231 책임저자：양미희, 140-742, 서울시 용산구 청파동2가 53-12
숙명여자대학교 약학대학 독성학교실 Tel: 02-2077-7179, Fax: 02-710-9871 E-mail: [email protected]
접수일：2010년 5월 10일, 1차 수정일：2010년 8월 12일, 2차 수정일：2010년 8월 16일, 게재승인일：2010년 8월 19일
Correspondence to：Mihi Yang
Department of Toxicology, College of Pharmacy, Sookmyung Women's University, 53-12, Chungpa-dong 2-ga, Yongsan-gu, Seoul 140-742, Korea
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홍삼섭취가 뇨 중 Bisphenol A 및 MDA 농도에 미치는 영향
숙명여자대학교 약학대학 독성학교실 고민정ㆍ배민지ㆍ양미희
Chemopreventive Effects of Korean Red Ginseng on Urinary Bisphenol A and Malondialdehyde
Min Jung Kho, Min Ji Bae and Mihi Yang
Department of Toxicology, Sookmyung Women's University College of Pharmacy, Seoul 140-742, Korea Bisphenol A [2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane, BPA], an endocrine disrupting chemical, is suspected to have reproductive toxicity or acceleration of carcinogenesis via oxidative metabolites, e.g. reactive quinone or semiquinone. Particularly, fertile women are high susceptible for BPA-induced toxicity for thyroid cancer or pregnancy. Thus, it is important to discover chemopreventive agent against BPA. The Korean Red Jinseng (KRG) exhibited various biological effects including detoxification of xenobiotics and antioxidant activities. In the present study, we performed pharmacokinetic analyses and studied the changes in oxidative stress, e.g. levels of malondialdehyde (MDA), due to KRG intake to clarify chemopreventive effects of KRG against BPA among Korean fertile women. Urine samples were collected from healthy fertile women (N=13; age, 23.50±1.79 yrs). We used reverse phase-HPLC/FLD for analyses of urinary BPA. Limit of detection(LOD) of BPA was 0.2 ng/ml. As results, median of urinary BPA was 2.27 ug/g creatinine. There was weak decrease of urinary BPA with KRG intake (β=－0.04, p=0.57).
In addition, positive association between urinary BPA and MDA levels in this study(β=0.16, and p=0.08) confirmed BPA-induced oxidative stress. Moreover, KRG intake somewhat reduced the levels of MDA (β=－0.06, p=0.12). Thus, our pilot study suggests that KRG is chemopreventive to BPA via antioxidative mechanisms. Pharmacokinetic effects of KRG on BPA, e.g. absorption, metabolism, and excretion of BPA, should be further studied. (Cancer Prev Res 15, 231-235, 2010)
Key Words: Bisphenol A, Ginseng, Pharmacokinetic, running title, Bisphenol A and Ginseng
서 론
내분비장애물질(Endocrine disrupting chemicals)은 ‘생체 내 호르몬의 생산, 분비, 이동, 대사, 결합작용 및 배설에 교란을 일으키는 외부물질’을 말하며 내분비계 암 등 인 체유해물질로 주목되어 왔다.1)
현재 내분비장애물질 중 bisphenol A[2,2-bis(4-hydroxy- phenyl) propane, BPA]와 같은 페놀류 물질들은 산업 및 일상생활에서 다양한 용도로 사용되어 환경 중에서 쉽 게 인체에 노출되기 때문에 지속적인 노출 감시와 노출 방지 등 다양한 예방 대책이 필요한 실정이다. 따라서 BPA의 사용을 줄이는 것이 권장되는 동시에 BPA 노출 에 대항하여 인체를 보호해 줄 ‘방어물질’ 탐색이 시급
하다.
BPA의 경우, 그 독성 기전으로는 세포수준에서 자유 래디칼 생성으로 인한 산화적 손상이나 미토콘드리아 기능의 방해 등이 보고되었고,2,3) 내분비장애물질로써 여성호르몬 유사작용(estrogen mimic)을 통하여 내분비를 교란시키고, 후생유전학적(epigenetic) 변화를 초래하는 기작을 대표적으로 들 수 있다.3) BPA는 명확하게 발암물 질로 규정된 것은 아니나, 태아시기에 BPA에 노출되었 을 경우, 유방조직밀도가 증가 한다는 연구 결과 등 여성 의 유방암 유발 증가 인자로 꾸준히 주목 받아왔고,4,5) Zoeller 등에 따르면 BPA는 갑상선을 표적으로 하여 독성 을 나타낸다고 보고되었다.4) 현재 우리나라의 경우, 국 가 암 정보 센터 암 통계5)에 따르면 2007년 여성에서 발 생한 암의 종류 중에서 갑상선암, 유방암은 각각 1, 2위 의 높은 발생률을 기록한 암으로써 다른 어느 부위의 암 보다 그 예방을 위한 병인 연구가 시급한 실정이다.
또한 내분비장애물질은 임산부, 소아 등 고감수성인 구에서 다양한 건강위해를 나타내는 것으로 조사, 보고 되어,6) 차세대 건강이 향후 국력의 새로운 척도임을 고 려할 때, 내분비장애물질의 표적 장기 특성인 생식기, 면 역계, 신경계, 차세대 독성 등 면에서 내분비장애물질에 가장 감수성이 높은 인구인 소아, 임신부, 나아가 가임기 남녀에 대한 방어물질 개발이 시급하다.7) 특히, 가임기 여성에서 환경 중 내분비장애물질에 대한 노출 저감화는 차세대 건강을 지키기 위하여 선행되어야할 과제이다.
BPA에 대한 방어물질 개발을 위하여 본 연구진은 그 동안 임상시험을 통하여 녹즙 등 수종의 건강기능식품 을 검색하여 왔다.8) 한편, 홍삼(Korean red ginseng, Panax ginseng C. A. Meyer, Araliaceae)은 중금속을 위시하여 다양 한 독성물질에 대한 해독효과9,10)가 보고된 바 있고, phase 2 효소로 quinones을 hydroquinone으로 환원시키는 NAD(P) H dehydrogenase (NQO1) 유도를 통한 항산화 작용은 최근 홍삼의 항암기능성의 기전으로 추정되고 있다.11) 또한, BPA에 의한 독성 및 발암가능성은 그 대사체인 quinone 혹은 semiquinone은 반응성 산소 종(reactive oxygen species) 발생 및 DNA adduct의 가능성이 높아 위험물질 로 주목되고 있다. 따라서 본 연구는 BPA 노출에 대한
‘방어물질’의 후보물질로써 홍삼을 선정하여 BPA에 대 한 해독성, 즉, 화학적 암 예방 가능성을 가임여성을 대 상으로 약동력학적 방법 및 산화적 손상지표인 malondi- aldehyde (MDA)12)에 대한 영향을 중심으로 연구하였다.
재료 및 방법 1. 피험자 및 채뇨
서울에 거주하는 건강한 자원자, 가임기 여성(N=13;
age, 23.50±1.79 years)을 모집하여 홍삼캡슐을 9캡슐(홍삼 분말 2.7 g)/1일을 2주 연속 투여하였고, 아침식전 소변 약 50 ml을 홍삼투여 0, 3, 7 및 14일째에 채집하였다. 뇨 시료는 BPA 오염이 없는 코니컬 튜브(conical tube 50050, polypropylene, SPL, Pocheon, Korea)9)에 차광하여 채집하여
－80oC에 실험 전까지 보관하였다.
피험자 모집에서 연구에 이르는 전 과정은 숙명여자 대학교 IRB를 통과한 프로토콜에 따라 수행하였다.
2. 뇨 중 BPA 분석
BPA (CAS# 80-05-7: Sigma, St. Louis, MO, USA)는 본 연구진이 확립한 분석법10)을 근거하여 분석대상물질인 BPA를 내부표준물질인 bisphenol B (BPB, Tokyo Chemical Industry Company, Tokyo, Japan)와 동시에 정량하고 BPB 면적에 대한 상대면적으로 HPLC/FLD를 이용하여 정량하 였다. 또한, 인체에서 BPA가 100%, phase 2효소인 UDP- glucuronosyltransferase (UGT) 혹은 sulfotransferase (SULT)에 의한 당과 설포닐기의 포함체(conjugated form)로 배설되 는 점과 실험 전에 올 수 있는 BPA의 오염을 보정하기 위하여 가수분해효소를 사용하여 전체 BPA (포합체 BPA와 유리형 BPA의 합)를 측정하고 효소를 쓰지 않고 검출되는 유리형(free form)을 고려하여 전체형에서 유리 형을 뺀 포합체 BPA를 노출지표로 삼았다.
구체적으로, 소변 시료 1 ml을 취하여 유리초자에 넣 고, 1 ng/ml 농도의 내부표준물질 BPB 0.1 ml를 첨가하였 다. 위 반응액에 효소 가수분해를 위하여 2.0 M sodium acetate 60 μl, β-glucuronidase 48 μl (2784 U) (Type H‐1, Sigma)를 각각 첨가하여 진탕 항온수조에서 반응(37oC, 5 시간) 시켰다. 반응 후, 2 N 염산을 200 μl 가한 후, ethylacetate 5 ml를 첨가하고 교반하여(3,000 rpm, 10분) 상층액을 2 ml 취하는 액 추출을 2회 반복하였다. 모아진 상층액 4 ml는 진공 농축하여 60% acetonitrile 300 μl에 녹인 후 그 중 상층액 20 μl를 HPLC에 주입하였다. 유리 형태의 BPA 분석은 β-glucuronidase 대신 동량의 증류수 를 가하여 동일한 과정으로 수행하였다. 또한, 각 뇨 시 료의 진하기를 보정하기 위하여 Ogata와 Taguchi 법11)에 따라 creatinine을 분석하였다.
분석 시스템은 Dual Younglin SP930D pumps (Younglin, Seoul, Korea), MIDAS COOL autosampler (Spark Holland,
Fig. 2. Change s in urinary BPA levels (μg/l) with Korean red ginseng treatment: Y-axis means conjugated BPA.
Fig. 1. Histogram of urinary BPA levels: Y-and x-axes show levels of BPA (μg/l) and probability of all subjects, respec- tively. Right part of figure shows an outlier box plot with the square in the box showing the interquartile range.
Emmen, The Netherlands), Jasco FP‐2020 plus Fluorescence Detector (Jasco, Great Dunmow, UK), XTerra C18 column (5 μm, 4.6×250 mm, Waters, Wexford, Ireland)로 구성되었다.
기울기 용리법(개시, 물%: acetonitrile%, 75:25; 45분, 45:55; 50분, 75:25; 60분, 75:25)으로 유속조건 1 ml/min, 형광 여기파장 225 nm, 방출파장 305 nm의 조건에서 분 석하였다.
소변의 진하기에 따른 농도 보정을 위하여 Ogata와 Taguchi법에 따라 소변 중 creatinine을 정량하였다.13)
3. 뇨 중 MDA 분석
뇨 중 MDA 분석은 다음과 같이 TBA (thiobarbituric acid) 반응에 의해 생성되는 MDA-TBA 반응물을 HPLC로 분석하는 Tagesson14)법을 다소 수정한 본 연구진의 방법 에 따라 분석하였다. HPLC 시스템은 앞의 BPA 측정에 사용한 동일한 HPLC pumps와 autosampler를 사용하였고, SPD-10A UV-VIS detector (Shimadzu, Kyoto, Japan), SunFire C18 column (5 μm, 4.6×130 mm, Waters, Wexford, Ireland) 으로 구성되었다. 이동상은 50 mmol potassium phosphate buffer (pH 6.8): 메탄올, 58:42 v/v로, 유속 0.8 ml/min에서 분석하였다.
4. 통계분석
BPA 농도의 정규분포의 정도는 Shapiro-Wilk W Test법 으로 판정하였으며, 비정규분포성에 기인하여 뇨 중 BPA 농도와 홍삼 투여 기간 관계는 regression analysis를, 기간별 비교는 Wilcoxon test 수행하였다. Histogram 등 본 연구의 모든 통계분석은 JMP Version 4 (SAS Institue, Cary,
NC, USA)를 사용하였으며, 통계적 유의는 p＜0.05로 판 정하였다.
결과 및 고찰 1. 소변 중 BPA 분포
본 pilot study에 참여한 가임기 여성의 뇨 중 BPA level 은 Fig. 1과 같이 측정한계(LOD, 0.2 ng/ml) 이하에서 10.22 ng/ml에 이른다(median, 2.06 ng/ml). 전체 13명의 4 시점 시료 총 42시료 중 4시료에서 BPA가 검출되지 않 았기 때문에, 전체 시료 중 약 91% 시료에서 BPA가 검출 되어 본 연구진에 의해 수행된 최근 연구의 다른 인구군 (약 71% 검출)에 비하여 다소 높은 검출을 보였다.15) 또 한, 뇨 중 BPA의 분포는 0에 가까이 치우치는 분포를 나 타내어(Fig. 1), Shapiro-Wilk W Test에서 p＜0.01 이하로 나타나 정규 분포를 따르지 않았다. 따라서 이하 통계분 석에서는 비 모수 통계법을 수행하였다.
한편, 소변 creatinine 값으로 뇨 중 BPA값을 보정한 결 과, 중간 값은 2.27 μg/g creatinine으로 최근 본 연구진이 분석한 소아에서 BPA 중간 값과 비교하여 2배 이상 낮 았다. Creatinine 보정을 위하여 BPA가 검출되지 않은 시 료 값에 대하여 검출된 시료 중 가장 낮은 BPA level인 0.197의 1/10값을 부여하여 이하 통계를 수행하였다.
2. BPA level에 미치는 홍삼의 영향
Fig. 2와 같이 홍삼 2주 투여경과에 따라 소변 중 BPA level은 다소 감소하였다. 그러나 회기분석 통계결과, 시 간경과에 따른 유의적 BPA level의 감소는 나타나지 않았 다(β=－0.04, p=0.57). 기간별 비교에서 홍삼 투여 전에
Fig. 3. Association between conjugated BPA (μg/l) and MDA levels (μM) in urine samples: β=0.16, and p=0.08 by regres- sion analysis.
Fig. 4. Effects of KRG on urinary MDA levels (μmol/g crea- tinine): β=－0.06 and p=0.12 by regression analysis.
비하여 투여 3, 7일 후에서 각각 BPA level의 중간 값의 감소가 나타나지만 마지막 14일째에서는 투여 전과 큰 차이가 없었다.
BPA의 노출원이 주로 음식물이며, 본 연구를 진행하 는 동안 피험자들은 평소와 유사한 식습관을 유지하도 록 권고하였고, 설문을 통한 음식물 섭취패턴에서 실험 기간동안 식습관의 커다란 변화, 예를 들면 채식주의에 서 육식위주로 식단이 변하는 등의 변화는 없었다. 이러 한 점을 고려할 때, 홍삼투여 초기(3, 7일)에 나타나는 BPA 배설량의 감소에 대하여 홍삼의 직접적 개입이 의 심된다. 현재 홍삼의 cytochrome p450 등 대사효소 유도 등 대사에의 관여는 아직 분명하지 않으므로14) 본 실험 결과로부터 홍삼은 BPA의 흡수, 대사, 배설에 대하여 주 로 BPA에 대한 흡수저해, 이에 따른 대사량 감소 및 배 설 감소가 의심된다.
3. MDA 농도에 미치는 홍삼의 영향
우선, 본 연구에서 Fig. 3과 같이 내분비장애물질 BPA 의 뇨 중 농도와 MDA 농도 사이에는 양의 관계가 나타 나, BPA 노출이 산화적 손상을 증가시키는 것을 예측할 수 있었다. 나아가, 홍삼은 Fig. 4와 같이 홍삼투여기간의 증가에 따라 MDA 농도를 감소시키므로 BPA에 의해 유 도되는 산화적 손상을 감소시키는데 기여함이 기대된다.
실제 홍삼은 다수의 보고에서 항산화효과가 증명되어 왔 고9) 본 연구 결과는 특히 내분비장애물질 BPA에 의하여 유발되는 산화적 손상에 대한 홍삼의 효과를 확인하였으 므로, 내분비장애물질에 대한 방어 기능성을 새로운 홍 삼의 기능성으로 추가할 수 있을 것으로 예상된다.
결 론
본 연구에서 BPA 노출 생체지표로 설정한 뇨 중 포합 체형 BPA 농도와 MDA 농도사이에 양의 관계(Fig. 3)로 부터 BPA는 산화적 손상을 유발함을 예측할 수 있었다.
또한, 홍삼투여에 따른 MDA 농도의 감소(Fig. 4)는 BPA 의 대사, 흡수, 배설 등 직접적인 약동태학적 영향(Fig.
2)보다는 항산화적 효과를 통하여 화학적 암 예방의 기 능성을 확인하였다.
현재 홍삼은 대표적인 대사효소 cytochrome P450에 대 한 영향은 약간 저해하거나 영향이 적은 것으로 보고되 어 있고,14) 항산화효소인 NQO1에 대하여는 세포수준에 서 유도가 확인되었다.16) BPA의 소변 중 배설에 가장 큰 영향을 끼치는 UGT 혹은 SULT에 대하여는 저해가 없거 나,17) 보고가 없는 형편이다. 따라서 홍삼의 BPA에 대한 해독기전에 대하여 대사관련 연구가 더 필요하다. 본 pilot 연구 결과로부터 현재 우리나라 가임성 여성에서 BPA의 폭넓은 노출이 확인되었고, BPA 노출로 유발될 가능성이 높은 산화적 손상에 대하여 홍삼의 해독기능 성이 예상된다.
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