약학희 지 제 43 권 제 4 호 474*~480(1999) Yakhak Hoeji Vol. 43, No. 4
별불가사리
(Aste/ioa pectinifera)텍틴의 사이토카인 생성 앙
전 경 희 ^ • 최 수 정 • 정 시 련 * 영남대학교 이과대학, *영남대학교 약학대학
(Received May 25, 1999)
Effect of Asterina pectinifera Lectin on Cytokine Production
K yung-H ee Je u n e , Soo-Jeong C ho i and See-Ryun C hu n g *
College o f Science and * College of Pharmacy, Yeungnam University, Kyongsan 712-749, Korea
Abstract — The purpose of this study is to define whether Asterina pectinifera Lectin (APL) is effective on the cytokine production. Isolated mRNA from hPBMC (human peripheral blood mononuclear cells) stimulated with APL for various reaction times (1 to 96 hours) was detected by RT-PCR. The intensity of band for IL-1 and IFNy mRNA was markedly increased at 1 hour, and IL-2 mRNA was strongly expressed at 4 hours. The mRNA band of APL-induced IL-2 and IFNy was weaker than that of IL-1, IL-6 and TNFot.
The mRNA expression of 4 cytokines (IL-1, IL-2, IFNy and TNFot) was detected up to 48 hours, and that of IL-6 was detected until 72 hours. ELISA was used to look protein secretion of the cytokine gene with IL-1, IL-2 and TNFa expressed strongly in RT-PCR, The highest protein secretion was at 4 hours with IL-1, at 8 hours with IL-2 and at 4 hours with TNFa. These results suggest that APL can induce the pro
duction of some cytokines and the immune response from PBMC was done within the first few hours of stimulation with APL.
Keywords □ lectin, Asterina pectinifera, starfish, cytokine, PBMC.
천 연 물 에 서 분 리 , 정 제 되 는 생 러 활 성 물 질 로 서 phytoagglutinin, phytohem agglutinin 등 으 로 불 리 어 지 는 렉 틴 (lectins)은 항 원 - 항 체 빈 융 과 유 사 한 방 식 으 로 단 당 류 및 다 당 류 와 결 합 융 H 적 혈 구 세 포 뿐 만 아 니 라 림 프 구 , 박 테 리 아 , 버 의 러 스 등 세 포 들 을 응 집 시 키 는 것 으 로 처 음 에 는 주 로 식 물 을 대 상 으 로 하 였 으 나 오 늘 닐 에 는 미 생 물 , 척 추 동 물 , 무 척 추 동 물 등 광 범 위 하 게 연 구 되 고 있 다
면 역 계 를 가 지 지 않 는 무 척 추 동 물 계 는 척 추 동 물 의 im m unoglobulin과 는 전 혀 다 른 형 태 의 인 식 분 자 인 렉 틴 이 나 읍 소 닌 (opsonin) 등 을 가 진 것 으 로 밝 혀 지 고 있 는 바 이 는 생 체 내 에 침 입 하 는 이 물 질 을 제 거 하 는 생 체 반 응 기 전 에 관 여 하 는 것 으 로 알 려 져 있 으 며 또
* 본 논문에 관한 문의는 이 저자세게로 (전화) 053-810-2375 (팩스) 053-815-3061
한 적 혈 구 응 집 력 을 나 타 내 고 항 세 균 작 용 , 읍 소 닌 효 과 등 을 가 지 고 있 는 것 으 로 보 고 되 고 있 다 . 께 특 히 렉 틴 은 영 양 물 질 수 송 및 저 장 , 해 수 에 용 존 하 는 미 량 원 소 나 효 소 , 당 단 백 질 의 흡 착 , 수 송 과 저 장 , 척 주 동 물 의 im m unoglobulin과 유 사 한 자 기 방 어 수 단 으 로 서 의 작 용 을 지 닌 다 /'
해 양 무 척 추 ^ 로 부 터 최 근 에 생 리 활 성 , 약 리 활 성 ,
세 포 득 성 이 나 항 종 양 활 성 등 의 새 로 운 물 질 이 발 견 되 고 있 다 . 각 종 해 양 생 물 들 중 별 불 가 사 리 (AstenVM p e ctin ife ra^: 포 함 한 극 피 동 물 은 세 포 득 성 이 강 하 여
새 로 운 생 물 활 성 물 질 탐 색 에 유 망 한 것 으 로 보고되고 있 다 .® 한 편 지 금 까 지 연 구 된 해 양 무 척 추 동 물 렉 틴 에 는 shellfish Saxidom iis purpuratus,^^ acom barna
cle M egabalanus w lcam，해 starfish Asterina pec- tinifera파등 에 대 한 연 구 가 있 는 바 렉 틴 은 대 부 분 혈 림 프 (hemolymph) 및 생 식 기 관 에 서 발 견 되 었 다 . 이 중
474
별 불 렉 틴 의 시이토?}인 생성 양상 475
에 서 도 별 불 가 사 5：] 렉 틴 은 사 람 림 프 구 에 대 해 훌 륭 한 마 이 토 젠 (mitogen) 으 로 작 용 하 며 , HeLa cell, L929
및 L1210 등 의 암 세 포 에 대 한 응 집 효 과 " " >와 복 수 암
(ascitic tumor) 에 대 한 항 암 효 과 률 나 타 낸 다 .®
렉 틴 이 지 니 는 역 할 중 에 서 도 면 역 학 적 , 생 물 화 학 적 측 면 에 서 중 요 시 되 고 있 는 특 성 으 로 는 종 양 세 포 의 선 텍 적 응 집 능 력 , 사 람 의 혈 액 에 대 한 특 이 성 , 휴 지 기 상 태 의 럼 프 구 률 자 국 분 열 시 키 는 마 의 토 젠 의 능 력 등 을 들 수 있 다 •오'
렉 틴 이 마 식 토 젠 으 로 작 용 할 때 분 비 되 는 사 이 토 카 인 은 혈 구 세 포 에 서 분 비 되 는 기 용 성 단 백 질 로 서 외 부 항 원 , 세 포 손 상 등 에 의 해 서 도 분 비 가 된 다 . 이 는 자 연 면 역 과 특 이 면 역 의 활 성 화 단 계 에 서 생 성 되 며 면 역 감 염 반 움 을 중 재 하 고 , 표 적 세 포 의 수 용 체 와 결 합 함 으 로 써 그 기 능 을 나 타 낸 다 . 사 이 토 카 인 은 자 극 받 은 세 포 로 부 터 단 시 간 에 mRNA 전 사 률 거 쳐 합 성 이 끝 나 면 금 방 분 비 되 고 , 사 식 토 카 인 에 대 한 세 포 성 반 응 은 수 시 간 에 걸 쳐 일 어 나 며 새 로 운 mRNA와 단 백 질 합 성 을 필 요 로 한 다 는 특 성 을 지 닌 다 . 이 와 더 불 어 많 은 표 적 세 포 에 있 어 사 토 카 인 이 세 포 분 열 의 조 절 자 로 작 용 한 다 는 사 실 과 한 중 의 사 서 토 카 인 이 다 른 사 의 토 카 인 의 합 성 에 영 향 을 주 는 인 자 로 작 용 할 수 있 으 며 , 다 른 사 서 토 카 인 의 기 능 에 도 영 향 을 주 어 상 승 작 용 , 길 항 작 용 이 가 능 하 다 는 점 이 주 목 할 만 하 다 .
본 연 구 에 서 는 이 미 우 리 가 별 불 가 사 ii] 로 부 터 분 리 정 제 하 여 그 특 성 과 수 중 의 암 세 포 성 장 저 해 효 과 ""> 및 복 수 암 에 대 한 함 ■ 효 과 를 밝 혀 발 표 한 바 있 는 렉 틴
APL을 이 용 하 여 사 람 의 말 초 혈 액 단 핵 세 포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) 에 서 사 이 토 카 인 유 견 자 의 발 현 양 상 을 RT-PCR로 확 인 하 고 자 하 였 다 . 이 후 사 이 토 카 인 생 성 유 무 를 ELISAS, 측 정 한 뒤 유 전 자 발 현 과 생 성 간 의 상 관 관 계 를 조 사 하 였 으 며 , 이 결 과 롤 토 대 로 별 불 가 사 리 렉 틴 의 면 역 조 정 제 로 서 의 가 능 성 을 더 욱 밝 히 고 자 하 였 다 .
실 험 방 법
텍틴 A PI괴 분러정제 - 별 불 가 사 리 렉 틴 APL은 이 미 보 고 한 전 보 의 방 법 ^ 정 제 하 식 실 험 에 이 용 하 였 다 . 간
PBMC의 분리 및 전처리 - 건 강 한 성 인 2인 이 상 의 혈 액 을 heparin 처 리 (5~10 lU/m/ ) 하 여 채 혈 한 후
동 량 의 생 리 식 염 수 로 희 석 하 고 이 를 Ficoll-paque (Pharmacia Biotech, Sweden) 에 2~3배 의 양 으 로 중 첩 한 뒤 1,800rpm으 로 30분 간 원 심 분 리 하 였 다 . PBMC층 을 조 심 스 럽 게 걷 어 내 고 생 리 식 염 수 로 3번 세 척 하 여 10% fetal bovine serum(FBS) (Gibco, USA) 이 첨 가 된 RPMI 1640 배 지 (Gibco, USA) 에 부 유 시 킨 후 1X1 0® cells/ml로 조 정 하 였 다 .
APL 사 용 농 도 결점 - APL을 280nm에 서 흡 광 도
(0D) 가 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0. 이 인 6단 계 로 준 비 하 였 다 . 24 well plate(flat bottom) (Costar, USA) 에
1X10«cells/ml로 분 주 되 어 있 는 PBMC를 농 도 벌
APL로 각 1시 간 과 20시 간 동 안 자 극 시 킨 후 세 포 둘 을 수 거 하 여 RT-PCR과 전 기 영 동 을 실 시 하 고 반 응 적 정 농 도 를 결 정 하 였 다 .
APL 시간별 반응 - 24 well plate(flat bottom) 에
1 m/ 의 PBMC를 분 주 하 고 0D률 0.1로 준 비 한 APL
을 각 well당 100 M/ 씩 넣 어 반 응 시 키 고 37°C의
COj incubator에 서 배 양 하 였 다 . 시 간 별 반 응 을 알 아 보 기 위 해 반 응 시 간 을 1, 4, 8, 24, 48, 72 및 96시
간 의 7 단 계 로 설 정 하 고 각 시 간 별 로 세 포 률 수 거 하 여 RT-PCR과 전 기 영 동 을 실 시 하 였 다 .
m RNA 분 러 - 반 응 시 킨 PBMC를 수 거 하 여
16,000 ipm으 로 1분 간 원 심 분 리 하 여 세 포 를 취 하 고 , 0.1% DEPC(Sigma, USA) 가 첨 가 된 phosphate buf
fered saline(PBS) 으 로 3번 세 척 한 푸 Ultraspec- II(Biotex, USA) 롤 1,000 li/ 넣 어 골 고 루 현 탁 시 켰 다 .
여 기 에 100 |j/ 의 chloroform을 첨 가 하 고 15분 간 얼 옴 에 정 치 한 후 12,000 ipm으 로 15분 간 원 심 분 리 한 상 층 액 에 동 량 의 isopropanol을 넣 고 천 천 히 섞 어 준 두
-20°C에 서 45분 간 정 치 시 켰 다 . 다 시 원 심 분 리 한 후
RNA pellet는 75% ethanolS. 세 척 하 고 건 조 시 킨 후
0.1% DEPC가 첨 가 된 증 류 수 로 희 석 하 여 260 nm와
280 nm의 흡 광 도 로 RNA 순 도 률 검 정 하 고 260 nm의 흡 광 도 로 RNA를 정 량 하 여 RT-PCR의 시 료 농 도 (10 0 p/An/ ) 로 조 절 하 였 다 ."">
RT-PCR- 100|o//m/ 로 조 정 된 시 료 mRNA중 3 니/
를 취 하 여 흔 합 된 mixture 17 |o/ [MgClj 4 |i/, 1 0 x PCR bufferll 2 |_i/, dNTP 8 |i/, RNase inhibitor 1
|i/, reverse transcriptase(M-MLVRT: RAV-2) 1 |j/, oligo[dT]16 I p/ ] 에 넣 었 다 . 여 기 에 수 분 증 발 을 막 기 위 해 mineral oil을 50 넣 고 42°C에 서 15분 동 안 반 응 시 켜 상 보 DNA를 합 성 하 고 99°C에 서 5분 간 ,
476 전경희 • 최수정 • 정시련
5°C에 서 5분 간 반 응 시 켜 역 전 사 효 소 를 불 활 성 화 시 키 고 cDNA률 합 성 하 였 다 .
PCR대 상 사 이 토 카 인 은 IL-1, IL-2, IL-6, IFNy, TNFoc로 , house keeping gene으 로 는 GAPDH(gly- ceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)# • 였 다 . 이 들 의 primer는 2 0 나 서 의 upstream, downs
tream# 각 각 In/ 씩 준 비 하 여 MgCl2 A\d, lOxpCR
bufferll 8\d,증 류 수 65.5 \il, Taq polymerase 0.5 \il
가 혼 합 된 PCR master mixture에 넣 었 다 . 합 성 된
cDNA에 해 당 사 이 토 카 인 primer의 PCR master mixture를 80 넣 고 tham al cycler(Perkin Elmer, USA) 로 중 합 J[ 소 연 쇄 번 웅 을 실 시 했 다 . 94T에 서 1
분 동 안 불 활 성 화 단 계 , 60°C에 서 1분 동 안 결 합 반 응 단 계 , 72°C에 서 1.5분 동 안 핵 산 중 합 단 계 률 거 치 는 반 응 을 35회 실 시 하 고 72°C에 서 10분 간 전 체 핵 산 중 합 번 웅 을 종 결 시 켰 다 . GAPDH와 각 사 이 토 카 인 의 primei는 연 세 대 학 교 의 과 대 학 생 화 학 교 실 및 한 국 생 공 에 서 합 성 한 것 으 로 그 sequence는 다 옴 과 같 았 다 .
GAPDH (250 bp)
(5')5'-GTCAT GAGCC CTTCC ACGAT GC-3' (3')5'-GAATC TACTG GCGTC TTCAC C-3'
IL-1 (420 bp)
(5')5'-GTCTC TGAAT CAGAA ATCCT TCTAT C-3' (3')5'-CATGT CAAAT TTCAC TGCTT CATCC-3'
IL-2 (458 bp)
(5')5'-ATGTA CAGGA TGCAA CTCCT GTCTT-3' (3')5'-GTTAG TGTTG AGATG ATGCT TTGAC-3'
IL-6 (628 bp)
(5')5'-ATGAA CTCCT TCTCC ACAAG CGC-3' (3')5'-GAAGA GCCCT CAGGC TGGAC TG-3'
IFNy (494 bp)
(5')5'-ATGAA ATATA CAAGT TATAT CTTGG CTTT-3' (3')5'-GATGC TCTTC GACCT CGAAA CAGCA T-3'
TNFot (695 bp)
(5')5'-ATGAG CACTG AAAGC ATGAT CCGG-3' (3')5'-GCAAT GATCC CAAAG TAGAC CTGCC C-3'
전 기 영 동 - 발 색 시 약 으 로 EtBr(ethidium bromide)
을 첨 가 (1 n//m/ ) 하 여 1.5% agarose gd을 제 조 하 였 고 완 충 용 액 은 0.5XTBE용 액 을 사 용 하 였 다 .
ELISA - 흡 광 도 기 " 0.1 인 APL로 PBMC를 지 ^ 시
킨 후 7단 계 의 시 간 벌 로 수 거 하 식 1,600 rpm으 로 1
분 간 원 심 분 리 한 후 세 포 배 양 상 층 액 을 취 해 여 과 시 키 고 시 료 로 준 비 하 였 다 . ELISA는 sandwich 방 법 " ® 으 로 IL-1, IL-2 및 TNFo의 세 중 류 사 식 토 카 인 만 실 시 하 였 다 .
각 각 의 사 의 토 카 인 이 표 면 처 리 된 96 well plate에 시 료 률 50|i/ 분 주 하 고 biotinylated antibody률 50 |o/
첨 가 해 공 기 를 차 단 하 식 20~25°C에 서 3시 간 배 양 시 킨 후 세 척 완 층 용 액 으 로 3회 세 척 하 였 다 . 여 기 에
stxeptavidin-HRP(horseradish peroxidase) conjugate
룰 100 |o/ 첨 가 해 20~25°C에 서 30분 간 배 양 시 키 고 세 척 후 TMB(tetramethyl benzidine) substrate 100 HiS. 발 색 되 게 하 였 다 . TMB 반 응 은 20~25°C에 서 30
분 간 진 행 시 키 고 stop solution으 로 반 응 을 중 단 시 켜
450 nm에 서 ELISA reader률 사 용 하 여 흡 광 도 률 측 정 하 였 다 . 측 정 된 흡 광 도 값 은 이 미 만 둘 어 진
standard값 에 준 하 여 concentration 값 (pg^m/)i： 계 산 하 였 고 세 중 류 의 사 의 토 카 인 에 서 각 각 4번 의 실 험 으 로 평 균 치 를 산 출 하 였 다 .
실 험 결 과
APLSI 농 도 에 따 른 AfOI토 카 인 유 전 자 발 현 양 상 -
대 상 사 이 토 카 인 은 최 저 농 도 인 흡 광 도 0. 이 에 이 르 기 까 지 각 농 도 에 서 모 두 band를 나 타 냈 고 특 정 농 도 에 있 어 그 양 상 은 다 소 차 이 가 있 었 다 . 죽 , APL과
PBMC와 의 반 응 1시 간 후 사 어 토 카 인 유 전 자 발 현 을 관 찰 한 결 과 IL- 1 은 흡 광 도 0.03에 서 발 현 이 현 저 히 감 소 했 고 IL-2는 전 체 적 으 로 다 소 약 한 band로 나 타 났 다 . IL"6의 band는 그 강 도 가 농 도 에 비 례 하 였 으 며 , IFNy의 경 우 전 반 적 으 로 고 른 band < 장 상 을 나 타 냈 으 나 농 도 가 낮 아 • 질 수 록 band는 가 늘 어 짐 을 관 찰 할 수 있 었 다 . 그 리 고 TNFo의 경 우 흡 광 도 0.3과 0.1 의 농 도 에 서 강 한 유 전 자 발 현 을 나 타 냈 다 . 이 들 을 중 합 해 본 결 과 흡 광 도 0 .1의 농 도 에 서 실 험 한 사 어 토 카 인 의 유 전 자 발 현 양 상 <>1 가 장 적 정 수 준 으 로 나 타 났 다 (Fig. 1).
APL과 PBMC의 빈 옹 20시 간 후 의 농 도 별 사 서 토 카 인 유 전 자 발 현 양 상 역 시 대 상 사 이 토 카 인 은 최 저 농 도 인 흡 광 도 0 .0 1까 지 의 모 든 농 도 에 서 유 전 자 가 발 현 되 었 다 . IL-1 의 경 우 흡 광 도 0.1 이 하 에 서 강 한
band를 얻 었 고 IL-2는 농 도 별 로 다 소 고 른 band 양 상 을 보 였 으 나 농 도 의 존 적 이 었 다 . IL-6는 다 른 사 의 토
J. Pharm. Soc. Korea
별불기사리 렉틴의 시0]토키인 생성 앙상 477
M A
IL-1
(420bp)
IL~2
(458bp)
IL-6
(628bp)
iFN r
(494bp)
T N F a (695bp)
GAPDH
(히bp)
Hours after stimulation
4 8 24 48
■ E S 9 E B 9 B S B 9 I
■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■
들 별 텔 을 텔 대 텔 텔 별 I 텔헬날!헬 벨 I 텔 텔 F ig . 1 - Dose dependent effect of APL on mRNA expression
for various cytokines in PBMC cultured for 1 hour. M;
123 bp DNA ladder, A; OD 3.0, B; OD 1.0, C; OD 0.3, D; OD 0.1, E; OD 0.03, F; OD 0.01.
M A B C D E F
IL-1
(420bp)
IL-2
(453>p)
IL-6
(628bp)
IFN r I
(494bp) I
TNFff
(695t®)
GAPDH
(250bp)
텔 벨 텔 헬g g헬룹클Ig톰/Ig g g g /g룔를헬텔g텔뿔를
텔 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^헬
헬 률 g g 물 g j j 물jjjjj물 헬 j g j j j j 텔 I
F ig . 2 - Dose dependent effect of APL on mRNA expression for various cytokines in PBMC cultured for 20 hours.
M; 123 bp DNA ladder, A; OD 3.0, B; OD 1.0, C;
OD 0.3, D; OD 0.1, E; OD 0.03, F; OD 0.01.
IL-6
(628bp)
IF N r
(494bp)
TNF
(695bp)
2
텔 폴 헬
m iGAPDH
(250bp)
• 헬^^^^^해^ 실 텔 물 !^^^벨플^^^벨
F ig . 3 - PCR-assisted amplification of IL-1 (420 bp), IL-2 (458 bp), IL-6 (628 bp), IFNy (494 bp), TNFa (695 bp) and GAPDH (250 bp) in PBMC according to the increased reaction times with APL. M; 123 bp DNA ladder (123-4182 bp).
카 인 에 비 해 굵 은 band를 나 타 냈 고 IFNy와 TNFa는 흡 광 도 0 .1 이 하 에 서 유 전 자 발 현 이 현 저 히 감 소 됨 을 관 찰 하 였 다 (Fig. 2). 이 와 같 이 반 응 1시 간 과 20시 간 에 서 농 도 0.1 의 APL이 사 의 토 카 인 유 전 자 발 현 에 고 른 양 상 을 나 타 냈 으 므 로 , 이 후 실 시 할 실 험 에 서 는 적 정 농 도 률 흡 광 도 0.1로 하 였 다 .
반등시간에 따른 APL의 사이토카인 유 전 자 발현
양상 - 흡 광 도 0.1로 조 제 한 APL을 PBMC와 1시 간 에 서 9& 시 간 동 안 반 응 시 킨 결 과 IL-6를 제 외 한 나 머 지 사 0] 토 카 인 은 모 두 반 응 24시 간 내 지 48시 간 까 지 유 전 자 발 현 이 진 행 되 었 고 IL-6는 다 소 오 래 지 속 되
어 72시 간 까 지 발 현 되 었 다 (Fig. 3). IL-1 은 빈 움 초 기 인 1시 간 대 에 강 한 유 전 자 발 현 을 나 타 냈 고 8시 간 후 에 는 현 저 히 감 소 되 어 48시 간 까 지 지 속 되 었 다 . IL-2
는 반 응 & 시 간 까 지 강 한 발 현 을 나 타 내 었 으 며 IL-1 과 같 이 24시 간 이 후 현 저 히 감 소 하 쉬 48시 간 까 지 지 속 되 었 다 . IL-6는 반 응 초 기 에 는 약 한 발 현 이 었 으 나 8 시 간 대 에 가 장 강 했 으 며 다 시 점 차 약 해 져 서 48시 간 이 후 현 저 히 감 소 하 였 다 . IFNy의 경 우 전 체 대 상 사 이 토 카 인 중 가 장 약 하 게 나 타 나 번 움 초 기 인 1시 간 대 에 발 현 이 나 타 났 으 나 시 간 이 지 남 에 따 라 아 주 약 하 게 48시 간 까 지 유 지 되 었 다 . TNFa의 mRNA 발 현
478 전경희 • 촤수정 • 정시련
Table I - Secretion of IL-1, lL-2 and TNFa by PBMC stimulated with APL. Cytokine release by PBMC was analyzed by ELISA
고 찰
Reaction time Amount (pg/m/) of cytokine secreted
(hours) IL-1 IL-2 TNFa
control 67± 4 68± 7 22± 3
1 105113 130+22 72± 6
4 234±33 m ±25 562±23
8 138±25 176±20 543+22
24 133116 168+18 330소 7
48 131± 8 163±10 137± 5
72 98+16 156± 8 69± 6
96 73± 3 150± 7 34± 3
Values are means ± standard error of the means for 4 experiments and are expressed as picograms per milliliter.
은 반 응 4시 간 대 에 서 최 고 의 양 상 을 보 였 으 며 48시 간 까 지 지 속 되 었 다 . 이 처 럼 전 체 적 으 로 APL의 사 의 토 카 인 유 전 자 발 현 은 PBMC와 의 빈 움 초 기 에 강 하 게 나 타 났 다 . 또 한 인 터 루 킨 그 룹 중 IL-2의 유 전 자 발 현 은 다 소 약 했 으 며 IL- 1 과 IL-6는 그 발 현 이 강 하 게 나 타 났 다 .
APL의 반 응 시 간 에 따 른 사 이 토 카 인 생 성 양 상 ~ APL로 자 극 시 키 지 않 은 PBMC률 control로 하 고
PBMC를 APLS. 자 극 한 후 1, 4, 8, 24, 48, 72 및
96시 간 반 응 시 킨 뒤 ELISA률 이 용 하 여 IL-1, IL-2
및 TNFa의 활 성 능 (생 성 능 ) 을 측 정 하 여 Table I의 결 과 를 얻 었 다 . 실 험 결 과 에 서 보 듯 이 IL-1 의 경 우 사 이 토 카 인 의 생 성 은 반 응 4시 간 째 에 가 장 높 은 농 도 로 나 타 났 으 나 8시 간 이 후 부 터 는 계 속 감 소 하 였 고 48시 간 이 후 의 활 성 능 은 현 저 히 감 소 함 을 관 찰 하 였 다 . 이 것 은
RT-PCR 걸 과 에 서 확 인 된 반 응 1시 간 대 의 강 한 유 전 자 발 현 이 이 후 4시 간 째 의 강 한 사 어 토 카 인 의 생 성 을 뒷 받 침 하 는 것 으 로 ELISA에 의 해 입 증 된 것 이 다 . IL- 2는 빈 움 1시 간 부 터 활 성 능 이 서 서 히 증 가 하 는 양 상 으 로 진 행 되 어 8시 간 대 활 성 능 이 가 장 높 게 관 찰 되 었 으 며 번 움 24시 간 이 후 부 터 는 다 시 서 서 히 감 소 하 면 서
96시 간 까 지 지 속 되 었 다 . IL-2 또 한 RT-PCR 결 과 로 확 인 한 빈 응 4시 간 대 의 강 한 유 전 자 발 현 이 이 후 의 생 성 능 과 유 관 함 을 입 증 하 였 다 . TNF-OC는 빈 움 4시 간 대 에 폭 발 적 으 로 활 성 능 이 높 아 져 서 8시 간 까 지 매 우 강 하 게 유 지 되 다 가 24시 간 대 에 서 조 금 낮 아 졌 고 48시 간 대 부 터 는 감 소 하 기 시 작 하 였 다 . 이 는 RT-PCR에 의 한
mRNA의 발 현 이 반 응 4시 간 대 에 최 고 의 양 상 을 보 이 고 48시 간 까 지 지 속 된 점 과 생 성 능 과 의 시 간 대 가 일 치 하 는 것 이 었 다 .
본 연 구 진 이 이 미 보 고 한 APL에 관 한 여 러 가 지 결 과 1102)에 의 하 면 이 렉 틴 은 사 람 의 으_ B 0, AB형 과 생 쥐 및 토 꺼 의 적 혈 구 를 강 하 게 응 집 시 키 고 흰 쥐 에 대 해 서 는 적 혈 구 응 집 현 상 을 나 타 내 지 않 으 며 , 세 포 득 성 이 있 고 HeLa cell, L929, L1210 등 의 암 세 포 를 응 집 시 켜 암 세 포 의 증 식 저 지 효 과 가 있 음 이 밝 혀 졌 다 ."« 또 한 APL을 사 용 하 여 생 쥐 , 흰 쥐 와 사 람 의 림 프 구 에 대 해 자 극 분 열 효 과 를 측 정 한 결 과 , 생 쥐 림 프 구 ( 최 고 활 성 0.3^ig/m/ ) 와 사 람 림 프 구 ( 최 고 활 성 1 .2 모 두 에 대 해 활 성 도 룰 나 타 내 었 고 그 중 사 람 림 프 구 에 대 한 지 국 분 열 세 포 수 가 훨 씬 높 게 나 타 났 다 . 이 결 과 를 이 미 마 이 토 젠 으 잘 알 려 진 Con A
와 비 교 해 보 면 Con A는 최 고 활 성 1.2 Hg/m/ 로 서 사 람 림 프 구 에 대 해 비 숫 한 세 포 분 열 효 과 가 있 었 다 .
또 한 백 합 조 개 렉 틴 이 1.95 ng/m/ 에 서 최 고 활 성 도 / 긴 눈 알 고 등 렉 틴 은 15.63~31.25|Xg/m/에 서 /® 표 고 버 섯 렉 틴 은 1 . 2 ng/m/ 에 서 최 고 활 성 도 를 나 타 내 는 것 과 비 교 하 식 볼 때 높 은 세 포 분 열 효 과 를 지 니 고 있 옴 이 확 인 되 어 우 량 한 마 이 토 젠 으 로 입 증 되 었 다 . 또 한
Ehrlich ascites tumor cell을 마 우 스 복 강 내 에 이 식 한 후 APL 투 여 로 복 수 암 세 포 의 성 장 미 억 제 되 고 수 명 연 장 효 과 가 확 인 됨 으 로 서 항 암 효 과 가 있 옴 을 밝 힌 바 있 다 .12)
본 실 험 에 서 는 APL을 대 상 으 로 사 어 토 카 인 유 견 자 발 현 양 상 을 밝 혔 다 . 농 도 별 사 의 토 카 인 유 전 자 발 현 을 반 응 1시 간 과 2 0시 간 으 로 나 누 어 실 험 한 결 과 대 체 적 으 로 능 도 의 존 적 임 을 나 타 냈 고 모 든 사 이 토 카 인 의 적 정 농 도 률 찾 아 본 걸 과 Im/ 의 PBMC를 260 nm에 서 흡 광 도 0 .1인 시 료 10 0 10/ 로 자 극 하 였 을 때 최 적 의 유 전 자 발 현 을 기 대 할 수 있 었 다 . 이 는 적 정 농 도 가 50—100 jig/m/ 인 LCL(Le«s culinaris Lectin) 체 이 나 적 정 농 도 가 흡 광 도 3인 1포U L m tim s edodes Lectin) 2 "*인 경 우 와 비 교 해 볼 때 , 낮 은 농 도 에 서 도 충 분 히 사 이 토 카 인 유 전 자 를 발 현 시 키 는 사 실 을 확 인 한 결 과 였 다 .
APL로 PBM C* 자 극 한 후 시 간 별 반 응 에 서 IL-1
은 반 응 1시 간 대 에 유 전 자 발 현 이 가 장 높 으 면 서 이 후 48시 간 까 지 지 속 되 었 고 , 11-27} 반 응 1시 간 대 에 국 히 약 한 유 전 자 발 현 을 나 타 내 었 고 4시 간 대 에 발 현 이 가 장 왕 성 하 였 으 며 이 어 서 48시 간 까 지 유 지 되 는 것 으
J. Pharm. Soc. Korea
별불7]사리 렉틴의 사이토카민 생성 양상 479
로보아 IL-1 의분비가 IL-2 발현을 유도한다는 이론 이22> 본 실험의 결과와어느 정도 일처하였다. IL-6는
반응 4시간대의 강한 발현이 72시간까지 지속이 되었
고, 4시간 이후에 더 강한 IL-6 유전자 생성은 없는 것으로 나타났는데, 이는 H oriP 등이 발표한 보고와 는 일처하지 않는 것이었다. Horii rr. Ct IL-6의 분비
가 첫 4시간대에는 단핵구와 대식세포에 기인하며, 후
반 48시간에서는 다시 마어토젠 자극에 의한 T와 B
세포에 의한 생성이 야기된다 하였다. IL-1, TNFa 그리고 IL-6는서로 상호 작용하며, 발열이나허약 등
의 전신성 증상에 있어 유사한 작용을 함과 동시에
IL-1 이나 TNFo는 세포성 면역시에 IL-6를 유도한다
고 알려져 있고 유도에는 IL-1 이 가장 강하게 작용한
다고 하였다.^"> 본 실험결과 IL-1 이 다른 사식토카인 에 비해 유전자 발현이 강하게 나타났으며 이는 IL-6 룰 유도함을 입증하는 것이었다. 그 외 IL-2나 IFNy
는 번움 48시간까지 유전자 발현이 지속되었으나 발
현 정도가 아주머약하였고 IL-2가 IFNy의분비률 유
도한다는 이론®으로 볼 때 2종류 사의토카인은 관계
가 있는것으로사료되었다. 그리고 이돌의 약한 band 는 IL-1, IL-6, TNFc(7> 단핵세포, 대식세포 등 다양 한 종류의 세포에서 조절 및분비되는데 반해, IL-2와 IFNy는 그 생산원이 T 세포나 Natural Killer(NK)
세포로 한정되어 있기 때문인 것 같다.
단핵구와활성화된 T 세포가 모두 분비하는 IL-1 은
다른 4종의 사의토카인보다는 그 양이 많이 분비되는
것으로 알려진 바 본 실험에서도 RT-PCR 결과 다른
사의토카인보다유전자발현이 많은것으로확인되었다.
생성된 사어토카인의 분비률 ELISA로측정한 결과
IL-1 의 4시간대에서 생성된 최고치는 전사된 mRNA가
단백질 합성을시작하고분비하기까지의 과정이 1시간
파 4시간사어에 많은 앙의 IL-1 분비가증가됨을 의 미하고이는 1시간대에 IL-1 유전자가가장 많이 발현
되었음을입증하는 결과였다. 그리고 유전자발현이 되
지 않았던 72시간과 96시간대에서 측정된 머량의 IL-
1 양은 초기외 많은 분비가 cell culture supernatant 에 다소 잔존함을 나타내는 것^ 추정되었다. IL-1 과 IL-2의사"이토카인 분비량비교시 IL-1 의분비량이 IL-2 분비량보다 많은 것은 RT-PCR결과 IL-1 의 band가 IL-2의 band보다 굵었던 것을 반영하며, 이는
IL-1 이 APL의 자국 전에 단핵식세포 등에 의해서도
분비되지만 IL-2는 활성화된 T 세포(주로 C iy > ll 의
해서만분비된다는 점을고려하^ 이해해야할 것이다.
TNFo는RT-PCR결과 4시간대에서 가장 유견자 발현
이 강했으며 ELISA결과그 분비능은 4시간대에서 가
장 높았다. 그러나 4시간과 8시간대에서 분비량은 큰
치의가 없었으며 96시간까지 서서히 분비량이 감소됨
을 확인하였다.
실험 대상머었던 5종류의 사서토카인은 RT-PCR로
확인한 결과 대부분 반응 초기에 유전자가 강하게 발
현되어 단시간에 생성이 끝나는 공통된' 특징이 있었으
며이 중 3종류의 사의토카인을 선정하식 실질적인 생
성 및 분비롤 ELISAS 확인한 결과 APL은 PBMC
로 부터 사의토카인을 생성, 유지시킬 수 있는 유도체
로서의 역할을 수행한다는..것을 확인할 수 있었다.
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