발암성 시험

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발암성 시험

‘발암성시험’은 안전성 평가 시험 중 의약품을 인체로 투여되었 을 경우 생길 수 있는 종양 유발에 관한 내용을 질적, 양적으로 검사하는 시험이다.

환자에게 상당 기간 지속적으로 투약이 예상되는 의약품뿐만 아 니라 의약품의 화학구조 , 화학적 성질, 동물을 이용한 독성시험 혹은 인체 시험결과로부터 발암성이 염려되는 경우 , 발암성시험 이 요구된다.

일반적으로 의약품에서 발암성이 염려되는 경우는 다음과 같다 .

유전독성시험 소견으로부터 사람에게 발암 가능성이 있는 경우 구조적으로 유전독성 또는 발암성이 의심되는 구조-활성 상관성이 있는 경우

반복투여독성시험 결과 전암병변 등 발암성을 시사하는 소견이 나 타나는 경우

모 화합물 또는 대사산물이 장기간 조직에 정체하여 조직 변화나 병적 반응을 야기하는 경우

발암성 시험

임상에서 6개월 이상 지속되는 의약품 외에 , 간헐적이지만 빈번하게 사 용되는 의약품 역시 발암성시험이 요구된다 .

또한 대체치료법이 없는 악성종양을 치료하는 것을 목적으로 하는 항암 제의 경우 발암성시험이 반드시 요구되지는 않지만 , 암 이외의 환자에 적용할 경우에는 발암성시험이 필요하다 .

빈번하지 않고 노출기간이 짧은 의약품(예를 들어 마취약이라든가 방사 성 진단약 등)은 발암의 우려가 없다면 발암성 시험을 필요로 하지 않는 다 . 또한 적용환자군의 예측 생존기간이 3년 이하라면 면제가 가능할 수 있다 .

발암성시험 실시 시기는 시판 승인을 신청할 때까지는 끝낼 필요가 있다 그러나 환자군에 대해 특별히 고려할 필요가 없다면 임상시험 실시 전에 설치류에 의한 발암성시험을 반드시 끝내야 할 필요는 없다 .

특정의 난치성 질환을 치료하는 희귀의 약품에서는 발암성시험이 특별 히 요구되지는 않는다 .

그러나 희귀의약품에서 해제되어 다수의 사람에게 적용되거나 다른 적

응증으로 적용되는 경우는 발암성 시험이 실시되어야 한다 .

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장기발암성 시험 방법

일반적으로 2종의 암수 동물을 사용하는 것이 원칙이다.

선택 가능한 동물 종은 수명이 길지 않고 소형으로서 다루기 쉽고 기 초 자료가 많이 축적되어있는 랫드, 마우스, 햄스터가 주로 이용되고 있다 . 동물의 수명도 계통 선택 시에 고려해야 할 중요한 요소이다.

OECD 기준에 따르면 랫드의 경우 투여 개시 후 24개월, 마우스나 햄 스터의 경우 18개월 시점에서 생존율이 50% 정도 는 되어야 결과의 평가에 무리가 없음을 시사하고 있다 .

발암성 시험 개시 주령은 가능한 빠른 시기에 개시하는 것이 바람직함 일반적으로 검역이나 순화의 시기를 고려해서 보통 6주령 이내 에 시 작한다 .

장기발암성시험의 경우 선택되는 동물 종은 통상 랫드이나 피부도포 의 경우와 같이 마우스가 명확하게 감수성이 높은 경우에는 마우스를 사용한다.

장기발암성 대체시험법

현재 ICH에서는 안전성 주제 S1B

｢

의약품의 발암성시험

｣

에 있어서 비 유전독성의 약품의 경우 2년간의 발암성 시험은 1종 (랫드가 권장됨) 을 사용하고 , 다른 1종의 장기 발암성시험의 대체법 으로 단 ∙중기 설치 류 시험계 (개시촉진모델, 형질전환 설치류 발암 모델, 신생 설치류 모 델)를 제시하고 있다.

설치류를 이용한 2년 발암성 시험 은 시험 비용이 많이 들고 시험기간 이 오래 걸린다는 단점을 가지고 있다.

그 외에도 과학적 측면에서 용량 설정법의 비합리성, 실험동물의 종에 따라 특정 종양이나 병변이 각기 다르게 나타난다는 점, 발암 형태가 유전 독성기전을 보유한 물질인가 비유전 독성 물질의 기전을 보유한 것인가의 차이를 구분하기가 쉽지 않다는 것 등의 단점이 지적되고 있 다.

이를 보완하기 위한 대표적인 대체시험법은 다음 표와 같다 .

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국소독성시험

시험종류

국소독성시험은 피부자극시험 , 안점막자극시험으로 한다.

피부자극시험

시험동물 - 젊고 건강한 백색토끼(2.0 - 3.0kg) 6마리 이상을 사 용한다.

시험방법

투여량은 시험물질이 액체인 경우 0.5ml, 고체 또는 반고체인 경우 0.5g 으로 한다.

도포부위는 털 깎은 등 부위의 피부이고, 2.5cm×2.5cm의 비찰과 피부 2개 부위와 찰과 피부 2개 부위로 한다.

도포 방법은 가로세로 2.5cm의 피부에 시험물질을 적용한 후 가아제 로 덮고, 가아제를 테이프로 고정한다. 가아제의 위에 시험물질의 증 발을 막 기 위해 침투성이 없고 반응성이 없는 고형 재질의 박지로 덮 고 테이프 등을 사용하여 고정한다.

적용부위의 관찰

시험물질 투여 후 24, 72시간에 실시하고 표 1에 의해 평가한다.

국소독성시험

안점막 자극 시험

시험동물

젊고 건강한 백색토끼(2.0～3.0kg)를 사용한다.

시험동물의 양쪽 안구는 시험개시 24시간 전에 미리 안검사를 실시하 여 안구손상 등 각막의 손상이 없어야 한다.

시험방법

점안량은 액체인 경우 0.1ml, 고체 또는 반고체인 경우 0.1g으로 한다 시험물질을 9마리의 토끼 한쪽 눈에 점안하고, 그 중 3마리는 20～30 초 후 양쪽 눈에 미온 무균생리식염수 20ml 정도로 1분간 세안하고, 나머지 6마리는 세안하지 않는다.

관찰

시험물질을 투여하지 않은 다른 쪽 눈을 대조로 하여, 시험물질을 투여

후 1, 2, 3, 4, 7일에 실시하여 표 2에 의해 평가하고, 그 후에도 상해

가 잔존 하면 3일 간격으로, 투여 13일 이상 행한다.

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(표 1) 피부반응의 평가

홍반과 가피형성

홍반이 전혀 없음 ... 0

아주 가벼운 홍반(육안으로 겨우 식별할 정도)... 1

분명한 홍반... 2

약간 심한 홍반... 3

심한 홍반(홍당무 색의 발적)과 가벼운 정도의 가피... 4

총 가능한 홍반 점수... 4

부종 형성 부종이 전혀 없음 …... 0

아주 가벼운 부종(육안으로 겨우 식별할 정도)... 1

가벼운 부종(뚜렷하게 부어 올라서 변연부가 분명히 구별될 경우) ………... 2

보통의 부종(약 1㎜정도 부어 올랐을 경우)... 3

심한 부종(1㎜ 이상 부어오르고 노출부위 밖에까지 확장된 상태) ... 4

총 가능한 부종 점수... 4

국소내성시험

시판되는 제형 혹은 (타당성이 있으면) 유사한 제

형을 사용하여 주사부위의 임상 ․병리학적 평가를

실시한다 . 그러나 단회 혹은 반복투여독성시험에

서 임상에 적용되는 조성 및 제형에 대하여 주사

부위변화를 병리학적으로 검사하였다면 별도의

국소내성시험은 생략될 수 있다 .

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국소독성 시험

‘국소독성시험’은 시험물질이 피부 또는 점막에 국소적으로 나 타내는 자극을 검사하는 시험으로서 피부자극시험 및 안점막 자극시험으로 구분한다.

피부자극시험이란 시험물질이 피부에 접촉하였을 때 피부자극 과 국소염증 (홍반, 부종 등)을 유발하는 물질의 잠재능을 확인 하는 피부독성시험이다 .

피부자극 시험은 1회 접촉에 의해 급성염증이나 피부괴사를 나타 내는 1차 피부자극시험 과 1차 자극에는 염증을 유발하지 않지만 반복접촉에 의해 나타나는 누적자극시험으로 나눌 수 있다 .

특히 여러 물질들이 1차 자극을 일으킬 수 있기 때문에, 이 시험은 인체에서의 피부자극을 예측하기 위한 수단으로 널리 쓰이고 있다

국소독성 시험

안점막 자극시험은 실험동물의 눈에 시험물질을 적용하여 안구 반응을 관찰하는 시험이다.

시험 동물은 주로 토끼를 이용하며, 안구 반응은 각막, 결막, 또는 홍채에서 일어날 수 있으며 부수적인 작용도 알 수 있도록 확대경 을 사용하여 눈을 세심하게 관찰한다.

안점막자극시험으로 일반적으로 ‘드레이즈시험법(draize test)’이 사용되고 있으나 , 이 시험은 눈에 통증이 유발될 수 있어 비인간적 인 실험절차로서 동물애호단체들의 표적이 되어왔다.

이 실험은 눈에 발생되는 고통이 명확한 경우에 안구마취제의 사용 을 허용한다 .

일반적으로 화학물질 중에서 우발적이거나 의도적으로 사람의 안

점막에 접촉 가능성이 있는 물질에 대해서 국소적으로 나타나는 안

자극을 검토하며 사람에게 실제 접촉되는 상황에 준하여 시험한다

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단회투여 흡입독성시험

시험동물

원칙적으로 랫드를 사용하고 그 외의 사유가 있는 경우 포유동물 중에서 선택하여 사용할 수 있다.

동물 수는 각 군당10마리(암․수 각각 5마리) 이상으로 하고, 시험 당시 임신하였거나 임신경력이 있는 암컷은 사용하 지 않는다.

시험방법

시험물질의 투여농도

최소한 세 가지 이상의 농도를 사용하고, 사용할 각 농도는 예비시험을 통하여 결정하거나

가장 높은 농도는LC₅₀값보다는 높지만100% 치사율을 발휘하지 않는 농도를 취하고 중간농도는LC₅₀값 부근,

가장 낮은 농도는LC₅₀값 보다 낮고 전혀 치사를 가져오지 않는 농도보다는 높은 농도를 취한다.

2. 대조군

비투여군 및 용매투여군 등으로 한다.

3. 시험물질 투여 방법

흡입챔버(exposure chamber)를 사용하여 동물을 챔버속에 넣어 시험하거나 머리 부분만 챔버안에 넣어 시험한 다.

선정된 농도의 시험물질을 공기와 섞어 챔버안에 주입시키고, 이때 챔버내의 공기유통은 시간당 12～15회 정도 가 되도록 공기주입 속도를 조절한다. 또한 산소의 비율은 19%, 온도는 22±3˚C, 습도는 30-70%로 유지하여 야 한다.

동물을 챔버에 넣어 시험하는 경우 한 마리씩 따로 사육케이지에 넣어 시험하는 것이 적합하며, 동물이 차지하는 공간은 챔버전체 공간의5%이내가 되어야 한다.

투여시간은 챔버안의 시험물질 농도가 균일하게 된 후4～6시간으로 단회 투여한다.

투여기간동안 챔버내 공기의 주입속도, 온도, 습도를 매 30분마다 기록하고 공기중 시험물질의 실제 농도는 가능 하면 연속적으로 측정하되 최소한 시작과 끝, 그리고 중간에 측정하고, 분무제의 경우 입자크기의 분포를 시작과 끝, 그리고 중간에 각각 측정하여야 한다.

단회투여 흡입독성시험

관찰

관찰기간 - 14일로 하고 동물을 사육하면서 다음과 같은 시험 및 관찰을 한다.

체중은 시험직전과 시험종료시 측정하고 시험기간 중에는 일주일 간 격으로 측정한다.

일반적 독성증세로서 피부, 모피, 안구, 점막, 호흡기계, 순환계, 자율 신경계 및 중추신경계, 운동 및 행동양식, 진전, 경련, 타액분비, 설사 , 기면, 수면과 혼수상태 등을 사육상자 옆에서 매일 관찰한다. 증세 가 나타날 경우 증세, 발병시간, 정도, 지속시간을 기록한다. 관찰기 간 중 사망한 동물은 부검하기 위해 냉동시키고, 쇠약한 동물은 따로 격리한다.

사망동물 및 관찰기간이 끝난 생존 동물에 대하여는 부검, 육안적 관 찰을 실시하고 생존 동물 중 이상이 발견된 장기 ․조직에 대하여는 필 요시 병리조직학적 검사를 실시한다.

시험결과의 기록

LC

₅₀

값과 이의 95% 신뢰도 범위로써 표현하며 일반독성 증세 및 병

리조직학적 시험결과를 기록한다.

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흡입독성시험

‘흡입독성시험’은 기체, 휘발성물질, 증기 및 에어로졸 상태의 물질을 포함하고 있는 공기를 흡입함으로써 , 기관지 및 폐 등을 포함하는 호흡기계 등 인체에 미칠 수 있는 영향을 평가하기 위한 시험법이다 .

단일투여흡입독성

단회투여흡입독성시험은 시험약물을 1회 투여 시 나타나는 독성현상 을 평가하는 시험법으로, 동물 수는 각 군당 10마리 이상(암․수 각각 5마리)으로 하고, 시험 당시 임신하였거나 임신경력이 있는 암컷은 사 용하지 않아야 한다.

검체 투여 군에 최소한 3가지 이상의 농도를 사용하며 각 농도는 예비 시험을 통해 결정하나, 가장 높은 농도는 LC

₅₀

값보다 높지만 100%

치사를 나타내지 않는 농도를 선택하고, 중간 농도는 LC

₅₀

값보다는 낮고 전혀 치사를 가져오지 않는 농도보다도 높은 농도를 선택한다.

이때 시험대조군은 비투여대조군 또는 용매투여대조군을 선정한다.

흡입독성시험

반복투여흡입독성

반복투여흡입독성은 시험물질을 반복하여 장기간 투여함으로써 시험물질의 영향을 평가하는 시험법으로 , 동물은 마우스, 랫드, 기니픽 , 토끼, 개 중 1종 이상으로 하며 각 군당 20마리(암수 각각 10마리) 이상으로 하고, 개의 경우는 8마리(암수 각각 4 마리 ) 이상으로 한다.

시험물질의 투여농도는 최소한 세가지 이상의 농도를 사용하고 , 가장 높은 농도는 시험기간 동안 LC

₁₀

값 이하의 치사율을 일으 키는 농도를 취하고 가장 낮은 농도는 전혀 독성증세를 나타내 지 않으나 실제 사용농도 보다 높은 농도를 취한다 .

대조군은 비투여군 및 필요한 경우 용매투여 군을 둘 수 있으며, 용매투여군의 농도는 투여 군중에서 가장 높은 농도의 용매농도 를 실시한다 .

시험물질 투여방법은 단회투여 흡입독성시험과 동일하며, 시험

기간은 목적에 따라 2주간 또는 28일간 투여할 수도 있다.

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항원성 및 면역독성 시험

항원성시험이란?

‘항원성시험’은 시험물질이 생체의 항원으로 작용하여 나타나는 면역원성 유발여부 를 검사하는 시험을 말한다.

항원성시험에서는 의약품의 항원성, 특히 인체에 대해서 페니실린 쇼크와 같은 심 각한 부작용 및 독성을 유발할 가능성이 있는 의약품을 검색하기 위한 동물시험법 을 제시하고 있다.

이 시험법에서 얻은 결과는 인체에 대한 시험물질의 잠재적인 항원성을 정확하게 예측할 수는 없지만, 시험물질을 반복해서 인체에 투여했을 때 야기될 수 있는 알레 르기 및 과민반응을 예측할 수 있다.

항원성시험은 원칙적으로 모든 의약품에 대해서 실시해야 하며, 특히 화학구조상 생체 내에서 단백질과 강하게 결합할 가능성이 있는 의약품, 펩타이드 또는 단백질 을 성분으로 하는 의약품 및 고분자구조(일반적으로 분자량 5,000 이상)를 가진 의약품의 경우 반드시 실시해야 한다.

또한 제제가 유효성분 외에 새로운 첨가 성분(부형제, 안정화제 등)을 함유한 경우 에는 이들 첨가제에 대해서도 항원성시험 기준에 준하여 실시할 필요가 있다. 항원성의 평가방법으로는 기니픽을 이용한 아나필락시스 쇼크 반응시험 및 동종 수 동 피부 아나필락시스 반응시험 또는 마우스-랫드의 이종 수동 피부 아나필락시스 반응시험이 권장되고 있다.

항원성 및 면역독성 시험

면역독성시험이란 ?

‘면역독성시험’은 반복투여독성시험의 결과, 면역계에 이상이 있는 경우 시험물질의 이상면역반응을 검사하는 시험을 말하며 , 미국의 National Toxicology Program(NTP)을 주축으로 화학물질에 의 한 면역독성 평가에 관한 시험기준이 마련되었다 .

그러나 기존의 독성시험과는 달리 면역계를 구성하는 세포와 각 세

포의 기능이 매우 다양하여 , 단일 항목의 시험만으로는 면역계에

대한 독성평가를 제대로 할 수 없는 관계로 여러 가지 시험항목들

로 구성된 단계별 시스템 (tier system) 을 도입하여 상당히 많은

종류의 시험법들을 사용하도록 하고 있어 이에 관한 종합적인 고찰

이 필요하다 .

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기타 독성 시험

의존성시험

의존성이란 의약품을 반복적으로 사용함에 따라 나타날 수 있는 행동적, 인지적, 생 리적인 현상들을 말한다.

적절한 의존성 시험을 위해서는 의약품의 의존성 평가를 위한 비임상 평가시 물질 의 작용, 화학구조, 약리작용 등 가능한 모든 자료를 고려해야 하며 특히 동물시험 에서 물질이 정서적으로 영향을 미치는지, 약물 구별이 가능한지에 대한 여부, 강화 효과 및 보상효과에 대한 자료를 고려해야 한다.

일반적으로 중추신경계 의약품은 모두 의존성 시험을 하여야 한다.

중추신경계 작용물질을 우선적으로 고려해 시험해야 하지만, 말초 작용물질 중 모 약물(parent drug)과 대사체가 뇌로 이행하여 적정 농도에서 중추 작용을 나타내 는 경우에는 의존성 시험을 실시해야 한다.

의존성 시험의 수행 여부에 대해서는 물질의 농도, 투여 경로, 대사에 의해 결정할 수 있다.

새로운 화학구조계열의 물질이 의존성이 없다고 알려진 기존의 약물과 비슷한 작용 을 가지는 경우에는 의존성시험이 필요하지 않을 수 있다.

그러나 새로운 작용기전을 가지는 물질은 의존성시험을 수행하여야 한다.

의존성을 유발하는 화학구조계열의 물질은 일반적으로 제한된 시험을 실시하며, 이 런 물질에 대한 시험의 범위는 각각의 물질별로 정해야 한다.

의료기관에서 전문가에 의해 투여되는 단일 투여 방사선의약품이나 기타 낮은 용량 으로 투여되는 진단용 의약품은 의존성시험을 수행할 필요는 없다.

기타 독성 시험

독성동태시험 (Toxicokinetics)

개정된 「의약품 등의 독성시험기준」에서는 독성동태를「독성시험 수행 시 시험물질의 전신 노출도를 평가하기 위하여 약물동태학적 자료를 산출 하는 시험」이라 정의하였으며,「시험물질의 노출도와 독성시험에서의

용량 단계 및 시간 경과와의 상관성을 연구하는 것」을 목적으로 한다고

하였다.

용량과의 상관성이란 약물동태가 용량과의 관계에 있어서 직선성이 있는 가 없는가 하는 것을, 시간 경과와의 상관성이란 약물에 의해 자기 저해나 유도, 또한 장기 장해나 연령 증가 등에 의한 변화가 일어나는 지 여부를 염두에 둔 것이다.

2차적인 목적으로서는 노출 양상과 독성 소견을 연관 지어 임상에서의 안 전성 평가에 기여하고, 비임상독성시험에서 동물 종의 선택과 투여와 관 련된 계획 설정에 기여하며, 독성 소견과 관련되어 연이어 계속 수행되는 비임상시험의 계획 수립에 도움을 주는 정보를 제공한다는 것이다.

즉, 독성시험에 의한 노출양상과 독성소견과 연관성을 파악하여, 이러한

소견을 사람의 자료와 비교함으로써, 임상시험의 계획이나 임상에서의 안

전성 평가에 도움이 되도록 하는 것을 목적으로 하고 있다.

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기타 독성 시험

독성동태시험

또한 얻어진 결과는 실시된 독성시험에 대한 종의 선택, 용량설정, 투여 방법 등이 타당한지 아닌지에 대한 판정 및 연이어 계속 수행 되는 독성시험의 계획 수립 시에도 사용될 것으로 기대된다 .

독성동태가 적용되는 독성시험

「의약품 등의 독성시험기준」에서 독성동태에 대해 언급된 독성 시험은 단회투여독성시험 , 반복투여독성시험, 생식∙발생독성시험, 유전독성시험 , 면역독성시험 및 발암성시험 이 있는데 , 언급되지 않은 그 외의 시험에서도 in vivo 동물을 대상으로 하는 경우는 독 성동태 자료가 도움을 제공할 수 있다 .

규제적 관점에서의 고려 사항

신약 개발을 위한 비임상시험 (독성시험과 약리시험) 자료 는 심사과정 의 효율성을 최대화하기 위해 규정에 적합하고 적절한 자료를 요구하고 있다 .

독성에 관한 자료의 경우 식품의약품안전청장이 정한 「의약품 등의 독 성시험기준」에 적합한 자료 또는 시험방법 및 평가기준 등이 과학적으 로 타당성이 인정되는 자료를 제출하여야 하며 , 그 외 국외 ICH 가이드 라인 , 미 FDA 가이드라인, OECD 가이드라인 등을 참고할 수 있다.

비임상시험 성적에 관한 자료는 임상시험을 실시할 수 있는 합리적으로

‘안전하다’는 결론을 내린 근거가 된 실험동물 및 in vitro에서 수행된 약리 및 독성시험자료로서 , 계획하고 있는 임상시험의 기간 및 특성에 따라 필요한 동물의 종류 , 기간, 범위 및 기타 시험의 요건이 달라진다 따라서 의약품 개발 시 규제적 관점에서 다음의 세 가지 주요 쟁점에 대 해 충분히 고려가 되어야 한다 .

충분한 비임상시험(독성시험 및 약리시험) 자료가 제출되었는가?

제출된 자료를 기반으로 안전한 임상시험용량이 제안되었는가?

안전한 임상시험기간이 제안되었는가?

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