사람의 CpG dinucleotide의 약 70-80%는 methylation되어 있어 정상 세포에서도 흔히 발견된다.

서 론

CpG island는 DNA 염기서열 중 다수의 CpG dinucleotide (cytosine+guanine)가 수백 염기에서 길게는 수천 염기까지 모여있는 부분을 말하는 것으로써, 약 36,000 염기당 한군데 정도 나타나는 것으로 알려져 있 으며,

모든 housekeeping 유전자와 다수의 조직 특이성 유전자와 밀접한 관계를 가지고 발견된다.

이 부위는 부유전체학 (Epigenetics)의 주된 관심 분야가 되고 있 는데, 부유전체학이란 DNA 염기서열의 변화 없이 다 음 세대에 유전이 가능한 유전자 발현의 변화 또는 그 에 대한 학문을 의미한다. 인간에서 cytosine의 2-7%는 methylation되어 있는데, methylated cytosine의 대부분이 CpG dinucleotide 부위에서 발견된다. 이러한 cytosine의 methylation은 포유류 유전체의 중요한 부유전체적 변이 로써, 유전자 발현에 지대한 영향을 미치는 것으로 알 려져 있는데,

사람의 CpG dinucleotide의 약 70-80%는 methylation되어 있어 정상 세포에서도 흔히 발견된다.

그러나, 정상 세포에서 CpG dinucleotide의 집합체라 할 수 있는 CpG island는 이러한 methylation으로부터 보호 받고 있는데, 대개 CpG island는 promoter 부위, 비합성 (untranslated) 부위, 엑손 1 (exon 1) 등, 유전자의 5’ 말단 의 연장선상에 위치하여 유전자 발현 조절과 밀접한 관 련을 가진다.

CpG island의 methylation은 정상세포에서는 몇몇 예 외적인 경우를 제외하고는 관찰되지 않으며 비정상세 포, 즉 암세포의 경우에서 흔히 발견되는데, 암화 과정 에서 전체 CpG island의 약 10%까지 methylation 될 것 으로 추정되고 있다.

유전자의 전사과정은 세 가지

조건이 충족되어야 진행이 되는데 첫째, 적절한 전사 인자(transcription factor)가 있어야 하고, 둘째, 히스톤 (histone)들이 acetylation되어 있으면서 methylation되어 있지 않아야 하고, 셋째, CpG island에 methylation이 없 어야 한다.

CpG island의 methylation이 중요한 이유가 여기에 있는데, 비록 CpG island의 methylation이 먼저냐 유전자 발현 억제가 먼저냐 하는 논란은 여전히 있지 만,

암세포에서 다양한 암억제 유전자를 불활성화시켜 암화 과정에 관여할 수도 있다는 점, 암이 기원한 조직 에 따라 hypermethylation에 의해 억제되는 유전자가 각 각 다르다는 점 등이다.

따라서, 암세포에서 CpG island methylation은 분자진단(molecular diagnosis) 및 암의 조 기 진단에 활용될 가능성이 매우 높으며, 유전자의 변이 보다는 부유전체적 변이를 정상화시키는 것이 더 쉬울 것이라는 점에서 암의 치료적 측면에서도 매우 흥미로 운 분야인 것이다.

자궁경부암과 CpG island methylation

자궁경부암 발생의 일차적인 원인 인자가 human papillomavirus (HPV)인 것은 널리 알려진 사실이다.

그 러나, HPV에 감염된 모든 사람에서 자궁경부암이 발생 하는 것은 아니어서 HPV는 자궁경부암 발생에 있어서 충분조건이라기 보다는 필요조건이라 할 수 있다.

그 러므로 자궁경부암 연구와 HPV에 관한 연구는 밀접한 관련이 있는데, HPV DNA의 methylation에 관한 연구를 보면, Kim 등은 자궁경부암 세포주 C33A를 이용하여 HPV16 DNA 발현에 methylation이 어떠한 영향을 미치 는지 연구하였는데, 분화가 좋은 세포에서는 HPV16의 LCR (long control region)이 hypomethylation되어 있고 분화가 나쁜 세포에서는 흔히 LCR의 E

결합부위에 methylation이 되어있다고 하였다.

Badal 등은 자궁경 부암 세포주 C4-1과 HeLa를 이용하여 HPV18 DNA의

CpG island methylation과 부인종양

서울대학교 의과대학 산부인과학교실 전용탁 김재원 강순범

논문접수일 : 2005년 2월 14일

교신저자 : 강순범, 110-744 서울시 종로구 연건동 28번지 서울대학교병원 산부인과

전화 : 02) 2072-3384․전송 : 02) 762-3599 E-mail : ksboo308@plaza.snu.ac.kr

methylation을 조사하였는데 L1 유전자는 methylation 정 도가 강하였고 LCR의 일부는 methylation이 없었다고 하였다.

이러한 결과들은 숙주 세포 내에서 HPV DNA 의 발현 조절에 methylation이 깊이 관련되어 있으며, HPV의 생활사에서 early product와 late product들의 조절 에도 methylation이 관여할 수 있다는 것을 시사하는 것 으로써 자궁경부암의 발생과정에서 HPV와 숙주 세포 사이의 상호 작용 등에 대한 연구에 도움이 될 수 있을 것이다.

자궁경부암에서 CpG island methylation이 다양한 암 억제 유전자를 불활성화시켜 자궁경부암 발생에 관여 한다는 것은 다양한 연구들에 의해서 조금씩 알려지 고 있는데, Virmani 등은 자궁경부암의 암화 과정에서 methylation 경향을 보기 위하여 자궁경부암 조직 및 세 포주, 자궁경부 상피내종양 (CIN), 정상세포 등을 가 지고 여섯 가지 유전자 (p16, RARβ, FHIT, GSTP1, MGMT, hMLH1)를 조사하였다.

그 결과 정상세포에서 는 methylation이 없었고 암조직에서는 hMLH1을 제외한 모든 유전자에서 methylation 빈도가 20% 이상이었으며, 저등급에서 고등급으로 CIN이 변화할수록 methylation 빈도가 증가하는 경향을 보여주었다. 또한, Nuovo 등은 MSP-ISH (methylation-specific PCR in situ hybridization) 를 이용하여 p16의 methylation이 초기 자궁경부암에서 는 혼재 (heterogeneous)되어 있으나 진행된 자궁경부암 에서는 거의 모든 세포에서 발견할 수 있다는 점에서 자 궁경부암의 암화과정 초기부터 p16이 관여할 것이라고 하였다.

p16의 methylation과 자궁경부암 사이의 관련 에 대한 국내 연구로는 부인종양 이번 호에 게재된 정 등의 연구가 있는데,

이들은 78예의 자궁경부암 조직 과 24예의 정상 자궁경부 조직을 사용하였는데, 자궁경 부암 조직에서 p16 promoter methylation이 57.0%로 정 상 자궁경부 조직보다 훨씬 높다고 하였으며, 자궁경부 암의 병기가 높을수록 p16 promoter methylation의 빈도 가 증가한다고 하였다. Dong 등은 31명의 편평상피암 과 22명의 선암 환자에서 얻은 조직을 이용하여 6개의 유전자(p16, APC, HIC-1, DAPK, MGMT, E-cadherin)에 대한 methylation을 조사하였는데, 편평상피암의 71%, 선암의 91%에서 적어도 한 개의 유전자는 methylation 되어 있다고 보고하였다.

또한 24명의 정상 조직에서 는 methylation이 발견되지 않았으며, 선암에서는 APC와

HIC-1 유전자가 상피세포암보다 methylation된 경우가 많 았고 편평상피암에서는 선암보다 p16과 DAPK 유전자의 methylation이 많아서 병리조직학적 차이에 따라 methy- lation 양상도 다르다고 하였다. Cohen 등도 RASSF1A의 methylation이 선암에서는 흔하며 편평상피암에서는 드물 다고 보고하여 자궁경부암의 대부분을 차지하는 두 종류 의 암종 사이에 뚜렷한 차이를 보여주었다.

Ivanova 등은 자궁경부암 조직과 SiHa, HeLa, CaSki 등 세포주를 이용하여 RAR-β2 유전자의 5’ 말단에서 methylation을 보고하였으며,

Cheung 등은 10개의 CIN 조직과 62개의 암조직을 이용하여 PTEN의 methylation 에 의한 발현 저하가 자궁경부암 발생과정의 초기에 나 타나며 예후에도 연관이 있을 가능성이 있다고 하였 다.

이렇듯 CpG island methylation은 예후에도 영향을 미칠 가능성이 있는데, Muller 등은 정상 자궁경부와 자 궁경부암 조직에서 25개의 유전자에 대한 methylation을 조사하였다.

그 결과 정상 자궁경부 조직의 methylation 유형과 비슷한 유형을 보인 자궁경부암 환자는 예후가 훨씬 좋았다고 하였다. 또한 Liu 등은 자궁경부암에서 p73의 발현이 방사선치료에 대한 감수성을 높이고 예후 가 좋다고 하였는데, p73의 발현 조절에 methylation이 관여한다고 하였다.

최근 Reesink-Peters 등은 methylation 분석을 통해 새 로운 자궁경부암 진단 기법 개발의 가능성을 제시하였 는데, 53명의 자궁경부암 환자에서 자궁경부 도말과 조직을 얻고 45명의 정상인을 대상으로 APC, DAPK, MGMT, GSTP1 등의 유전자를 조사하였다.

그 결과 APC, DAPK, MGMT 유전자는 자궁경부 도말과 암 조직 사이에 유의한 상관관계를 보였고, DAPK는 정상 대조 군보다 유의하게 높은 methylation을 보여주었다. 또한 이러한 방식으로 자궁경부 도말에서 자궁경부암의 67%

를 진단할 수 있다고 하여 앞으로 정확도를 높일 수 있

는 연구가 뒤따른다면 좋은 결과를 가져올 수 있을 것이

라고 하였다. 또한 Widschwendter 등도 여성 환자들의

탐폰에서 얻어진 세포들을 이용하여 총 11개의 유전자

(SOCS1, CDH1, TIMP3, GSTP1, DAPK, hTERT, CDH13,

HSPA2, MLH1, RASSF1A, SOCS2)에 대한 methylation

을 조사한 후 cluster 분석을 통해 11명 중 9명의 자궁경

부암 환자를 구분할 수 있다고 하여 진단적 도구로의 응

용 가능성을 한층 높여 주었다.

난소암과 CpG island methylation

난소암에서도 CpG island methylation에 의한 다양한 암 관련 유전자의 발현 저하가 보고되고 있다. 1997년 Cheng 등은 난소의 양성 종양, 경계성 종양, 악성 종 양 모두에서 전체적인 methylation과 MyoD1 위치의 methylation을 조사하였는데, 전체적인 methylation은 경 계성 종양과 악성 종양에서 낮았지만 MyoD1 위치의 methylation은 양성 종양에서는 발견되지 않고 경계성 및 악성 종양에서만 발견되었다고 하였다.

Lin 등은 배 아암종 (embryonal tumors)과 관련이 있는 GPC3가 난소 암에서 암 억제 유전자로 작용하는지를 알아보기 위하 여 13종의 난소암 세포주를 대상으로 연구하였는데, 4종 의 세포주에서 GPC3의 발현이 소실된 것을 밝혀내었고 그 중 하나는 hypermethylation과 관련이 있다고 하였 다.

그 외에도 CAV1, DAPK, 14-3-3sigma, DcR1, DcR2, SOCS1, SOCS2, TMS1/ASC, MYO18B 등이 난소암에서 발현이 저하되어 있고 이들 발현 저하는 methylation과 관련이 있다는 것이 알려지고 있다.

또한, 12명의 granulosa cell tumor를 가진 성인 환자 조직을 대상으로 연구한 Arcellana-Panlilio 등에 의하면 12개 중 7개의 조 직에서 INK4A와 INK4B의 발현이 없는 것을 발견하였 는데 이 중 DNA deletion이 있었던 하나를 제외하고는 모두 promoter 부위에 methylation이 있었다고 하여 상피 성 난소암이 아닌 경우에도 methylation과의 관련성을 보여주었다.

난소암에서 이러한 methylation의 기전은 확실히 밝혀 져 있지는 않으나, CpG island methylation에 작용하는 효 소인 DNA methyltransferase (DNMT)의 변이 여부를 8종 의 난소암 세포주를 대상으로 조사한 Ahluwalia 등의 연 구에 의하면, 8종의 세포주들 중 4종에서 DNMT1 혹은 DNMT3b의 발현이 정상 난소 상피에서보다 증가되어 있 다는 것을 밝혔다.

그러나, DNMT의 과발현이 발견되지 않은 세포주도 상당수 있어 난소암에서 DNMT 외에도 methylation에 관여하는 기전이 있을 것임을 시사하였다.

정상 조직에서 methylation에 의해 발현이 억제되어 있던 유전자들이 암 조직에서 methylation에 의한 억제 가 사라진 경우를 조사한 예로는, 43개의 난소암 조직 과 43개의 정상 난소 조직에서 c-erbB-2와 survivin의 methylation을 조사한 Hattori 등의 연구가 있는데, 정상

난소 조직에서는 난소암 조직에 비해 유의하게 많은 정도의 methylation을 보여주었다.

또한 이들은 DNA demethylase의 발현이 난소암에서 유의하게 높은 것을 보여주어 oncogene의 발현이 부유전체적 활동의 결과라 는 것을 제시하였다. 또한, Chen 등은 p73의 과발현이 진행된 병기의 난소암과 관련이 있으며, p73 발현이 없 었던 3종의 세포주와 한 개의 암 조직에서 CpG island methylation을 확인하였다.

Gupta 등도 정상 조직에서 는 발현이 되지 않는 SNCG에 관해서 보고하였는데, 난소암이나 유방암 모두에서 SNCG 유전자의 발현이 methylation에 의해 이루어진다고 하였으며, 난소암과 유 방암 조직에서 methylation의 양상은 상당히 달랐다고 하여 같은 암유전자의 조절에 같은 methylation 기전이 작용한다고 하더라도 그 양상은 조직 특이성을 가진다 고 하였다.

난소암은 초기에 특별한 증상이 없어 조기 발견이 어 려워 약 70%의 환자가 3기 혹은 4기에 발견되며 이렇게 진행된 채 발견된 경우 5년 생존율은 20% 내외라는 점, 또한 1기에 발견하여 적절한 치료를 받을 경우 5년 생존 율을 90% 근처까지도 올릴 수 있다는 점에서 난소암의 조기 진단은 부인 종양학의 중요한 과제이다.

이러한 측면에서 Rathi 등은 고위험 환자 선별 및 조기 진단의 가능성을 타진하고자, 정상 난소 조직, 난소암이나 유 방암의 가족력이 있는 여성의 정상 난소 조직, 난소암 조직, 난소암 세포주 등을 이용하여 9개의 유전자에 대 한 methylation 연구를 시행하였는데, RASSF1A, HIC1, E-cadherin, APC 등에서 methylation이 정상 난소 조직보 다 난소암 조직에서 유의하게 높았다고 하였다.

그러 나 위험 인자를 가진 여성과 그렇지 않은 여성의 정상 난소 조직에서는 methylation의 유의한 차이가 없다고 하여 고위험 환자의 선별에는 적당치 않을 것이라고 하였다. 한편, Ibanez de Caceres 등은 난소암의 조기 진단 방법 개발을 위해 난소암 조직, 혈청, 복수 (혹은 복강 세척액) 등에서 BRCA1, RASSF1A, APC, p14

,

p16

, DAPK의 methylation을 조사하였는데, 난소암 조

직에서는 이들 중 적어도 하나에서 methylation이 있었으

며 정상 조직에서는 methylation이 보이지 않았다.

또한,

methylation 양상은 난소암 조직과 비교하였을 때 혈청과

복수에서 각각 82%와 93%의 일치율을 보여 methylation

이 난소암 발생 과정 중 상당히 이른 시기에 일어나며

이를 이용한 조기 진단의 가능성을 시사하였다.

자궁체부암과 CpG island methylation

1997년 Kane 등은 hMLH1 발현이 저하되어 있는 4개의 대장암 조직과 자궁내막암 세포주 AN3CA에 서 hMLH1의 발현 저하는 유전자의 돌연변이 없이 promoter 부위의 methylation에 의해 야기된다고 보고하 였고,

Esteller 등은 유전성 비용종성 대장암 (HNPCC) 과 관련이 없을 것으로 추정되는 자궁내막암 조직 29개 를 조사하여 45%에서 hMLH1 promoter 부위의 methylat- ion을 확인하였다.

또한 이것은 microsatellite instability (MSI)와 깊은 관련을 가진다고 하였다. MSI는 DNA 불 일치 복구 (mismatch repair) 과정과 관련이 깊으며, 이것 은 유전성 비용종성 대장암에서 처음 알려졌는데,

이 러한 환자군들 중에서 대장 외에 가장 흔한 암이 바로 자궁내막암이다.

즉 유전성 비용종성 대장암과 관련된 자궁내막암에서는 DNA 불일치 복구 유전자 (hMLH1, hMSH2, hMSH6)들이 흔히 돌연변이가 되어있는데,

유 전성 비용종성 대장암과 관련 없이 발생하는 자궁내막 암에서는 DNA 불일치 복구 유전자의 돌연변이는 거의

없으며,

methylation에 의한 hMLH1의 불활성화가 발

암 기전에 중요한 역할을 한다는 것이다.

암 억제 유전자의 하나인 PTEN 유전자의 돌연변이는 자궁내막암의 30-50%에서 관찰되는데,

Salvesen 등 은 138명의 자궁내막암 환자에서 PTEN 유전자 promoter 부위 methylation이 약 19% 정도에서 발견되며 이는 자궁내막암의 원격 전이와 MSI 등과 깊은 관련을 보여 주어 발암 기전과의 깊은 관련을 시사하였다.

또한, Macdonald 등도 MSI를 보이는 자궁내막암에서 PTEN 의 methylation이 많이 발견된다고 하였으며,

Goel 등도 비슷한 결과를 보고하였다.

그러나 최근 Zysman 등의 보고에 의하면 PTEN의 염기서열은 highly conserved processed PTEN pseudogene (psiPTEN)과 98%

의 상동성을 보여주고 있으며, 다양한 암 조직과 암 세 포주에서 PTEN이 아니라 psiPTEN이 methylation되어있 음을 확인하여 PTEN methylation 분석에 주의를 기울여 야 한다고 하였다.

p16은 CDK4와 결합하여 세포 주기의 진행을 방해하 는데,

자궁내막암에서 p16 유전자 (p16

)의 변이는

매우 드물다고 알려져 왔다.

그러나, p16의 발현이 자궁내막암에서 저하되어 있다는 점에서 p16의 활성을 저해하는 다른 기전이 있을 것으로 예측되어졌는데,

최근 Wong 등은 자궁내막암의 20%에서 p16

methylation을 보고하였고,

Chao 등은 자궁내막암뿐만 아니라 비정형 자궁내막증식증에서도 methylation을 보 고하여 발암 과정 중 상당히 이른 시기에 p16

methylation이 관여할 것이라고 하였다.

그러나, Semczuk 등은 자궁내막암의 4.2%에서만 p16

methylation을 보고하였고,

Salvesen 등은 0.4%의 methylation을 보 고하여 자궁내막암에서 p16 발현의 저하는 promoter 부위의 methylation과 관계가 없다고 하여 아직은 논란 이 있는 실정이다.

자궁내막암에서 p16의 methylation 에 대한 국내 연구로는 부인종양 이번 호에 게재된 정 등의 연구가 있는데,

21예의 자궁내막암 환자에서 p16 methylation은 2예에서만 발견되어 p16 promoter hypermethylation은 자궁내막 선암종의 발암과정에서 중 요한 경로는 아닐 것이라고 하였다.

에스트로젠 수용체 (estrogen receptor)는 자궁내막암 의 암화 과정에서 상당수 혹은 전부가 소실되는 것으로 알려져 있는데,

이러한 수용체의 소실과 CpG island methylation 사이의 관련은 Maeda 등의 연구와 Navari 등 의 연구가 서로 상반된 결과를 보여주어 아직은 확실치 않다.

또한 최근의 다양한 연구들에 의하여 p14

, HOXA11과 THBS2, RUNX3, APC, E-cadherin 등의 methylation과 자궁내막암 사이의 관련이 보고되고 있 다.

앞서 자궁경부암의 조기 발견에의 응용을 위해 여성 환자들의 탐폰에서 얻어진 세포들에서 methylation을 조 사했던 것과 마찬가지의 연구가 자궁내막암에서도 이루 어졌는데, Fiegl 등은 총 5개의 유전자 (CDH13, HSPA2, MLH1, RASSF1A, SOCS2)들에 대한 methylation 조사를 통해 자궁내막암 환자들의 탈락세포에서는 적어도 3개 이상의 유전자에 methylation이 있었다고 하여 무증상 고 위험 여성에서 선별검사로써의 응용 가능성을 시사하였 다.

결 론

서두에서 언급한 것처럼 암세포에서 CpG island

methylation은 분자진단 및 암의 조기 진단에 활용될 가 능성이 매우 높으며, 유전자의 변이보다는 부유전체적 변이를 정상화시키는 것이 더 쉬울 것이라는 점에서 암 의 치료적 측면에서도 응용 가능성이 높다고 할 수 있 다. 대부분의 암은 초기에 발견되었을 때 생존 가능성이 매우 높아지므로 증상이 없는 환자에게 탁월한 성적을 보이는 조기 진단법을 적용할 수 있다면 암 치료는 현재 보다 훨씬 쉬워질 것이다. 이러한 측면에서 혈장 내로 떨어져 나간 암세포의 DNA를 검출하여 특정암에 특이 한 methylation을 조사하는 방법을 생각해볼 수가 있는 데 이는 진행된 암에서나 검출되는 경우가 많아서 그 적 용이 상당히 어려웠다. 이를 극복할 수 있는 방법은 정 상적으로 암세포의 탈락이 예상되는 신체 부위, 즉 앞서 언급한 것처럼 자궁경부 세포 도말, 혹은 탐폰을 이용한 방법이 부인 종양 분야에서는 응용될 수 있을 것이고, 폐암은 가래나 기관지 세척액 등을 이용할 수 있으며 방 광암은 소변, 두경부암은 침, 전립선암은 소변과 사정액 등을 이용한 연구들이 다양하게 나오고 있다.

또한 methylation 여부 혹은 그 양상의 차이 등은 같은 암을 가진 환자군에서 예후를 짐작할 수 있게 하거나 항암 제에 대한 반응 등을 예측하는데 사용될 수도 있을 것 이다. 즉, 현재로써는 수많은 CpG island와 그와 관련되 어있는 methylation들 중에서 임상적으로 유용한 것들 을 탐색하는 단계에 있지만 머지 않은 장래에는 DNA methylation marker가 암위험도 측정, 조기 진단, 암 절 제 조직에 대한 분자 진단, 항암치료 효과 예측, 재발 감 시 등에 광범위하게 응용될 수 있을 것이다.

참고문헌

1. Antequera F, Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 11995-9.

2. Kundu TK, Rao MR. CpG islands in chromatin organization and gene expression. J Biochem (Tokyo) 1999; 125: 217-22.

3. Nephew KP, Huang TH. Epigenetic gene silencing in cancer initiation and progression. Cancer Lett 2003; 190: 125-33.

4. Ehrlich M, Gama-Sosa MA, Huang LH, Midgett RM, Kuo KC, McCune RA, et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res 1982; 10: 2709-21.

5. Bird AP. CpG-rich islands and the function of DNA methylation.

Nature 1986; 321: 209-13.

6. Costello JF, Fruhwald MC, Smiraglia DJ, Rush LJ, Robertson GP, Gao X, et al. Aberrant CpG-island methylation has non-random and tumour-type-specific patterns. Nat Genet 2000; 24: 132-8.

7. Esteller M. Relevance of DNA methylation in the management of cancer. Lancet Oncol 2003; 4: 351-8.

8. Clark SJ, Melki J. DNA methylation and gene silencing in cancer:

which is the guilty party? Oncogene 2002; 21: 5380-7.

9. Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG. A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res 2001; 61:

3225-9.

10. zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer 2002; 2: 342-50.

11. Schiffman M, Castle PE. Human papillomavirus: epidemiology and public health. Arch Pathol Lab Med 2003; 127: 930-4.

12. Kim K, Garner-Hamrick PA, Fisher C, Lee D, Lambert PF.

Methylation patterns of papillomavirus DNA, its influence on E2 function, and implications in viral infection. J Virol 2003; 77:

12450-9.

13. Badal S, Badal V, Calleja-Macias IE, Kalantari M, Chuang LS, Li BF, et al. The human papillomavirus-18 genome is efficiently targeted by cellular DNA methylation. Virology 2004; 324: 483-92.

14. Virmani AK, Muller C, Rathi A, Zoechbauer-Mueller S, Mathis M, Gazdar AF. Aberrant methylation during cervical carcinogenesis.

Clin Cancer Res 2001; 7: 584-9.

15. Nuovo GJ, Plaia TW, Belinsky SA, Baylin SB, Herman JG. In situ detection of the hypermethylation-induced inactivation of the p16 gene as an early event in oncogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 12754-9.

16. 정대훈, 염미영, 박현경, 김영남, 이경복, 성문수 등. 자궁경부암에 서 p16 유전자 촉진제의 메틸화. 부인종양 2005; 1: 21-26.

17. Dong SM, Kim HS, Rha SH, Sidransky D. Promoter hyper- methylation of multiple genes in carcinoma of the uterine cervix.

Clin Cancer Res 2001; 7: 1982-6.

18. Cohen Y, Singer G, Lavie O, Dong SM, Beller U, Sidransky D. The RASSF1A tumor suppressor gene is commonly inactivated in adenocarcinoma of the uterine cervix. Clin Cancer Res 2003; 9:

2981-4.

19. Ivanova T, Petrenko A, Gritsko T, Vinokourova S, Eshilev E, Kobzeva V, et al. Methylation and silencing of the retinoic acid receptor-beta 2 gene in cervical cancer. BMC Cancer 2002; 2: 4.

20. Cheung TH, Lo KW, Yim SF, Chan LK, Heung MS, Chan CS, et al. Epigenetic and genetic alternation of PTEN in cervical neoplasm.

Gynecol Oncol 2004; 93: 621-7.

21. Widschwendter A, Muller HM, Hubalek MM, Wiedemair A, Fiegl H, Goebel G, et al. Methylation status and expression of human telomerase reverse transcriptase in ovarian and cervical cancer.

Gynecol Oncol 2004; 93: 407-16.

22. Liu SS, Leung RC, Chan KY, Chiu PM, Cheung AN, Tam KF, et al. p73 expression is associated with the cellular radiosensitivity in cervical cancer after radiotherapy. Clin Cancer Res 2004; 10:

3309-16.

23. Reesink-Peters N, Wisman GB, Jeronimo C, Tokumaru CY, Cohen Y, Dong SM, et al. Detecting cervical cancer by quantitative promoter hypermethylation assay on cervical scrapings: a feasibility study. Mol Cancer Res 2004; 2: 289-95.

24. Widschwendter A, Gattringer C, Ivarsson L, Fiegl H, Schneitter A, Ramoni A, et al. Analysis of aberrant DNA methylation and human papillomavirus DNA in cervicovaginal specimens to detect invasive cervical cancer and its precursors. Clin Cancer Res 2004; 10:

3396-400.

25. Cheng P, Schmutte C, Cofer KF, Felix JC, Yu MC, Dubeau L.

Alterations in DNA methylation are early, but not initial, events in ovarian tumorigenesis. Br J Cancer 1997; 75: 396-402.

26. Lin H, Huber R, Schlessinger D, Morin PJ. Frequent silencing of the GPC3 gene in ovarian cancer cell lines. Cancer Res 1999; 59:

807-10.

27. Wiechen K, Diatchenko L, Agoulnik A, Scharff KM, Schober H, Arlt K, et al. Caveolin-1 is down-regulated in human ovarian carcinoma and acts as a candidate tumor suppressor gene. Am J Pathol 2001; 159: 1635-43.

28. Bai T, Tanaka T, Yukawa K, Maeda M, Umesaki N. Reduced expression of death-associated protein kinase in human uterine and ovarian carcinoma cells. Oncol Rep 2004; 11: 661-5.

29. Mhawech P, Benz A, Cerato C, Greloz V, Assaly M, Desmond JC, et al. Downregulation of 14-3-3sigma in ovary, prostate and endometrial carcinomas is associated with CpG island methylation.

Mod Pathol 2004.

30. Shivapurkar N, Toyooka S, Toyooka KO, Reddy J, Miyajima K, Suzuki M, et al. Aberrant methylation of trail decoy receptor genes is frequent in multiple tumor types. Int J Cancer 2004; 109: 786-92.

31. Sutherland KD, Lindeman GJ, Choong DY, Wittlin S, Brentzell L, Phillips W, et al. Differential hypermethylation of SOCS genes in ovarian and breast carcinomas. Oncogene 2004; 23: 7726-33.

32. Terasawa K, Sagae S, Toyota M, Tsukada K, Ogi K, Satoh A, et al. Epigenetic inactivation of TMS1/ASC in ovarian cancer. Clin Cancer Res 2004; 10: 2000-6.

33. Yanaihara N, Nishioka M, Kohno T, Otsuka A, Okamoto A, Ochiai K, et al. Reduced expression of MYO18B, a candidate tumor- suppressor gene on chromosome arm 22q, in ovarian cancer. Int J Cancer 2004; 112: 150-4.

34. Arcellana-Panlilio MY, Egeler RM, Ujack E, Magliocco A, Stuart GC, Robbins SM, et al. Evidence of a role for the INK4 family of cyclin-dependent kinase inhibitors in ovarian granulosa cell tumors.

Genes Chromosomes Cancer 2002; 35: 176-81.

35. Ahluwalia A, Hurteau JA, Bigsby RM, Nephew KP. DNA methylation in ovarian cancer. II. Expression of DNA methyltransferases in ovarian cancer cell lines and normal ovarian epithelial cells. Gynecol Oncol 2001; 82: 299-304.

36. Hattori M, Sakamoto H, Satoh K, Yamamoto T. DNA demethylase is expressed in ovarian cancers and the expression correlates with demethylation of CpG sites in the promoter region of c-erbB-2 and survivin genes. Cancer Lett 2001; 169: 155-64.

37. Chen CL, Ip SM, Cheng D, Wong LC, Ngan HY. P73 gene expression in ovarian cancer tissues and cell lines. Clin Cancer Res 2000; 6: 3910-5.

38. Gupta A, Godwin AK, Vanderveer L, Lu A, Liu J. Hypometh- ylation of the synuclein gamma gene CpG island promotes its aberrant expression in breast carcinoma and ovarian carcinoma.

Cancer Res 2003; 63: 664-73.

39. Vergote I, De Brabanter J, Fyles A, Bertelsen K, Einhorn N, Sevelda P, et al. Prognostic importance of degree of differentiation and cyst rupture in stage I invasive epithelial ovarian carcinoma. Lancet 2001;

357: 176-82.

40. Rathi A, Virmani AK, Schorge JO, Elias KJ, Maruyama R, Minna JD, et al. Methylation profiles of sporadic ovarian tumors and nonmalignant ovaries from high-risk women. Clin Cancer Res 2002;

8: 3324-31.

41. Ibanez de Caceres I, Battagli C, Esteller M, Herman JG, Dulaimi E, Edelson MI, et al. Tumor cell-specific BRCA1 and RASSF1A hypermethylation in serum, plasma, and peritoneal fluid from ovarian cancer patients. Cancer Res 2004; 64: 6476-81.

42. Kane MF, Loda M, Gaida GM, Lipman J, Mishra R, Goldman H, et al. Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of

expression of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch repair- defective human tumor cell lines. Cancer Res 1997; 57: 808-11.

43. Esteller M, Levine R, Baylin SB, Ellenson LH, Herman JG. MLH1 promoter hypermethylation is associated with the microsatellite instability phenotype in sporadic endometrial carcinomas. Oncogene 1998; 17: 2413-7.

44. Thibodeau SN, Bren G, Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon. Science 1993; 260: 816-9.

45. Dunlop MG, Farrington SM, Carothers AD, Wyllie AH, Sharp L, Burn J, et al. Cancer risk associated with germline DNA mismatch repair gene mutations. Hum Mol Genet 1997; 6: 105-10.

46. Wijnen J, de Leeuw W, Vasen H, van der Klift H, Moller P, Stormorken A, et al. Familial endometrial cancer in female carriers of MSH6 germline mutations. Nat Genet 1999; 23: 142-4.

47. Gurin CC, Federici MG, Kang L, Boyd J. Causes and consequences of microsatellite instability in endometrial carcinoma. Cancer Res 1999; 59: 462-6.

48. Katabuchi H, van Rees B, Lambers AR, Ronnett BM, Blazes MS, Leach FS, et al. Mutations in DNA mismatch repair genes are not responsible for microsatellite instability in most sporadic endometrial carcinomas. Cancer Res 1995; 55: 5556-60.

49. Kowalski LD, Mutch DG, Herzog TJ, Rader JS, Goodfellow PJ.

Mutational analysis of MLH1 and MSH2 in 25 prospectively- acquired RER+ endometrial cancers. Genes Chromosomes Cancer 1997; 18: 219-27.

50. Salvesen HB, MacDonald N, Ryan A, Iversen OE, Jacobs IJ, Akslen LA, et al. Methylation of hMLH1 in a population-based series of endometrial carcinomas. Clin Cancer Res 2000; 6: 3607-13.

51. Esteller M, Catasus L, Matias-Guiu X, Mutter GL, Prat J, Baylin SB, et al. hMLH1 promoter hypermethylation is an early event in human endometrial tumorigenesis. Am J Pathol 1999; 155: 1767- 72.

52. Simpkins SB, Bocker T, Swisher EM, Mutch DG, Gersell DJ, Kovatich AJ, et al. MLH1 promoter methylation and gene silencing is the primary cause of microsatellite instability in sporadic endometrial cancers. Hum Mol Genet 1999; 8: 661-6.

53. Kondo E, Furukawa T, Yoshinaga K, Kijima H, Semba S, Yatsuoka T, et al. Not hMSH2 but hMLH1 is frequently silenced by hypermethylation in endometrial cancer but rarely silenced in pancreatic cancer with microsatellite instability. Int J Oncol 2000;

17: 535-41.

54. Horowitz N, Pinto K, Mutch DG, Herzog TJ, Rader JS, Gibb R, et al. Microsatellite instability, MLH1 promoter methylation, and loss of mismatch repair in endometrial cancer and concomitant atypical hyperplasia. Gynecol Oncol 2002; 86: 62-8.

55. Strazzullo M, Cossu A, Baldinu P, Colombino M, Satta MP, Tanda F, et al. High-resolution methylation analysis of the hMLH1 promoter in sporadic endometrial and colorectal carcinomas. Cancer 2003; 98: 1540-6.

56. Tashiro H, Blazes MS, Wu R, Cho KR, Bose S, Wang SI, et al.

Mutations in PTEN are frequent in endometrial carcinoma but rare in other common gynecological malignancies. Cancer Res 1997; 57:

3935-40.

57. Kong D, Suzuki A, Zou TT, Sakurada A, Kemp LW, Wakatsuki S, et al. PTEN1 is frequently mutated in primary endometrial carcinomas. Nat Genet 1997; 17: 143-4.

58. Risinger JI, Hayes AK, Berchuck A, Barrett JC. PTEN/MMAC1 mutations in endometrial cancers. Cancer Res 1997; 57: 4736-8.

59. Salvesen HB, MacDonald N, Ryan A, Jacobs IJ, Lynch ED, Akslen LA, et al. PTEN methylation is associated with advanced stage and microsatellite instability in endometrial carcinoma. Int J Cancer

2001; 91: 22-6.

60. Macdonald ND, Salvesen HB, Ryan A, Malatos S, Stefansson I, Iversen OE, et al. Molecular differences between RER+ and RER- sporadic endometrial carcinomas in a large population-based series.

Int J Gynecol Cancer 2004; 14: 957-65.

61. Goel A, Arnold CN, Niedzwiecki D, Carethers JM, Dowell JM, Wasserman L, et al. Frequent inactivation of PTEN by promoter hypermethylation in microsatellite instability-high sporadic colorectal cancers. Cancer Res 2004; 64: 3014-21.

62. Zysman MA, Chapman WB, Bapat B. Considerations when analyzing the methylation status of PTEN tumor suppressor gene.

Am J Pathol 2002; 160: 795-800.

63. Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, Liu Q, Harshman K, Tavtigian SV, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science 1994; 264: 436-40.

64. Wong YF, Chung TK, Cheung TH, Nobori T, Yim SF, Lai KW, et al. p16INK4 and p15INK4B alterations in primary gynecologic malignancy. Gynecol Oncol 1997; 65: 319-24.

65. Hatta Y, Hirama T, Takeuchi S, Lee E, Pham E, Miller CW, et al.

Alterations of the p16 (MTS1) gene in testicular, ovarian, and endometrial malignancies. J Urol 1995; 154: 1954-7.

66. Nakashima R, Fujita M, Enomoto T, Haba T, Yoshino K, Wada H, et al. Alteration of p16 and p15 genes in human uterine tumours.

Br J Cancer 1999; 80: 458-67.

67. Milde-Langosch K, Riethdorf L, Bamberger AM, Loning T. P16/

MTS1 and pRB expression in endometrial carcinomas. Virchows Arch 1999; 434: 23-8.

68. Shiozawa T, Nikaido T, Shimizu M, Zhai Y, Fujii S.

Immunohistochemical analysis of the expression of cdk4 and p16INK4 in human endometrioid-type endometrial carcinoma.

Cancer 1997; 80: 2250-6.

69. Wong YF, Chung TK, Cheung TH, Nobori T, Yu AL, Yu J, et al.

Methylation of p16^INK4A in primary gynecologic malignancy. Cancer Lett 1999; 136: 231-5.

70. Chao H, Sun J, Lu S. [Methylation and expression of the p16 gene in endometrial carcinoma]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 2000; 22:

228-31.

71. Semczuk A, Boltze C, Marzec B, Szczygielska A, Roessner A, Schneider-Stock R. p16^INK4A alterations are accompanied by aberrant protein immunostaining in endometrial carcinomas. J Cancer Res Clin Oncol 2003; 129: 589-96.

72. Salvesen HB, Das S, Akslen LA. Loss of nuclear p16 protein expression is not associated with promoter methylation but defines a subgroup of aggressive endometrial carcinomas with poor prognosis. Clin Cancer Res 2000; 6: 153-9.

73. 김세진, 정근오, 김아영, 박철민, 이현정, 조영래 등. 자궁내막 암 종에서 p16 promoter 부위의 유전적 이상. 부인종양 2005; 1: 8-20.

74. Pickartz H, Beckmann R, Fleige B, Due W, Gerdes J, Stein H.

Steroid receptors and proliferative activity in non-neoplastic and neoplastic endometria. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol 1990; 417: 163-71.

75. De Cicco Nardone F, Benedetto MT, Rossiello F, Bongiorno M, Iacobelli S, Mancuso S, et al. Hormone receptor status in human endometrial adenocarcinoma. Cancer 1989; 64: 2572-8.

76. Maeda K, Tsuda H, Hashiguchi Y, Yamamoto K, Inoue T, Ishiko O, et al. Relationship between p53 pathway and estrogen receptor status in endometrioid-type endometrial cancer. Hum Pathol 2002;

33: 386-91.

77. Navari JR, Roland PY, Keh P, Salvesen HB, Akslen LA, Iversen OE, et al. Loss of estrogen receptor (ER) expression in endometrial

tumors is not associated with de novo methylation of the 5' end of the ER gene. Clin Cancer Res 2000; 6: 4026-32.

78. Esteller M, Cordon-Cardo C, Corn PG, Meltzer SJ, Pohar KS, Watkins DN, et al. p14^ARF silencing by promoter hypermethylation mediates abnormal intracellular localization of MDM2. Cancer Res 2001; 61: 2816-21.

79. Whitcomb BP, Mutch DG, Herzog TJ, Rader JS, Gibb RK, Goodfellow PJ. Frequent HOXA11 and THBS2 promoter methylation, and a methylator phenotype in endometrial adeno- carcinoma. Clin Cancer Res 2003; 9: 2277-87.

80. Kim TY, Lee HJ, Hwang KS, Lee M, Kim JW, Bang YJ, et al.

Methylation of RUNX3 in various types of human cancers and premalignant stages of gastric carcinoma. Lab Invest 2004; 84:

479-84.

81. Saito T, Nishimura M, Yamasaki H, Kudo R. Hypermethylation in promoter region of E-cadherin gene is associated with tumor dedifferention and myometrial invasion in endometrial carcinoma.

Cancer 2003; 97: 1002-9.

82. Nishimura M, Saito T, Yamasaki H, Kudo R. Suppression of gap junctional intercellular communication via 5' CpG island methylation in promoter region of E-cadherin gene in endometrial cancer cells.

Carcinogenesis 2003; 24: 1615-23.

83. Pijnenborg JM, Kisters N, van Engeland M, Dunselman GA, de Haan J, de Goeij AF, et al. APC, beta-catenin, and E-cadherin and the development of recurrent endometrial carcinoma. Int J Gynecol Cancer 2004; 14: 947-56.

84. Fiegl H, Gattringer C, Widschwendter A, Schneitter A, Ramoni A, Sarlay D, et al. Methylated DNA collected by tampons--a new tool to detect endometrial cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004; 13: 882-8.

85. Belinsky SA, Nikula KJ, Palmisano WA, Michels R, Saccomanno G, Gabrielson E, et al. Aberrant methylation of p16^INK4A is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis.

Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 11891-6.

86. Kersting M, Friedl C, Kraus A, Behn M, Pankow W, Schuermann M. Differential frequencies of p16^INK4A promoter hypermethylation, p53 mutation, and K-ras mutation in exfoliative material mark the development of lung cancer in symptomatic chronic smokers. J Clin Oncol 2000; 18: 3221-9.

87. Ahrendt SA, Chow JT, Xu LH, Yang SC, Eisenberger CF, Esteller M, et al. Molecular detection of tumor cells in bronchoalveolar lavage fluid from patients with early stage lung cancer. J Natl Cancer Inst 1999; 91: 332-9.

88. Chan MW, Chan LW, Tang NL, Tong JH, Lo KW, Lee TL, et al.

Hypermethylation of multiple genes in tumor tissues and voided urine in urinary bladder cancer patients. Clin Cancer Res 2002; 8:

464-70.

89. Rosas SL, Koch W, da Costa Carvalho MG, Wu L, Califano J, Westra W, et al. Promoter hypermethylation patterns of p16, O6- methylguanine-DNA-methyltransferase, and death-associated protein kinase in tumors and saliva of head and neck cancer patients. Cancer Res 2001; 61: 939-42.

90. Suh CI, Shanafelt T, May DJ, Shroyer KR, Bobak JB, Crawford ED, et al. Comparison of telomerase activity and GSTP1 promoter methylation in ejaculate as potential screening tests for prostate cancer. Mol Cell Probes 2000; 14: 211-7.

91. Jeronimo C, Usadel H, Henrique R, Silva C, Oliveira J, Lopes C, et al. Quantitative GSTP1 hypermethylation in bodily fluids of patients with prostate cancer. Urology 2002; 60: 1131-5.