pISSN: 0378-6471 eISSN: 2092-9374 DOI : 10.3341/jkos.2011.52.1.86
= 증례보고 =
동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 돼지각막의 특성 연구
이석현⋅전연숙⋅김재찬 중앙대학교 의과대학 용산병원 안과
목적: 동결-해동-원심분리를 이용하여 각막실질세포를 제거한 무세포 돼지각막편을 만들고, 이의 무세포 돼지각막의 특성을 알아본 후 이종각막이식의 가능성을 모색한다.
대상과 방법: 두께 200 μm 정도의 돼지각막을 효소 및 증류수처리, 급속냉동 및 해동, 원심분리를 한 군(1군), 이를 동결건조처리를 한군(2군), 그리고 화학 효소적 처리를 한 군(3군), 3군을 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다. 조직검사를 시행하여 각막실질세포와 콜라겐 조직을 관찰하였으며, 각 군의 투명성을 비교하였다. 또한 조직배양을 시행하여 실질세포의 생존여부를 확인하였다.
결과: 실험군은 모두 무세포화를 이루어냈다. 조직검사에서 세포가 관찰되지 않았으며, 조직배양에서 세포의 배양이 이루어지지 않았 다. 하지만 1군의 무세포 돼지각막의 투명성은 대조군과 비슷하였지만, 2군과 3군은 투명성이 떨어졌다. 또한 화학적 방법을 이용할 시 콜라겐 조직이 동결-건조-원심분리를 이용한 돼지각막보다 균일하지 못하였다.
결론: 동결-해동-원심분리를 이용한 새로운 무세포 돼지각막의 제작방법은 각막실질조직을 보존하며 무세포화를 이루어냈으며, 이는 항원성이 없어 이종이식의 재료로 이용될 수 있을 것이다.
<대한안과학회지 2011;52(1):86-92>
￭ 접 수 일: 2010년 8월 17일 ￭ 심사통과일: 2010년 10월 14일
￭ 게재허가일: 2010년 12월 9일
￭ 책 임 저 자: 김 재 찬
서울시 용산구 한강로 3가 65-207 중앙대학교 부속 용산병원 안과 Tel: 02-748-9838, Fax: 02-792-6295 E-mail: [email protected]
* 본 논문의 요지는 2010년 대한안과학회 제103회 학술대회에서 구연으로 발표 되었음.
* 본 연구는 보건복지가족부 보건의료연구개발사업의 지원에 의하여 이루어진 것임(과제고유번호: A084721).
동종각막이식은 각막질환의 치료에 매우 효과적으로 높은 성공률을 보이며, 조직이식에서 가장 많은 부분을 차지하고 있다.1,2하지만 각막이식은 다른 조직이식과 마 찬가지로 수요에 비해 공급이 매우 부족한 상태이다. 국 립장기이식센터(Korean Network for Organ Sharing;
KONOS)의 보고에 따르면 각막이식 대기자 수는 2009년 에 1,097명으로 2008년의 3,630명에 비하여 많이 줄어 들기는 했지만, 한 해 이루어지는 각막이식은 약 300여 건으로 대기자에 비해 국내에서 기증되는 각막의 수는 턱 없이 부족한 상태로 많은 환자들이 오랫동안 기다리고 있 는 실정이다.3또한 외상, 감염, 또는 눈수술 후 합병증 등 으로 빠른 시간 내에 각막이식이 필요한 상태에서도 각막 을 구하지 못해서 안구를 유지하지 못하는 경우도 많다.
이러한 각막이식은 전층각막이식과 표층각막이식으로 나 뉘며, 표층각막이식은 각막의 앞쪽 실질조직에 국한된 병
변을 치료하는 데 사용되는 방법이다. 이는 데스메막과 내 피세포를 조작하지 않으며, 전방까지 침투하지 않기 때문에 전층각막이식에 비하여 이식거부반응이나 합병증이 적어서 최근 corneal leukoma, 화학화상, 각막궤양 등의 치료에 많 이 사용되고 있다.4,5하지만 표층각막이식도 현재로서는 기 증각막이 필요하며, 이 때문에 쉽게 사용되지는 못하고 있 는 실정이다.
이에 여러 가지 재료와 디자인을 이용한 인조각막에 대 한 연구가 진행되고 있으며, 이 중 가장 많이 사용되는 것 이 돼지와 같은 포유류를 이용한 것이다.5-7이러한 이종각 막이식은 해부학적 구조가 유사하고 충분한 공급이 가능하 다는 점에서 많은 이점이 있지만 아직 이종각막이식과 관 련된 거부반응은 완전히 해결되지 못하고 있는 실정이다.1,8 이에 이종이식재료의 무세포화는 거부반응을 유도하는 항 원성을 줄이고 구조적, 기능적 단백질인 세포외간질을 보존 한다는 점에서 많은 연구가 이루어지고 있다.9
그동안 이종각막이식을 위한 무세포화는 산 또는 알칼리 를 사용하는 화학적인 방법이 주를 이루었으나5,7이러한 방 법은 염증반응을 일으키고 당아미노다당 등의 중요한 단백 질이 분해되는 부작용이 야기될 수 있다.9,10
따라서 이번 연구는 이러한 부작용을 야기할 수 있는 화 학적 방법이 아닌 물리적 방법으로 무세포돼지각막을 제조 하고 그 특성을 알아보아 이종각막이식의 재료로서의 사용 가능성을 모색해 보고자 하였다.
대상과 방법
어떤 처리도 하지 않은 돼지각막편을 대조군으로 정하고, 다음 3가지 방법으로 무세포 돼지각막편을 제작하여 그 물 리적 및 조직학적 특성을 관찰하고, 세포 생존여부를 확인 하였다. 돼지각막의 무세포화는 동결-해동-원심분리, 동 결-해동-원심분리 후 동결건조, 화학적 방법으로 나누어 수행되었다.
1. 돼지각막편의 준비
돼지각막의 부종을 최소화하기 위하여 도축된 지 2시간 이내의 돼지안구 20안을 4℃moist chamber에 보관한 다 음 2시간 이내에 실험을 진행하였다. 돼지안구를 사람의 실 제 안압인 15~20 mmHg과 비슷하게 하기 위해서 26게이 지 바늘을 이용하여 평형염액(Balanced salt solution, Alcon, USA) 0.3 ml를 시신경을 통하여 주입하고 직접 제작한 수술대 위에 고정시켰다.11 이후 미세각막절개도 (microkeratome, Automated Corneal ShaperⓇ, Chiron Vision, Germany)의 plate # 300 μm를 이용하여 각막편 을 만들었다. 흡입고리를 사용하여 음압이 발생한지 10~
12초가 경과한 후 미세각막절개도로 경첩이 없는 돼지각막 편을 만들었다. 돼지각막편의 두께는 초음파각막두께측정 기(Advent pachymeterTM, Mentor O&O, USA)를 이용하 여 절삭 전에 중심두께를 측정하여 절삭 후 측정한 각막중 심두께와의 차이를 구하여 간접적으로 계산하였다.
2. 무세포 돼지각막편의 제작
무세포 돼지각막편은 무작위로 5안씩 선택하여 세 가지 방법으로 제작되었다. 동결-해동-원심분리를 이용한 군은 준비된 돼지각막편을 40 μ/ml Dnase와 40 μ/ml Rnase (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 혼합용액에 30분간 처리한 다음 증류수에 담가 24시간 처리하고, -196℃액 화질소에서 30분 동결 후 37℃수욕조에서 30분 해빙하는 과정을 3회 반복한 후 원심분리(15,000 rpm, 7분)를 시행 하여 세포가 모두 빠져나가도록 하였다. 이후 3일간 100%
글리세롤에 담가 4℃냉장 보관하여 수분을 제거하였다. 동 결건조처리 무세포돼지각막군은 앞서 시행한 방법으로 무 세포 돼지각막을 만든 후 -80℃에서 48시간 동안 동결건 조처리기(SFDSM06, Samwon Freezing Engineering Co., Seoul, Korea)를 이용하여 제작하였다. 화학적방법을 이용 한 무세포 돼지각막은 0.1 M NaOH에 1시간 동안 처리 후 40 μ/ml Dnase와 40 μ/ml Rnase (Sigma-Aldrich, St
Louis, MO, USA) 혼합용액에 30분간 처리하였으며, 역시 3일간 100% 글리세롤에 담가 4℃냉장 보관하여 수분을 제 거하였다. 모든 제작과정 중간에는 인산완충용액(PBS)으로 세척을 하였으며, 마지막에는 25 kGy의 감마선을 조사하여 무균처리 하였다.
3. 돼지각막편의 특성 연구
1) 투명성비교
4군의 돼지각막편을 숫자판 위에 올려놓고 각각의 투명 성을 비교하였다. 돼지각막편 뒤쪽으로 보이는 글자의 선명 도에 따라서 혼탁도를 0~4로 나누어서 비교를 하였다. 옆 의 숫자와 비교하여 뒤편의 숫자가 똑같이 보이면 혼탁도 0, 옆의 숫자보다 약간 흐리면 혼탁도 1, 옆의 숫자보다 반 정도만 보이면 혼탁도 2, 뒤편의 숫자가 희미하게 보이면 혼탁도 3, 뒤편의 숫자가 완전히 안보이면 혼탁도 4로 정의 하였다.
2) 조직학적 특징 비교
4군의 돼지각막편을 각각 2개씩 4% 파라포름알데히 드(paraformaldehyde)로 고정하여 표본을 제작한 후 Hematoxylin-Eosin (H&E) 염색을 시행하여 세포의 존재 여부를 확인하였다. 또한 Masson’s trichrome (M-T)염색 을 시행하여 콜라겐조직을 관찰하였다.
3) 조직배양을 통한 세포생존 여부 확인
조직검사에서 발견하지 못한 세포의 존재여부를 확인하 기 위하여 기관 배양(organ culture)을 시행하였다. 기관배 양은 4군의 돼지각막편을 각각 2개씩 모두 배양접시에 놓 고 F-배지 (DMEM/F12 [1:1 혼합], 10% FBS, 10 units/
ml penicillin, 10 g/ml streptomycin medium)를 돼지각막 편이 잠기도록 첨가하였다. 이후 37 ℃CO2 배양기에서 배 지를 3일에 한번 교체하며 기관배양을 진행하며 증식하는 세포가 있는 지 9일까지 매일 확인하였다.
결 과
1. 돼지각막편의 두께
절삭 전 측정한 돼지각막의 두께는 910.8 ± 115.6 μm 였으며, 미세각막절개도로 절삭 후 측정한 돼지각막의 두께 는 703.0 ± 136.4 μm였다. 두 값의 차이를 이용하여 구한 돼지각막편 20안의 평균 두께는 207.8 ± 68.2 μm로 측정 되었다.
A B C D
Figure 1. Optical transparency of the porcine cornea. Freezing-thawing-centrifugation-decellurized acellular porcine cornea
(FTC-APC) was transparent (B), similar with fresh porcine cornea (A). But Transparency of chemical enzyme-decellularized acel- lular porcine cornea (CE-APC) decreased about one-third compared to fresh porcine cornea (D). Lyophilized FTC-APC was visu- ally opaque (C).A B
C D
Figure 2. H&E staining showed that no cells were present in Freezing-thawing-centrifugation-decellurized acellular porcine cornea
(FTC-APC) (B), lyophilized FTC-APC (C), and chemical enzyme-decellularized acellular porcine cornea (CE-APC) (D), while many keratocytes were observed in fresh porcine cornea (A). The thickness of CE-APC was thinner than fresh porcine cornea and FTC-APC (A, B, C, D: 200×).2. 돼지각막편의 투명성
숫자판을 이용하여 투명성을 측정한 결과 아무런 처리를 하지 않은 대조군 5안의 투명도는 0.2 ± 0.4 (Fig. 1A), 동 결-해동-원심분리를 이용한 무세포 돼지각막군의 투명도 도 0.2 ± 0.4로 대조군과 같았으며(Fig. 1B), 동결건조처리
한 무세포 돼지각막군은 스폰지화되어 완전히 불투명하여 투명도는 4 ± 0 (Fig. 1C)이였다. 화학적 방법을 이용한 무 세포 돼지각막군의 투명도는 1.6 ± 0.5 (Fig. 1D)이었다.
대조군과 동결-해동-원심분리를 이용한 무세포 돼지각막 군의 투명도 사이에는 통계학적인 차이가 없었으며(p= 0.001, Mann-Whitney 검정), 동결건조처리한 무세포 돼
A B
C D
Figure 3. M-T staining showed that collagen fibers were not well arrayed after decellularizing procedure (B : Freezing-thaw-
ing-centrifugation-decellurized acellular porcine cornea (FTC-APC), C : lyophilized FTC-APC, D : chemical enzyme-decellular- ized acellular porcine cornea (CE-APC)) than fresh cornea (A). Collagen fibers of CE-APC were most irregular (A, B, C, D: 200×).지각막군과 화학적 요법을 이용한 무세포 돼지각막군의 투명 도는 대조군과 비교하여 통계학적으로 투명도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다(p= 0.096, 0.054, Mann-Whitney 검정).
3. 조직학적 검사
각막의 상피조직은 무세포 처리과정에서 특별한 처치 없 이 제거되었다. H&E 염색 결과 대조군 돼지각막편은 각막 실질세포가 콜라겐 조직 사이에 많이 존재함을 확인할 수 있었다(Fig. 2A). 이에 비하여 동결-해동-원심분리를 이 용한 무세포 돼지각막편은 각막실질세포가 관찰되지 않았 다(Fig. 2B). 또한 동결건조처리한 무세포 돼지각막편 역시 각막실질세포가 관찰되지는 않았지만 콜라겐 조직이 매우 성기게 배열됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2C). 마지막으로 화학적 방법을 이용한 무세포 돼지각막편에서도 각막실질 세포가 관찰되지는 않았으나 콜라겐 조직의 불규칙성을 확 인할 수 있었다. 또한 조직의 두께가 다른 군 보다 줄어드 는 것을 볼 수 있었다(Fig. 2D). 콜라겐 조직의 불규칙성은
M-T 염색에서도 확인할 수 있었으며 이는 화학적 방법을 이용한 무세포 돼지각막편에서 가장 심하게 나타남을 알 수 있었다(Fig. 3).
4. 조직배양을 이용한 세포 생존력의 비교
아무런 처리를 하지 않은 대조군은 배양 1일째부터 각막 실질세포가 자라나오기 시작하여 5일째에 급격하게 많은 수의 세포가 자라나와 9일째에는 배양접시를 모두 채운 모 습을 볼 수 있었다(Fig. 4A, B, C). 이에 비하여 동결-해동 -원심분리를 이용한 무세포 돼지각막편(Fig. 4D)과 동결 건조처리한 무세포 돼지각막편(Fig. 4E), 그리고 화학적 방 법을 이용한 무세포 돼지각막편(Fig. 4F) 모두에서는 9일 째까지 각막실질세포가 배양되지 않는 것이 확인되었다.
고 찰
각막이식을 위한 동종조직을 대체할 수 있는 이종조직은
A B C
D E F
Figure 4. Keratocytes grew from fresh porcine cornea rapidly (A: Day 1, B: Day 5, C: Day 9). But keratocyte was not grown from
Freezing-thawing-centrifugation-decellurized acellular porcine cornea (FTC-APC) (D), lyophilized FTC-APC (E), and chemical en- zyme-decellularized acellular porcine cornea (F) until culture day 9.오래 전부터 실험적으로 이용되어 왔다. 1844년 Kissam12 에 의하여 돼지각막을 사람에게 이식한 것이 그 첫 번째였 으며, 1960년대 이후부터 지속적으로 이종각막이식을 시행 하였으나 그 결과는 좋지 않았다.13-15이들 연구의 가장 큰 제한점은 거부반응으로, 다른 종끼리의 이종이식에 의한 초 급성 및 거부반응에 의한 것이었다. 또한 영장류에서 사람 에게 시행된 이종이식에서는 제한적인 이식 성공을 확인할 수도 있었지만 성공률이 높지 않았다.16
하지만 이종이식 후 발생하는 거부반응은 이식되는 조직 에 따라서도 많은 차이를 보인다. 심장, 신장, 소장 등 혈관 이 많은 조직에서는 거부반응의 정도가 심하고 췌장의 인 슐린 분비세포나 소장의 신경세포처럼 혈관이 적은 조직에 서는 거부반응의 정도가 약하였다.17,18각막도 혈관이나 림 프계가 없고, 방수에는 보체계 등의 면역세포의 활성을 억 제하는 물질이 많으며 방수 속에 들어간 조그만 이종 이식 편은 면역반응을 유발하지 않고 장기간 살아있는 것을 관 찰할 수 있으므로 이종이식의 성공 가능성이 높다.19
이러한 증거들을 바탕으로 여러 기관에서 이종 이식이 많이 되었고, 거부반응을 줄이기 위한 방법으로 조직의 실 질세포를 제거하여 항원성을 없애기 시작하였다. 하지만 많은 방법에서 화학적인 방법을 사용해왔다. 즉, 아세트산 (acetic acid), 염산(hydrocholic acid), 황산(sulfuric acid), 그리고 수산화암모늄(ammonium hydroxide) 등을 사용하 여 무세포 조직을 만들었으며 이는 이종각막이식을 위한
무세포화에서도 사용되었다.7,20,21하지만 이러한 화학적 방 법은 당아미노다당을 콜라겐조직으로부터 분해시키고, 콜 라겐조직의 미세조직이 파괴된다. 또한 본래의 조직구조를 분열시키며, 본래의 여러 성장인자를 파괴시켜 버린다.9이 러한 결과는 본 연구에서도 나타났다. 전자현미경을 이용한 관찰이나 중합효소 연쇄 반응 등의 검사를 이용하여 정확 한 조직 및 성장인자의 파괴를 알아보지는 못했지만 화학 적 방법으로 만든 무세포 돼지각막은 다른 군보다 두께도 얇아지고 콜라겐 조직도 불규칙한 것을 볼 수 있었다.
그래서 본 연구에서는 화학적인 방법보다 물리적인 방법 을 이용하여 돼지각막의 무세포화를 이끌어냈다. 동결-해 동 방법을 이용한 무세포화는 그 동안 십자인대, 연골, 신 경, 기도 등에서 이용되어 왔다.22-24동결-해동 방법은 각 기관의 특성에 따라 시간과 횟수가 달라져야 하기에, 본 연 구에서도 여러 차례의 시행착오를 거쳐서 30분의 동결 및 30분의 해동이 돼지각막의 실질세포를 제거하는 데 가장 효과적임을 알아냈다. 이 방법은 갑작스런 조직의 온도 저 하로 인하여 세포 내에 얼음이 만들어지고 이로 인하여 세 포벽이 망가진다. 또한 갑작스런 온도 상승은 추가적인 세 포파괴를 일으킨다. 또한 본 연구에서는 온도 변화뿐 아니 라 물리적인 힘인 압력을 이용한 방법을 시행했다. 압력을 이용한 무세포화는 소장, 방광, 간조직 등에서 이용 되었던
것으로,25,26 저자들은 원심분리를 시행하여 돼지각막에 압
력을 가하였다. 이러한 압력에 의한 무세포화는 세포외기질
의 변화를 최소화하면서 세포를 없애는 것으로서, 원상태의 기질을 보존하는 좋은 방법이다.
세포막을 파괴해서 무세포화를 이루어내더라도 세포 내 유전자, 즉 DNA 혹은 RNA에 의한 항원성이 나타날 수 있 으므로, 본 저자들은 효소를 이용하여 유전자를 없애는 방 법을 택했다. Dnase와 Rnase는 DNA와 RNA의 내부 연결 고리를 가수분해시켜서 없애는 역할을 하며 조직의 원래 모습에는 변화를 일으키지 않으므로 안전하게 사용될 수 있다. 또한 이용된 증류수는 저삼투압 용액으로서 세포를 분해하는 역할을 하며, 이는 동맥, 인대, 심장내판막 등의 무세포화를 이용하는 데 사용되었다.27,28하지만 이 방법은 세포를 파괴하기는 하지만 세포의 잔유물들은 조직 밖으로 분출시키지는 못한다. 그래서 본 연구에서는 효소처리 및 원심분리라는 물리적인 힘을 이용하여 세포 및 세포 잔유 물을 조직 밖으로 꺼내었다.
화학적 방법을 이용한 무세포화보다 균일한 콜라겐 조직 을 가지며, 투명성이 뛰어나고 안정적인 방법인 동결-해동 -원심분리를 이용한 무세포화는 항원성을 없애서 이종이 식의 재료로 사용될 수 있을 것이며, 이를 동결건조시킨 무 세포 돼지각막은 장기간 보관하며 사용될 수 있을 것이다.
앞으로 본 연구에서 소개한 방법으로 제작된 무세포 돼지 각막은 응급상황에서 쉽게 구할 수 없는 인체 각막을 대체 할 수 있기를 기대하며, 추가로 이종 각막이식 실험을 통해 그 임상효과를 알아보는 것이 필요하겠다.
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=ABSTRACT=
The Study of Characteristics of Acellular Porcine Cornea Using Freezing-Thawing-Centrifugation
Seok Hyun Lee, MD, Yeoun Sook Chun, MD, Jae Chan Kim, MD, PhD
Department of Ophthalmology, Chungang University Yongsan Hospital, Seoul, Korea
Purpose: To develop a new decellularization technique of porcine cornea using freezing-thawing-centrifugation (FTC) and to examine the characteristics of acellular porcine cornea (APC) for xenograft material.
Methods: Two-hundred micrometer thickness porcine corneas were decellularized with DNase/RNase, followed by 3 freezing-thawing-centrifugations (FTC, group 1), lyophilized FTC-APC (group 2), and chemical enzyme treated APC (CE-APC, group 3). Histologic evaluation to examine cells and collagen matrix, comparison of transparency, and culti- vation to determine the viability of stromal cells was performed in fresh porcine cornea and 3 experimental groups.
Results: Decellularization occurred successfully in all experimental groups. Decellularization was confirmed by H&E stain- ing and cultivation. Transparency of group 1 was similar to the normal porcine cornea but transparency of group 2 and group 3 was decreased. Collagen fibers of CE-APC (group 3) were not as well arrayed as FTC-APC (group 2).
Conclusions: Acellularity of porcine cornea was successfully achieved by the FTC method with preservation of the cornea stroma. Novel decellularized porcine cornea can be considered as xenogeneic material for corneal transplantation.
J Korean Ophthalmol Soc 2011;52(1):86-92
Key Words: Centrifuge, Decellularization, Porcine cornea, Xenograft
Address reprint requests to Jae Chan Kim, MD, PhD
Department of Ophthalmology, Chung-Ang University Yongsan Hospital
#65-207 Hangangro 3-ga, Yongsan-gu, Seoul 140-757, Korea Tel: 82-2-748-9838, Fax: 82-2-792-6295, E-mail: [email protected]
