나타내고 합제 후 추출 약물(A)과 추출 후 합제 약물(B)의 영향은 합제의 방식에 따라 항목 별로 다른 영향을 미치는 것으로 사료된다.

참고문헌

1. Constantine sigos, George P. Chrousos Hypothalamic -pituitary-adrenal axis, neuroendocrine factors and stress, Journal of Psychosomatic Research.

2002;53:865-71.

2. Millan MJ. Multi-target strategies for the improved treatment of depressive states:

Conceptual foundations and neuronal substrates, drug discovery and therapeutic application.

Pharmacology & Therapeutics. 2006;110:135-370.

3. Sapolsky, R.M. L.M. Romero. and A.U. Munck.

How do glucocorticoids influence stress responses?

Integating permissive, suppressive, stimulatory and preparative actions. Endocr. Rev. 2000;

21(1):55-89.

4. 이새봄, 곽용도, 안홍을, 박상기. 우울증과 항우 울제의 분자신경생물학. Molecular and Cellular Biology News. 2007;19(4):30.

5. 조홍건 편저. 실용한방정신의학. 서울:유진문화 사. 2002:184-90.

6. 대전대학교 한의과대학 병리학교실. 동의병리학.

서울:한의문화사. 1991:8-9.

7. 조용국, 이태희. 시호억간탕이 스트레스로 인한 기억저하와 우울행동에 미치는 영향. 대한한의 학방제학화지. 2007;15(2):147-60.

8. 이상인, 안덕균, 신민교, 노승현, 이영종, 김선희 편저. 한약임상응용(2판). 서울:성보사. 1990:92-3, 111-2.

9. 고동균, 이태희. 地骨皮가 스트레스로 인한 기 억저하와 우울행동에 미치는 영향. 대한본초학 회지. 2008;23(4):59-70.

10. 구범모, 이태희. 지골피가 강제수영부하실험에 서 HPA-Axis system에 미치는 영향. 대한한 의학 방제학회지. 2010;18(2):215-25.

11. 박찬혁, 이태희. 梔子가강제수영부하시험에서 Corticotropin-Releasing Factor, c-Fos와 Tyrosine Hydroxylase에 미치는 영향. 대한한의학방제 학회지. 2009;17(1):163-73.

12. Tafet GE, Bernardini R. Psyconeuroendocrinological links between chronic stress and depression.

Progress in Neuro-Psychophamacology &

(14)

Biological Psychiatry. 2003;27:893-903.

13. Porsolt RD, Bertin A, Jalfre M. Behavioral despair in rats : A new model sensitive to antidepressant treatment. European Journal of Pharmacology. 1978;47(4):379-91.

14. Arthur H Swiergiel, Yueping Zhou, Adrian J Dunn. Effects of chronic footshock, restraint and corticotropinreleasing factor on freezing, ultrasonic vocalization and forced swim behavior in rats. Behaviroal Brain Research. 2007;183 :178-87.

15. Malgorata Lehner, Ewa Taracha, Anna Skorzewska, Danuta Turzynska. Expression of c-Fos and CRF in the brains of rats differing in the strength of a fear response. Behaviral Brain Research. 2008;188:154-67.

16. George Paxinos & Charles Watsen. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4th Edition.

San Diego. Academic Press. 1998:26-9, 40-7, 56-62, 80-2, 95-100.

17. G. Garcia P., Tagliaferro A., Ferri A.M., Evangelista de Duffard, A. Brusco. Study of Tyrosine Hydroxylase Immnunoreactive Neurons in Neonate Rats Lactationally Exposed to 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid, Neurotoxicology.

2004;25:951-7.

18. 전국한의과대학 간계내과학교실. 간계내과학.

서울:동양의학연구원. 1989:44.

19. 李梴. 醫學入門. 서울:한성사. 1994:409, 534.

20. 김현준, 이태희. 시호억간탕 등 약물의 전 처 치가 구속 스트레스로 유발된 생쥐의 혈중 Corticosteron 변화에 미치는 영향. 대한한의학 방제학회지. 2002;10(2):57-72.

21. 안수진, 이태희. 구속 스트레스로 유발된 생쥐 시상하부내 Monoamine의 변화에 대한 시호억 간산과 시호억간탕의 효능. 대한한의학방제학 회지. 2003;11(1):99-114.

22. 成樂箕, 金聖勳, 徐榮培, 吳晏向. 地骨皮와 拘杞梗皮가 血糖, 解熱, 血壓 및 血液學的變化에 미치는 影響. 본초분과학회지. 1994;9(1):161-71.

23. Chrousos GP, Loriaux DL, Gold PW. Mechanisms of physical and emotional stress. New York:

Plenium. 1988:245.

24. 민성길. 최신정신의학. 서울:일조각. 1996:14, 201-5, 111.

25. Benarroch EE. Paraventricular nucleus, stress response, and cardiovascular disease. Clin Auton Res 2005;15:254-63.

26. Olschowka JA, O`Donohue TL, Mueller GP, jacobowitz DM. Hypothalamic and extrahypothalamic distribution of CRF-like immunoreactive neurons in the rat brain. Neuroendocrinology. 1982;35 :305-8.

27. Nemeroff CB, Widerlov E, Bissette G, et al.

Elevated concentrations pf CSF corticotropin -releasing factor-like immunoreactivity in depressed patients. Science. 1984;226:1342-4.

28. Doucet JP, Squinto SP, Bazan NG. Fos-jun and the primary genomic response in the nervous system. Mol Neurobiol. 1990;4:27-55.

29. Beitner-Johnson D, Guitart X, Nestler EJ.

Neurofilament proteins and the mesolimbic dopamine system: common regulation by chronic cocaine in the rat ventral tegmental area. J Neurosci. 1992;12:2165-76.

30. Danial SM, Amer Karmal, Marten PS, Geert MJ. Modulation of cellular activity and synaptic transmission in the Ventral Tegmental Area.

European Journal of Pharmacology. 2003;480 :97-115.

31. Jay M. Weiss, Prudence A. Goodman, Barbara

G. Losito, Sheila Corrigan, Jonathan M. Charry,

William H. Bailey Behavioral depression produced

by an uncontrollable stressor: Relationship to

(15)

norepinephrine, dopamine, and serotonin levels in various regions of rat brain. Brain Research Reviews. 1981;3(2):167-205.