244 서 론
방광암은 우리나라 비뇨기암 중 가장 흔한 암으로, 진단 당시 약 70%는 표재성 암으로 발견되는데 경요도절제술 후 50-70%에서 재발을 하고, 약 10%에서는 결국 침윤성 암이 나 전이성 암으로 진행한다.1 또한 방광암의 약 25%에서는 진단 당시 침윤성 암으로 발견되며, 이 환자들의 50%는 이 미 잠재성으로 원격전이가 있고 이 경우 대부분에서 1년 내에 원격전이가 임상적으로 진단된다.2,3 전이성 암의 경우
항암화학요법제를 투여하게 되는데 현재 가장 많이 이용되 고 있는 MVAC (methotrexate, vinblastine, doxorubicin, cisplatin) 혹은 GC (gemcitabine, cisplatin) 조합을 사용하더라 도 대개 2년 내에 사망한다.4,5 따라서 방광암 치료 후 재발 하거나 더 높은 병기로 진행되는 경우 또는 원격전이가 있 는 경우 등에서는 기존의 치료방법만으로는 불충분하며 새 로운 치료방법의 도입이 절실히 요구된다.
최근에 여러 종양들을 대상으로 유전자치료에 관한 연구 가 진행되고 있으며, 자살유전자치료 (suicide gene therapy) 는 그중 많이 이용되고 있는 방법 중의 하나이다. 자살유전
의 자살유전자치료
Suicide Gene Therapy for Bladder Cancer Using a Recombinant Adenovirus Expressing Escherichia Coli Cytosine Deaminase
Miwon Ahn, Ho Yeong Lim1, Chinghai Kao2, Thomas A. Gardner2, Song-Chu Ko3, Se Joong Kim
From the Departments of Urology and 1Hematology-Oncology, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea, 2Department of Urology, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana, and 3Department of Radiation Oncology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, New York, NY, USA
Purpose: The poor prognosis of advanced bladder cancer requires the investigation of novel treatment modalities. In this study, we investigated the suicide gene therapy for bladder cancer, using the adenovirus-mediated expression of Escherichia coli cytosine deaminase (CD) in conjunction with the prodrug 5-fluorocytosine (5-FC).
Materials and Methods: A replication-deficient recombinant adenovirus, which contains the Rous sarcoma virus (RSV) promoter driving the expression of CD, (Ad-RSV-CD) was constructed. In vitro cell-killing assay, using Ad-RSV-CD (20 MOI) plus 5-FC (500 μM), was performed in bladder cancer cell lines, HT-1376, UM-UC-3 and NBT-II. The CD enzymatic activity was measured in the Ad-RSV-CD (20 MOI) infected cells, and the concentrations of 5-fluorouracil (5-FU) yielding an IC50 were calculated for those cells.
Results: 5-FU dose response curve showed that IC50 of NBT-II was 0.8μM, HT-1376 1.0μM and UM-UC-3 5.1μM at day 6. The CD enzymatic activities of the Ad-RSV-CD infected UM-UC-3, HT-1376 and NBT-II cells were 5696, 4655, 1766 pmole/1x106 cells, respectively. Whereas the administration of 5-FC (500μM) or Ad-RSV-CD (20 MOI) alone demonstrated no cytotoxicity to cells, Ad-RSV-CD/5-FC exhibited a significant cytotoxic effect in the cells, especially the UM-UC-3 and HT-1376.
Conclusions: Ad-RSV-CD/5-FC suicide gene therapy is effective for bladder cancer cells in cell cultures, suggesting this approach may have potential as a strategy for the treatment of bladder cancer. (Korean J Urol 2003;44:244-249)
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Key Words: Bladder cancer, Suicide gene therapy, Cytosine deaminase, Adeno- virus
대한비뇨기과학회지 제 44 권 제 3 호 2003
아주대학교 의과대학 비뇨기과학교실,
1종양혈액내과학교실,
2인디아나대학교 비뇨기과학교실,
3콜롬비아대학교 치료방사선과학교실
안미원․임호영1․Chinghai Kao2 Thomas A. Gardner2․고성주3 김세중
접수일자：2002년 10월 2일 채택일자：2002년 11월 18일
교신저자：김세중
아주대학교병원 비뇨기과 경기도 수원시 팔달구 원천동 산 5 ꂕ 442-721 Tel: 031-219-5272 Fax: 031-219-5276 E-mail: sejoong@madang.
ajou.ac.kr 본 연구는 2001년도 아주대학교의료원 정책연구비에 의하여 수행되었음.
자치료는 유전자를 암세포 내에 이입시키고 독성이 없는 전구약물을 투여하면 유전자에 의해 생성되는 효소에 의해 서 전구약물이 활성 독성물질로 바뀌어 세포를 죽이게 되 며, 이때 bystander 효과에 의해 유전자가 이입되지 못한 주 위의 암세포들도 함께 죽이게 되는 방법이다.6-10 자살유전 자치료에 많이 이용되는 유전자로는 단순포진바이러스 티 미딘키나제 (thymidine kinase, TK)와 대장균 사이토신탈아 미노효소 (cytosine deaminase, CD) 유전자가 있다. TK의 경 우에는 전구약물로 항바이러스약제인 ganciclovir (GCV) 혹 은 acyclovir (ACV)를 이용하며, TK가 GCV 혹은 ACV를 인 산화시켜서 생성된 활성물질이 DNA 중합효소와의 상호작 용에 의해 세포의 DNA 합성을 억제시켜 세포를 죽이게 된 다. CD의 경우에는 전구약물로 이용되는 항진균약제인 5-fluorocytosine (5-FC)을 5-fluorouracil (5-FU)로 변환시키고, 5-FU는 다시 세포 내 효소들에 의해 5-fluorouridine 5'-tri- phosphate (5-FUTP)와 5-fluoro-2'-deoxyuridine 5'-monophos- phate (5-FdUMP)로 바뀌어서 결국 세포의 RNA 및 DNA의 합성을 억제시켜 세포를 죽이게 된다. 따라서 TK는 복제 중인 세포 (replicating cell)만을 죽일 수 있는 반면 CD는 복 제 중인 세포와 복제 중이 아닌 세포 (non-replicating cell) 모 두를 죽일 수 있는 장점이 있다.6-10
그리고 유전자를 전달하는 매개체로는 여러 가지 방법들 이 이용되고 있으나 현재 아데노바이러스 (adenovirus)를 이 용한 방법이 가장 많이 이용되고 있으며, 그 이유는 아데노 바이러스 지놈 (genome)이 DNA 재결합기법을 통해 조작하 기가 용이하고, 삽입시킬 유전자에 대한 수용능력이 크며, 아데노바이러스 벡터 (vector)가 안정적이고, 높은 역가의 바이러스를 얻을 수 있으며, 또한 in vitro 및 in vivo에서 여러 종류의 세포에 형질도입이 가능한 장점이 있기 때문이다.11,12 이에 저자들은 방광암의 치료에 있어서 새로운 유전자치료 방법을 개발하기 위한 기초연구로서 Rous sarcoma virus (RSV) 프로모토에 의해 대장균 CD를 발현할 수 있도록 만든 재조합 아데노바이러스 (Ad-RSV-CD)를 이용한 방광암에서의 자살유 전자치료요법에 관한 연구를 진행하였다.
재료 및 방법
1. 세포주 및 세포배양
인체 방광암세포주인 HT-1376, UM-UC-3, 쥐 방광암세포 주인 NBT-II와 transformed human embryonic kidney 세포주 인 293 세포는 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 배양액으 로는 minimum essential medium (MEM, GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA)을 사용하였고, HT-1376 세포주는 배양액
에 0.1mM non-essential amino acid를, UM-UC-3 세포주는 1mM sodium pyruvate를, NBT-II 세포주는 0.1mM non-esse- ntial amino acid와 1mM sodium pyruvate를, 293 세포는 0.1mM non-essential amino acid와 0.2% tryptose phosphate broth를 첨가하였고, 각 배양액마다 10% FBS, 100units/ml peni- cillin, 100mg/ml streptomycin (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA)을 첨가하였다. 각 세포주들은 37oC, 5% CO2 하에서 통상 적인 방법으로 세포배양하였다.
2. Ad-RSV-CD 아데노바이러스의 생산
RSV 프로모토에 의해 대장균 CD를 발현할 수 있도록 만 든 복제되지 않는 (replication deficient) 재조합 아데노바이 러스 (Ad-RSV-CD)를 생산하는 방법은 E1 부위가 결손되어 있는 p△E1sp1 벡터에 RSV 프로모토와 대장균 CD 유전자 를 삽입시킨 p∆E1sp1-RSV-CD와 pJM17을 DOTAP lipo- somal transfection reagent (Boehringer Mannheim, Indiana- polis, IN, USA)와 함께 293세포에 cotransfection시켜서 hom- ologous recombination 과정을 통하여 합성하였다. 합성된 Ad-RSV-CD 바이러스는 각각의 plaque로부터 cloning하여 293세포에서 증폭시킨 후 CsCl2 gradient ultracentrifugation 방법에 의하여 순화시키고 투석 완충액으로 투석을 시행하 여 -80oC 초저온 냉동고에 보관하였다.
3. 5-FU 투여에 따른 방광암세포의 성장억제효과 판정 Ad-RSV-CD/5-FC 자살유전자치료가 방광암세포의 성장 을 억제하기 위하여는 CD에 의하여 5-FC로부터 변환된 5-FU가 방광암세포들에서 성장억제효과가 있어야 하므로, 5-FU 투여에 따른 방광암세포의 성장억제효과를 판정하였다.
각 방광암세포들을 24-well 플레이트에 각 well당 5x103 세포씩 플레이트하여 배양시키고, 24시간 후 (Day 0)에 5-FU (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)를 0, 1, 5, 10, 20, 50μM의 다양한 농도로 투여하였다. 동일한 농도의 5-FU를 함유하는 배양액을 2일 간격으로 갈아주고, 6일째에 crystal violet 염색을 시행하여 세포성장 정도를 측정하였다. 자료는 5-FU를 투여하지 않은 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.
Crystal violet 염색을 시행한 방법은 우선 배양액을 제거 하고 1% glutaraldehyde를 15분간 가하여 세포를 고정시키 고, 0.5% crystal violet을 15분간 처리한 후 물로 세척하고 공기중에서 건조시켰다. Sorenson 용액을 각 well당 500μl 씩 가하여 crystal violet 염색을 용출시킨 후 그중 100μl를 96-well 플레이트로 옮겼다. Microplate reader를 이용하여 파 장 590nm에서 흡광도를 측정하여 각 well당 상대적 세포 수 를 평가하였다.
4. CD 활성도 측정
Ad-RSV-CD 바이러스를 감염시킨 후 각 방광암세포들에 서 실제 CD의 활성도가 나타나는지를 확인하기 위하여 각 세포들에서의 CD 활성도를 측정하였다.
각각의 방광암세포들을 100mm dish에 2x106 세포씩 플레 이트하고 24시간 후에 Ad-RSV-CD 바이러스를 20 multi- plicity of infection (MOI)의 농도로 감염시켰다. 하룻밤 동안 배양시킨 후 배양액을 갈아주고, 48시간동안 세포를 더 배 양시킨 후에 회수하여 세포 수를 측정하고 원심분리해서 세포펠렛을 만든 후 1ml PBS를 가하여 다시 현탁액으로 만 들었다. 냉/해동 (freeze/thaw)을 3차례 시행 후 원심분리하 여 상층액 즉, 세포 용해액 (cell lysate)을 얻어서 CD 활성도 를 측정할 때까지 -80oC 초저온 냉동고에 보관하였다. 또 한 동일한 방법으로 모세포 (parental cell)의 세포 용해액도 얻어서 보관하였다.
얻은 세포 용해액에서 CD 활성도를 측정한 방법은 Kanai 등13이 시행했던 방법과 동일하게 시행하였다. 보관한 용액 중 10μl를 3mM [6-3H]cytosine (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA)을 포함하는 5μl의 CD assay buffer와 섞어서 37oC 에서 60분간 반응시킨 후 345μl의 1M acetic acid를 가하여 반응을 중단시켰다. 반응산물인 [3H]uracil은 SCX Bond Elute
(Varian, Palo Alto, CA, USA) 컬럼을 사용하여 [3H]cytosine으 로부터 분리시켰다. SCX Bond Elute를 1ml 1M acetic acid로 세척한 후 [3H]uracil을 포함하는 반응용액과 0.5ml의 1M acetic acid를 통과시켜 얻은 용액을 scintillation counter를 이 용하여 radioactive count를 측정하였다. 각 방광암세포들에 서의 CD 활성도는 바이러스를 감염시킨 세포에서 얻은 세 포 용해액의 방사능 (radioactivity)에서 바이러스를 감염시 키지 않은 모세포에서 얻은 세포 용해액의 방사능을 뺀 값 으로 하였다.
5. Ad-RSV-CD/5-FC 자살유전자치료의 방광암세포에 대한 in vitro 세포살상효과 판정
각 방광암세포들에서 정상 대조군 (바이러스 혹은 5-FC 를 투여하지 않음), 바이러스 단독투여군, 5-FC 단독투여군, 바이러스 및 5-FC 투여군의 4군으로 나누어 실험을 시행하 였다. 각 방광암세포들을 24-well 플레이트에 각 well당 5x103 세포씩 플레이트하고, 24시간 후에 바이러스를 감염 시키는 군에서는 Ad-RSV-CD 바이러스 20 MOI를 감염시켰 고, 바이러스를 감염시키지 않는 군에서는 배양액만 갈아 주었다. 바이러스를 하룻밤 동안 감염시킨 후 배양액을 갈 아주고 바이러스 감염 24시간 후 (Day 0)에 5-FC를 투여하 는 군에서는 500μM 5-FC (Sigma Chemical, St. Louis, MO,
USA)를 투여하고, 5-FC를 투여하지 않는 군에서는 배양액 만 갈아주었다. 그 후 5-FC를 투여하는 군에서는 2일 간격 으로 500μM 5-FC를 함유하는 새로운 배양액으로 갈아주 었고, 5-FC를 투여하지 않는 군에서는 동일한 방법으로 배 양액만 갈아주었다. 0, 2, 4, 6, 8일째에 한 플레이트씩 crystal violet염색을 시행하여 분석하였다.
결 과
1. 5-FU 투여에 따른 방광암세포의 성장억제효과 5-FU는 방광암세포 모두에서 성장억제효과를 나타내었 고, 5-FU 투여에 의한 50%의 세포성장억제 농도 (IC50)는 5-FU 투여 후 6일째에 NBT-II (0.8μM), HT-1376 (1.0μM), UM-UC-3 (5.1μM)의 순서로 5-FU에 대한 민감도를 나타내
Fig. 2. Cytosine deaminase (CD) enzymatic activities of Ad- RSV-CD infected HT-1376, UM-UC-3, and NBT-II cells are 4655, 5696, 1766 pmole/1x106 cells, respectively.
Fig. 1. 5-fluorouracil (5-FU) dose response curves show that IC50
of NBT-II is 0.8μM, HT-1376 1.0μM, and UM-UC-3 5.1μM at day 6.
었다 (Fig. 1).
2. CD 활성도 측정
CD 활성도를 측정한 결과 UM-UC-3, HT-1376, NBT-II에 서 각각 1x106 세포당 5696, 4655, 1766pmole의 CD 활성도 를 나타내어, 각 세포주에 따라 차이는 있지만 세 방광암세 포주 모두에서 높은 CD 활성도를 나타내었다 (Fig. 2).
3. Ad-RSV-CD/5-FC 자살유전자치료의 방광암세포에 대한 in vitro 세포살상효과
5-FC 단독투여군 혹은 바이러스의 단독투여군에서 5-FC나 바이러스를 모두 투여하지 않은 정상 대조군에 비해 각 방광 암세포들에서 세포성장의 큰 차이를 보이지 않았으므로 전구 약물로 사용한 500μM 농도의 5-FC나 20 MOI의 Ad-RSV-CD 바이러스는 방광암세포들에 별다른 독성이 없음을 확인할 수 있었다. 반면에 Ad-RSV-CD 바이러스와 5-FC를 모두 투여한
군에서는 각 세포주에 따라 차이는 있지만 방광암세포들의 현 저한 성장억제효과를 보였다 (Fig. 3).
고 찰
유전자 재조합 기술의 개발 이후 질병의 진단에서 치료에 이르기까지 의학 분야에 큰 진보를 이루게 되었다. 그 중에 서도 유전적인 질병이나 암, 바이러스성 질병들을 치료하는 유력한 방법으로 유전자치료법이 제시되었는데, 이는 유전 자를 세포 내에 이입시켜서 질병을 치료하는 기술이다.
암에 대한 유전자치료 방법은 크게 세포교정성 (cytocor- rective) 유전자치료와 세포제거성 (cytoablative or cytore- ductive) 유전자치료로 나눌 수 있으며, 자살유전자치료는 후자에 속한다.14 자살유전자치료가 효과를 나타내기 위한 기본 개념 중의 하나로 bystander 효과가 있다. Bystander 효 과는 암세포 중 일부에만 자살유전자가 이입되어도 유전자 Fig. 3. In vitro cytotoxicity assay. Growth of cells, infected with 20 MOI of Ad-RSV-CD virus, was significantly inhibited by addition of 5-fluorocytosine (5-FC) (500μM), especially in HT-1376 (A) and UM-UC-3 (B) cells rather than in NBT-II (C).
가 이입된 세포가 죽으면서 그 주위에 있는 세포들에게도 영향을 미쳐 함께 죽게 되는 효과를 말하며, 전체 암세포의 10% 정도만 유전자가 이입되어도 전체 암세포를 죽일 수
있다.6-10,14,15 이러한 bystander 효과가 나타나기 위해서는 TK
의 경우에는 connexin43에 의한 세극결합 (gap junction)이 반드시 필요한 반면 CD의 경우에는 5-FC로부터 변환된 5-FU가 비촉진확산 (nonfacilitated diffusion)을 통해서 주위 세포로 확산되기 때문에 세극결합이 필요치 않으므로 TK 보다 bystander 효과가 더 강하게 나타날 수 있는 장점이 있
다.16,17 또한 TK의 경우에는 세포의 DNA 합성을 억제시켜
세포를 죽이므로 복제 중인 세포만을 죽일 수 있는 반면 CD는 세포의 RNA 및 DNA의 합성을 억제시켜 세포를 죽 이므로 세포의 복제 상태와 상관없이 세포를 죽일 수 있는 장점이 있다.6-10
따라서 최근에 CD를 이용한 자살유전자치료 방법이 많 이 연구되고 있다. CD는 52-KD 크기의 원핵생물의 (pro- karyotic) 효소로서 여러 세균이나 진균에서 발견되지만, 포 유류세포에서는 발견되지 않는다. CD의 정상적인 기능은 cytosine을 탈아미노화시켜 uracil로 변환시키는 작용을 하 는데, 전구약물인 5-FC를 투여하게 되면 5-FC를 5-FU로 변 환시켜서 결국 세포의 RNA 및 DNA의 합성을 억제시켜 세 포를 죽이게 된다.6-10,18,19 그러므로 재조합 아데노바이러스 를 이용하여 CD 유전자를 암세포에 선택적으로 발현시키 고 독성이 없는 5-FC를 투여하면 암세포에만 국소적으로 5-FU의 농도를 증가시키면서 5-FU의 전신적 독성은 최소 화시킬 수 있으므로 암 치료에 있어서 항암화학요법제의 전신적 투여보다 장점이 있다.
그러나 CD를 이용한 자살유전자치료가 모든 암에서 치 료효과를 나타낼 수는 없다. 그 이유는 이 치료방법이 효과 를 나타내기 위해서는 CD에 의해 5-FC로부터 변환된 5-FU 가 항암효과를 나타내야 하는데 일부 암에서는 5-FU에 대 해 저항하기 때문이다. 5-FU에 대해 저항하는 기전으로는 여러 가지가 제시되어 있는데, 그중 중요한 기전 중의 하나 는 5-FU로부터 변환된 5-FdUMP가 DNA 합성 경로 중 dUMP를 dTMP로 변환시키는데 관여하는 효소인 thymid- ylate synthase를 억제하는 것이 5-FU의 중요한 항암기전 중 의 하나인데, 일부 암에서는 thymidylate synthase 유전자의 증폭, 과발현 및 돌연변이 등을 통해 thymidylate synthase 활 성도가 증가되기 때문이다.20,21
CD를 이용한 자살유전자치료는 위암, 결장암, 간암, 췌장 암, 갑상선암, 폐암, 뇌암, 전립선암 등에서 효과가 있음이 보고되었다.13,17-19,22-26
방광암에서 CD를 이용한 자살유전자 치료에 관한 연구는 이루어지지 않다가 최근에 Peng 등27이 인체 난소암세포주인 Ovcar-5 및 Skov-3과 인체 방광암세포
주인 EJ에서 CD/5-FC가 효과가 있음을 제시하였다.
본 연구에서는 인체 방광암세포주인 HT-1376, UM-UC-3 과 쥐 방광암세포주인 NBT-II에서 CD를 이용한 자살유전 자치료 효과를 확인하여 보았다. Ad-RSV-CD 바이러스를 감염시킨 후 각 방광암세포들에서의 CD 활성도를 측정한 결과 세 방광암세포주 모두에서 높은 CD 활성도를 나타내 었고, 그중 HT-1376과 UM-UC-3이 NBT-II에 비해 더 높았 다. 또한 전구약물로 사용한 500μM 농도의 5-FC와 20 MOI 의 Ad-RSV-CD 바이러스는 사용한 세포들에게 별다른 독 성이 없었고, Ad-RSV-CD 바이러스와 5-FC를 함께 투여하 였을 때 세 세포주 모두에서 현저한 세포성장억제효과가 있었으며, 그 억제 정도는 HT-1376과 UM-UC-3이 NBT-II에 비해 더 높았다. 따라서 Ad-RSV-CD 바이러스 감염 후 세포 에서 발현되는 CD 활성도와 Ad-RSV-CD/5-FC에 의한 세포 성장억제효과 정도가 일치하므로 바이러스로부터 발현되 는 CD에 의해 방광암세포의 성장이 억제되었음을 확인할 수 있었다. CD에 의하여 5-FC로부터 변환된 5-FU가 방광암 세포들에서 성장억제효과가 있는지를 확인하기 위하여 5-FU 투여에 따른 방광암세포들의 성장억제효과를 알아본 결과에서는 세 방광암세포주 모두에서 성장억제효과를 나 타내었고, 오히려 NBT-II가 HT-1376과 UM-UC-3에 비해 더 민감하였다. NBT-II의 경우 5-FU 투여에 따른 세포성장억 제효과는 세 세포주 중 가장 좋으면서도 CD 활성도 및 Ad-RSV-CD/5-FC에 의한 세포성장억제효과가 가장 낮게 나타난 이유는 본 연구에서 실제로 검사해 보지는 못했지 만 아마도 아데노바이러스에 의한 NBT-II 세포의 감염력이 낮기 때문으로 생각된다.
이상으로 본 연구에 이용된 방광암세포들은 모두 5-FU에 의해 성장이 억제되었고, Ad-RSV-CD를 세포에 감염시킨 후 바이러스 내의 CD 유전자가 활성도를 나타내었으며, Ad-RSV-CD/5-FC는 방광암세포들, 특히 인체 방광암세포주 인 UM-UC-3과 HT-1376에서 높은 세포성장억제효과를 나 타내었다. 따라서 CD를 이용한 자살유전자치료 방법은 방 광암의 치료에 있어서 새로운 유전자치료법으로 이용될 수 있으리라 생각된다.
결 론
방광암의 치료에 있어서 새로운 유전자치료 방법을 개발 하기 위한 기초연구로서 HT-1376, UM-UC-3 및 NBT-II 방 광암세포주를 대상으로 Ad-RSV-CD/5-FC를 이용한 자살유 전자치료에 관한 연구를 시행한 결과 Ad-RSV-CD/5-FC는 세 방광암세포주 모두에서 세포성장억제효과를 보였고, 그 중에서도 인체 방광암세포주인 HT-1376과 UM-UC-3에서
특히 높은 효과를 나타내었다. 따라서 CD를 이용한 자살유 전자치료 방법은 방광암의 치료에 있어서 새로운 유전자치 료법으로 이용될 수 있으리라 생각된다.
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