한우 GPD1 유전자의 SNP와 육량 및 육질형질과의 연관성 분석

(1)

www.earticle.net

한우 GPD1 유전자의 SNP와 육량 및 육질형질과의 연관성 분석

김준성¹· 방주희²· 신성철¹· 정의룡^1*

상지대학교 동물생명자원학부¹, 서울대학교 의과대학 암연구소²

Association Between the Single Nucleotide Polymorphism of

Glycerol-3-phosphate Dehydrogenase 1 Gene and Meat Yield and Quality Traits in Hanwoo (Korean Cattle)

Jun Sung Kim¹, Ju Hee Bang², Sung Chul Shin¹ and Eui Ryong Chung^1*

1Division of Animal Science and Resources, Sangji University, Wonju 26339, Korea

2Seoul National University Cancer Research Institute, Seoul 03080, Korea

ABSTRACT¹⁾

This study aimed to indentify single nucleotide polymorphisms (SNPs) in exon region of the glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 (GPD1) gene and to evaluate their associations with meat yield and quality traits in Hanwoo (Korean cattle). Two SNP markers, g.2766C>T and g.5105A>G were identified in the exons 5 and 8, respectively. Genotyping of the two SNPs was carried out using PCR-RFLP analysis in 309 Hanwoo steers to evaluate their associations with meat yield and quality traits. As a result, g.2766C>T in exon 5 was significantly associated with carcass weight (CW) and marbling score (MS). Animals with the CC genotype of g.2766C>T had heavier CW than those with the CA or AA genotype. Animals with the CC genotype of g.2766C>T also had higher MS than those with the CA or AA genotype. Additive effect was also observed with CW and MS traits. We constructed haplotypes by linkage disequilibrium analysis and analyzed association between haplotypes and meat yield and quality traits. Haplotype of GPD1 gene was associated with CW. As a result, animals with CA haplotype had heavier CW than TG haplotype. These findings suggest that the SNPs of bovine GPD1 gene may be a useful molecular marker for selection of meat yield and quality traits in Hanwoo.

(Keywords: GPD1 gene, SNP, Carcass weight, Marbling score, Hanwoo)

Ⅰ. 서론

최근 분자유전학적 기술의 발전에 따라 동물 육종개량 연구에 많은 연구 성과가 도출되었으며, 특히 동물 유용유 전자 탐색, 개발 및 이용에 관한 연구에 상당한 성과가 축 적되어 동물 유전정보의 분석 및 이용에 대한 기술은 동물

산업의 핵심기술 분야로 간주되고 있다(Kong et al., 2007;

Lee et al., 2004). 이에 따라, 동물 육종개량에 있어서 세계 적인 추세는 기존의 가축개량 체계가 안고 있는 문제점과 한계점을 극복하고 개량성과를 조기에 달성하기 위하여 전 통적인 통계 육종학적 방법에 첨단 유전물질 분석 기법인 분자유전학적 기법을 접목시켜 상호 보완적인 관계에서

* Corresponding Author: Eui Ryong Chung, Division of Animal Science and Resources, College of Life Science and Natural Resources, Sangji University, Wonju 26339, Korea. Tel: +82-33-730-0541, E-mail: [email protected]

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.ko), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. The moral rights of the named author(s) have been asserted.

[Provider:earticle] Download by IP 118.70.52.165 at Monday, December 20, 2021 7:54 PM

(2)

www.earticle.net

동시에 구사함으로써 동물자원의 육종개량 효율을 최대한 극대화시켜 나가고 있다(Chung et al., 2011a). 특히, 분자 유전학적 기법을 이용하는 MAS(marker-assisted selection) 의 선발육종기술의 개발은 전통적인 선발육종 체계의 한 계성을 초월하여 획기적으로 가축의 유전능력을 증진시킬 수 있는 새로운 첨단 분자육종기술 분야로 인정받고 있다 (Shin et al., 2011a; Shin et al., 2011b,). 이러한 시대적 흐 름에 맞추어 그동안 국내에서도 우리나라 고유의 소 품종 인 한우에서 육량 및 육질 등 주요 경제형질과 관련된 DNA marker 개발에 관한 연구결과가 일부 연구자들에 의 해 보고되는 등 육량 및 육질이 우수한 한우를 조기에 진 단하고 선발할 수 있는 MAS 선발육종기술 개발에 관한 연구가 활발히 수행되고 있다(Bhuiyan et al., 2009;

Cheong et al., 2008; Lee et al., 2014; Lee et al., 2013; Shin and Chung, 2007a; Shin and Chung, 2007b).

본 연구에서 한우의 육량 및 육질형질 관련 기능성 후보 유전자로 선정한 GPD1(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1)유전자는 소의 5번 염색체 상에 위치하고 있으며, FAS (Fas cell surface death receptor) 유전자와 더불어 adipose tissue 지방발생에 중추적인 역할을 하는 marker gene으로 알려져 있다(Swierczynski et al., 2003). 또한, 골격근에서 weight loss에 반하여 인슐린을 향상시켜 triglyceride의 합 성을 저하시키는 기능을 가지고 있어(Park et al., 2006) GPD1 전사체의 발현증가는 비만의 증가와 연관되며, 근육 의 증대 및 지방합성에 관여하는 것으로 보고되어 있다 (Swierczynski et al., 2003). 최근 Serão 등(2013)은 GPD1 유전자의 특정 SNP가 육우의 사료효율과 연관이 있음을 보고하였다. 그러나, 현재까지 한우를 포함한 기타육우품 종들을 대상으로 GPD1 유전자의 SNP와 육량 및 육질형질 과의 연관성을 분석한 연구는 전무하다.

따라서, 본 연구에서는 한우를 대상으로 근육증대 및 지 방합성에 관여하는 GPD1 유전자의 exon 영역 내 SNP를 탐색하여 한우의 육량 및 육질형질과 밀접하게 연관되어 있는 SNP를 발굴하여 고품질 우량 한우의 조기선발에 활 용 가능한 새로운 SNP marker를 개발하고자 수행하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 공시재료 및 genomic DNA 분리

본 연구에 사용한 한우는 농협중앙회 서산 한우개량사

업소에서 수행하고 있는 국가 능력검정사업에 등록하고 후대검정을 통하여 혈통기록과 검정성적이 보유된 후보 종모우 총 309두의 혈액을 공시재료로 선정하였다.

각 공시재료의 혈액으로부터의 genomic DNA 분리 및 정제는 Miller 등(1988)의 방법을 일부 변경하여 실시하였 다. 혈액으로부터 추출한 DNA는 TE buffer(10mM Tris- HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)에 용해하였고, 추출한 DNA는 UV-spectrophotometer로 농도 및 순도를 측정한 후 -20℃

의 냉동고에 보존하여 공시재료로 사용하였다. 2. 한우 GPD1 ^유전자의SNP 탐색 및 검출

한우 GPD1 유전자의 SNP를 exon 영역 내 존재하는 SNP 탐색 및 발굴을 위해 primer 3 software program(http://

www.bioneer.co.kr/tools/)을 이용하여 Table 1에 제시한 총 5개의 primer를 설계 및 제작하여 PCR 증폭 반응을 수 행하였다. GPD1 유전자를 대상으로 한우 개체 간 SNP를 탐색하기 위해 공시재료 총 309두 가운데 혈연관계가 없는 총 24두의 한우 genomic DNA를 이용하여 pooled DNA 를 제작하고 이를 template DNA로 사용하였다. PCR 증폭 반응은 SimpliAmp^TMThermal Cycler(Applied Biosystems, USA) 장비를 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였 다. 0.2㎖ PCR tube에 template DNA 50ng, forward 및 reverse primer 각각 10pM, dNTP 250μM, 10X PCR buffer 2㎕, 그리고 Taq DNA polymerase 1 unit을 첨가하 여 총 20㎕의 PCR 반응액을 조성하였다. 반응 조건은 예 비 가열 94℃ 5분, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 40초로 35회 반복한 다음 마지막에 72℃에 5분을 주어 PCR 반응을 종 료하였다. PCR 종료 후 5㎕의 PCR 증폭산물을 2%

agarose gel에 전기영동하여 PCR 증폭반응의 성공 여부를 판단하고, PCR 증폭산물에 대한 direct-sequencing을 수행 하기 위하여 Gel&PCR Purification system kit(Solgent, Korea)를 이용하여 PCR 증폭산물을 정제하였다. Direct- sequencing 분석은 정제된 PCR 증폭산물을 forward 및 reverse primer를 각각 다른 tube에 분주하고, BigDye Ver.

3.1 sequencing kit(Applied Biosystems)을 이용하여 양방 향으로 direct sequencing 반응을 수행하였다. 일차 반응산 물을 ZR DNA Sequencing Clean-UP kit(Zymo Research, USA)을 이용하여 BigDye 및 primer를 제거한 다음 70%

ethanol로 세척하여 sequencing 반응물을 정제하였다. 그 다음 10㎕의 formamide로 반응물을 현탁하고 95℃에서 2 분간 변성 및 급속 냉각 과정을 거쳐 61cm의 capillary를 장착한 ABI 3730 DNA analyzer(Applied Biosystems)을

(3)

www.earticle.net

Table 1. Primer sequences for SNP search of GPD1gene in Hanwoo

Primer name Primer sequences (5´ - 3´) Location Product size

(bp) Region GenBank

accession no.

GPD1-1 F-CTCAGGCAGAGAAGCAGCAC

R-GTGTTGGGGCTCACCACATT 16-776 761 exon 1-2

NC_007303 GPD1-2 F-CCACAGGGGCTAGAAGCAGT

R-CGCTCCCCAATCACTTCAGAG 1517-2336 820 exon 3-4

GPD1-3 F-CTCAGTTGGGGTAAAAGGCAC

R-GAGTGATCCTGGCTTTGCTTC 2233-2931 699 exon 5

GPD1-4 F-TCTCACCCATGACTCCACTCTT

R-ATGCACTAGCTGGGGACAGTG 3422-4200 779 exon 6-7

GPD1-5 F-GGATCAGAGAGGTTAAGTGGCT

R-CCATTTGGAGAGGGACTAGGCA 4681-5280 600 exon 8

F, forward primer; R, reverse primer.

이용하여 염기서열을 분석하여 GPD1 유전자의 SNP를 탐 색 및 발굴하였다.

3. 한우 GPD1 ^유전자의SNP genotyping

DNA 염기서열 분석을 통해 검출된 한우 GPD1 유전자 의 g.2766C>T 및 g.5105A>G에 대한 SNP genotyping을 수행하기 위해 PCR-RFLP(Restriction fragment length polymorphism) 분석을 수행하였다. g.2766C>T SNP에 대 한 RFLP 분석을 위해 Table 1에 제시된 GPD1-3 primer와 HeaⅢ(5'-GG^↓CC-3') 제한효소를 이용하였으며, g.5105A>

G SNP에 대한 RFLP 분석에는 GPD1-5 primer와 NlaⅣ (5'-GGN^↓NCC-3') 제한효소를 이용하여 각 검정대상 한우 개체별 SNP genotyping을 수행하였다. PCR-RFLP 분석은 총 309두의 각 개체별 PCR 증폭산물 5㎕에 2 unit의 제한 효소를 첨가한 후 각 제한효소의 최적 활성온도인 37℃에 서 약 3시간 반응시켰다. 제한효소로 절단하여 얻어진 각 SNP별 DNA 단편들은 1X TBE buffer(90mM Tris-borate, 2mM EDTA, ph 8.3)를 이용하여 2.5% agarose gel에서 100V 전압으로 2 시간 동안 전기영동하고 EtBr(ethidium bromide)로 염색한 후, DNA 단편 양상을 분석하여 각 SNP에 대한 유전자형을 판정하였다. 판정된 각 genotype 별 PCR 증폭산물을 Gel&PCR Purification system kit(Solgent)를 이용하여 정제하고, ABI 3730XL Genetic Analyzer(Applied Biosystems)를 이용하여 direct sequencing 분석을 수행한 후 염기서열 분석 결과를 검증하여 최종적 으로 SNP genotype을 결정하였다.

4. 한우 GPD1 ^유전자의SNP와 육량 및 육질형질과의 연관성 분석

GPD1 유전자의 각 SNP marker별 대립유전자 및 유전 자형 출현빈도를 분석하고, SNP 유전자형에 대한 이형접 합체율(He)과 다형정보량(PIC)을 분석하여 각 분자표지별 다형성을 비교 분석하였다. 또한, 각 SNP marker별 χ² 통 계검정을 수행하여 검정 집단에 대한 하디-와인버그 평형 여부를 분석하였다.

후대검정우 총 309두를 대상으로 수행한 주요 SNP들에 대한 SNP marker genotyping 분석 결과와 한우 육량 및 육질형질 관련 도체성적 표현형 측정치와의 연관성 통계 분석을 통해 각 SNP marker별 유전자형의 효과를 추정하 였다. 즉, 생시체중(live weight, LW), 도체중량(carcass weight, CW), 등지방두께(backfat thickness, BF), 배최장근 단면적(Longissimus dorsi muscle area, LDA) 및 근대지방 도(marbling score, MS) 등 도체성적 표현형 측정치와 각 SNP marker의 연관성을 분석하였다. 각 도체형질별 표현 형 측정치에 대한 검정대상 집단의 평균값, 표준편차 및 최대값과 최소값은 Table 2에 제시하였다.

각 SNP marker 유전자형과 한우 육량 및 육질형질 관련 도체성적 표현형 측정치와의 통계분석은 SAS 9.2 Package/PC를 이용하여 아래에 제시한 통계 모형으로 ANOCVA(analysis of covariance, 공분산분석)을 수행하였 다.

Yijklm=μ+Si+YSj+Pk+Gl+A(cov)m+eijklm

(4)

www.earticle.net

Table 2. Means and standard deviations (SD) and extreme values of phenotypic values on carcass traits in Hanwoo (n=309)

Traits Mean SD¹⁾ Minimum Maximum

LW (㎏) 538.22 51.56 390.00 690.00

CW (㎏) 307.29 32.55 212.00 401.00

BF (㎝) 0.70 0.28 0.20 1.80

LDA (㎠) 75.46 8.19 54.00 97.00

MS (1～9) 2.35 1.42 1.00 7.00

LW, live weight; CW, carcass weight; BF, backfat thickness; LDA, Longissimus dorsi muscle area; MS, marbling score.

1)Means of standrd deviations.

여기에서, Yijklm = 도체형질에 대한 표현형 관측치

Si = 종모우에 대한 임의효과

YSj = 분만 년도 및 계절에 대한 고정효과 Pk = 분만 장소에 대한 고정효과

Gl = SNP genotype에 대한 고정효과 A(cov)m = 도축일령에 대한 공변량

eijklm = 임의오차 값

각 SNP marker 별로 SNP 유전자형 효과의 유의성이 나 타난 형질들에 대해서는 던컨의 다중검정을 수행하여 유전 자형별 유의성을 검정하였으며, 각 도체형질들에 대한 분자 표지의 상가적효과(additive effect)와 우성효과(dominance effect)를 추정하였다. 참고로 각 형질별 육종가추정치의 경 우 상기 통계모형에서 환경효과를 제외한 SNP 유전자형 고정 효과에 대한 연관성 통계분석을 수행하였다.

5. 한우 GPD1 ^유전자의haplotype과 육량 및 육질형질 과의 연관성 분석

한우 GPD1 유전자의 haplotype과 육량 및 육질형질과 의 연관성 분석을 위해 연관불평형(linkage disequilibrium, LD) 분석을 통해 각 SNP pair 간의 Lewontine's D(|D'|) 값(Hedrick et al., 1987)과 두 개 SNP 간의 상관계수(r²)를 추정하여 통계적 상관관계 정도를 분석하였다. 본 연구에 서는 SNP pair 간 강한 연관불평형을 나타내는 SNP 조합 에 의한 haplotype을 구성하기 위하여 HaploView 4.0 프 로그램을 이용하여 D'의 값이 0.7 이상이 되는 SNP 조합 에 의한 haplotype block을 구성하였다. 한우 GPD1 유전 자의 haplotype과 육량 및 육질형질과의 연관성 분석은 각 개체의 haplotype 조합들이 임의적으로 다음세대에 유전 되기 때문에 앞서 제시한 통계 모형의 SNP genotype에 대 한 고정효과만 haplotype 임의효과로 변경 설정하여 통계

분석을 수행하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 한우 GPD1 ^유전자의SNP 검출

한우 집단을 대상으로 GPD1 유전자의 exon 영역 내 SNP를 탐색한 결과 exon 5번 영역에서 g.2766C>T SNP, 그리고 exon 8번 영역에서 g.5105A>G SNP 등 총 2개의 SNP를 검출하였다. 이들 두 개 SNP는 한우에서 발굴된 신 규 SNP로서 coding 영역에 포함되어 있으나 아미노산 치 환에는 관여하지 않는 synonymous SNP인 것으로 분석되 었다. 즉, g.2766C>T에서는 C 염기가 T로 치환되었으나 (GCC→GCT) Alanine에서 Alanine으로, g.5105A>G에서도 A 염기가 G로 치환되었으나(GGA→GGG) Glycine에서 Glycine으로 아미노산 치환에는 영향을 미치지 않는 synonymous SNP인 것으로 분석되었다.

2. 한우 GPD1 ^유전자의SNP genotyping

검출된 2개의 GPD1 유전자 exon 영역 내 SNP에 대한 각 한우 개체별 SNP genotyping을 수행하기 위해 PCR-RFLP 분석을 수행하였다. Fig. 1(A)에 제시한 바와 같 이 g.2766C>T SNP에 대한 RFLP 분석을 결과 CC, CT 및 TT 세 종류의 유전자형에 대응하는 각각의 DNA band가 검출되었다. 즉, CC 유전자형을 가진 개체들은 61, 62, 74, 106 및 396bp의 크기를 갖는 총 5개의 DNA band가 검출 되었고, TT 유전자형을 가진 개체들은 62, 74, 106 및 497bp의 크기는 갖는 총 4개의 DNA band가 검출되었다.

그리고 CT 이형접합체는 이들 6개의 DNA band가 모두 검 출되었다. 참고로 Fig. 1(A)에서 61 및 62bp의 DNA band

(5)

www.earticle.net

(A) g.2766C>T

(B) g.5105A>G

Fig. 1. PCR-RFLP patterns showing different genotypes of the each SNP of GPD1gene in Hanwoo. M: 100 bp DNA ladder. (A) PCR-RFLP patterns and chromatograms of the each SNP genotypes of g.2766C>T. (B) PCR-RFLP patterns and chromatograms of the each SNP genotypes of g.5105A>G.

Table 3. Genotype and allele frequencles for SNP markers of theGPD1gene in Hanwoo

SNP marker Frequencies (%)

He¹⁾ PIC²⁾ HWE³⁾

SNP genotype SNP allele χ² p-value

GPD1 g.2766C>T

CC CT TT C T

0.629 0.558 0.144 0.930

27.2 49.0 23.8 51.7 48.3

GPD1 g.5105A>G

AA AG GG A G

0.629 0.554 0.585 0.746

33.3 46.9 19.7 56.8 43.2

1)heterozygosity;²⁾polymorphic information content;³⁾Hardy-Weinberg equilibrium.

는 DNA 단편의 크기가 매우 유사하여 하나의 band 형태 로 검출되었다. Exon8 영역 내 g.5105A>G SNP에 대한 RFLP 분석의 경우 Fig. 1(B)에 제시한 바와 같이 AA, AG 및 GG 세 종류의 유전자형에 대응하는 DNA band가 검출 되었다. 즉, AA 유전자형을 가진 개체들은 7, 87, 236 및 270bp 크기를 갖는 총 4개의 DNA band가 검출되었으며, GG 유전자형을 가진 개체들은 7, 79, 87, 157 및 270bp 크 기를 갖는 5개의 DNA band가 검출되었다. 그리고 AG 이 형접합체는 이들 6개의 DNA 단편이 모두 검출되었다. 참 고로 분자량이 작아 DNA band의 발현이 미약한 7bp 크

기의 단편은 그림에서 제외하였으며, 79 및 87bp의 DNA band는 DNA 단편의 크기가 유사하여 하나의 band 형태 로 검출되었다.

후대 검정우 309두를 대상으로 PCR-RFLP 기법으로 분 석한 GPD1 유전자 유전자의 유전자형 빈도와 대립유전자 빈도는 Table 3에 제시하였다.GPD1 유전자의 g.2766C>T SNP에 대한 유전자형 빈도는 CC형 27.2%(84두), CT형 49.0%(151두) 및 TT형 23.8%(74두)로 CT형이 가장 높게 나 타났고, TT형이 가장 낮게 나타났다. 대립유전자의 빈도는 C 대립유전자가 51.7%, T 대립유전자가 48.3%로 C 대립유

(6)

www.earticle.net

전자가 T 대립유전자보다 높게 나타났다. g.5105A>G SNP 에 대한 유전자형 빈도는 AA형 33.3%(103두), AG형 46.9%(145두) 및 GG형 19.7%(61두)로 AG형이 가장 높게 나타났고, GG형이 가장 낮게 나타났다. 그리고 대립유전 자의 빈도는 A 대립유전자가 56.8%, G 대립유전자가 43.2%로 G 대립유전자가 A 대립유전자보다 높은 것으로 분석되었다. 각 SNP marker의 이형접합체율은 Table 3에 제시하였으며, χ² 통계검정을 통한 하디-와인버그 평형여 부를 분석한 결과 2개 SNP marker 모두 검정집단 내에서 유전적 평형상태를 이루고 있는 것으로 분석되었다.

3. 한우 GPD1^유전자의SNP marker와 한우 육량 및 육 질과의 연관성 분석

후대검정우 총 309두를 대상으로 수행한 GPD1 유전자 의 각 SNP marker들에 대한 SNP geotyping 결과와 한우 육량 및 육질형질 관련 도체성적 표현형 측정치와의 연관 성 통계 분석을 통해 각 SNP marker 유전자형이 육량 및 육질형질에 미치는 효과를 추정하였다. GPD1 g.2766C>T SNP의 경우, Table 4에 제시한 바와 같이 도체중량(CW) 및 근내지방도(MS) 유의적 연관성이 입증되었다(p<0.05).

유의적 연관성이 입증된 형질들에 대한 Duncan's multiple range test를 수행하여 SNP 유전자형별 유의적 차이를 검 정한 결과 SNP 유전자형 간의 유의적 차이가 있는 것으로 나타났으며, 동시에 고도의 상가적 효과가 입증되었다

(p<0.01). 즉, CC 유전자형을 가진 개체들이 TT 유전자형 을 가진 개체들에 비해 도체중량이 약 23.967kg 정도 유의 적으로 높고, 근내지방도가 약 0.844 정도 유의적으로 높게 나타났다. 따라서, GG 유전자형을 가진 개체들이 CC 유전 자형을 가진 개체들 보다 도체중량 및 근내지방도 등 육량 및 육질형질 관련 유전 능력이 우수한 것으로 분석되었다. 반면 exon8번 영역의 g.5105A>G SNP에서는 Table 4에 제 시된 바와 같이 그 어떤 형질과도 유의적 연관성이 없는 것으로 분석되었다.

4. 한우 GPD1 ^유전자의haplotype과 육량 및 육질형질 과의 연관성 분석

연관불평형 분석은 각 SNP pair 간의 Lewontine's D(|D'|) 값(Hedrick et al., 1987)과 두 개 SNP 간의 상관 계수(r²)를 추정하여 통계적 상관관계가 어느 정도 되어 있 는지를 나타내는 것으로서 Kim 등(2010)에 따르면, 연관불 평형의 유의수준은 D'>0.5와 r²>0.1 으로 보고하였다. 또한, Gabriel 등(2002)의 보고에 의하면, 95% 신뢰구간에서 D' 의 값의 상한치가 0.98이상이고, 하한치가 0.7 이상이 되면 강한 연관불평형이 되는 것으로 보고하였다. Gabriel 방법 에서는 D'에 기반을 둔 pariwise SNP를 이용하여 유전자 재조합이 많이 일어나서 변이가 생긴 지역을 찾고 block을 유전자 재조합이 거의 일어나지 않았거나 일어나지 않은 연속적인 SNP의 세트로 정의하였다 즉, Haplotype Block

Table 4. Association of SNP markers of GPD1gene with meat yield and quality traits in Hanwoo

markerSNP Traits Mean±SE of SNP genotypes (n=309) p-value Effect

Additive Dominance

CC CT TT

g.2766C>T

LW (㎏) 549.75±7.44 546.06±5.05 525.78±10.94 0.175 23.96±13.23 -16.58±16.65 CW (㎏) 317.19±2.58^a 303.32±2.11^ab 298.26±3.73^b 0.009 18.93±5.14^** -11.19±10.25

BF (㎝) 0.69±0.04 0.77±0.03 0.68±0.06 0.218 0.01±0.08 -0.17±0.10

LDA (㎠) 79.85±1.25 77.02±0.85 74.10±1.84 0.348 2.74±2.22 -3.08±2.80 MS (1～9) 3.31±0.16^a 2.84±0.07^ab 2.47±0.18^b 0.019 0.84±0.26^** -0.50±0.58

g.5105A>G

AA AG GG

LW (㎏) 553.15±8.03 545.36±5.08 530.00±12.01 0.279 23.15±14.45 -7.57±17.67 CW (㎏) 317.89±4.99 313.47±3.16 301.23±7.47 0.181 16.65±8.98 -7.81±10.99 BF (㎝) 0.67±0.047 0.77±0.02 0.70±0.07 0.168 -0.02±0.08 -0.17±0.10 LDA (㎠) 76.65±1.30 77.13±0.82 74.05±1.94 0.349 2.59±2.34 -3.55±2.86

MS (1～9) 3.18±0.27 3.18±0.17 2.52±0.40 0.311 0.65±0.48 -0.66±0.59

LW, live weight; CW, carcass weight; BF, backfat thickness; LDA, longissimus dorsi muscle area; MS, marbling score.

**Effect was significant at p<0.01.

a,bWithin a row, means with different superscript letter differ (p<0.05).

(7)

www.earticle.net

Table 5. Association of haplotypes of GPD1gene with meat yield and quality traits in Hanwoo

Traits Mean±SE of GPD1 haplotypes (n=309)

p-value

CA (263) TG (46)

LW (㎏) 546.87±4.21 530.00±10.42 0.135

CW (㎏) 314.17±2.60^a 302.09±6.44^b 0.021

BF (㎝) 0.75±0.02 0.68±0.06 0.316

LDA (㎠) 76.89±0.70 74.85±1.75 0.294

MS (1～9) 3.18±0.14 2.66±0.36 0.194

LW: live weight, CW: carcass weight, BF: backfat thickness, LDA: Longissimus dorsi muscle area, MS: marbling score.

a,bWithin a row, means with different superscript letter differ (p<0.05).

의 지정은 95% 신뢰범위에서 상한치가 0.98이상이고 하한 치가 0.7 이상일 때 SNP 간에 강한 연관불평형이 되었다.

따라서, 본 연구에서는 SNP pair 간 연관불평형을 나타내 는 SNP 조합에 의한 haplotype을 구성하기 위하여 HaploView V.4.2 program 이용하여 Haplotype block을 구성하였다. 총 2개의 GPD1 SNP 좌위들을 대상으로 연관 불평형 분석을 수행한 결과, r²=0.28로 분석되었으며, 두 개 SNP 조합에 의한 haplotype의 출현빈도는 CA형이 82.5%, TG형이 14.7%, CG형이 2.3% 그리고 TA형이 0.5%로 가장 낮은 출현빈도를 나타냈다. 구성된 총 4종류의 Haplotype 가운데 출현빈도가 5% 이하로 매우 낮은 CG형과 TA형은 연관성 분석에서 제외한 후, GPD1 유전자의 haplotype과 한우 육량 및 육질형질 관련 도체성적 표현형 측정치와의 연관성 분석을 수행하였다. Haplotype이 한우 육량 및 육 질형질에 미치는 효과를 추정한 결과 Table 5에 제시한 바 와 같이 도체중량(CW) 형질과의 유의적 연관성이 입증되 었다(p<0.05). Duncan's multiple range test를 수행하여 haplotype 유형별 유의적 차이를 검정한 결과 haplotype 간의 유의적 차이가 있는 것으로 분석되었다(p<0.05). 즉, CA haplotype을 가진 개체들이 TG haplotype을 가진 개 체들에 비해 도체중량이 약 12.12kg 정도 유의적으로 높게 나타났다.

최근 한우의 육량 및 육질형질 등 경제형질과 연관된 후 보유전자의 SNP 발굴에 대한 연구가 활발히 진행되어지고 있다. Shin과 Chung 등(2007a)은 한우의 carboxypeptidase E(CPE) 유전자의 C445T SNP가 근내지방도 형질과 유의적 으로 연관되어 있음을 보고하였으며, thyroglobulin(TG) 유 전자의 C442T SNP도 한우의 근내지방도 형질과 유의적으 로 연관되어 있음을 보고하였다(Shin and Chung, 2007b).

Lee 등(2013)은 melanocortin-4(MC4R) 유전자의 C1069G

SNP와 한우 도체중량 및 근내지방도와의 연관성을 보고하 였다. 이 밖에도 micro calpain(CAPN1) 유전자의 3′

-UTR 영역 내의 특정 SNP와 근내지방도 형질과의 연관성 (Cheong et al., 2008)이 보고되었으며, stearoyl-CoA desaturase 1(SCD1) 유전자의 특정 SNP와 근내지방도 형 질과의 연관성(Park et al., 2012), 그리고 myogenic differentiation 1(MYOD1) 및 myogenic factor 5(MYF5) 유 전자의 특정 SNP와 도체중량 형질 간의 연관성(Bhuiyan et al., 2009)이 보고되는 등 지방축적 및 지방대사의 기능 성을 가진 후보유전자들의 특정 SNP와 한우 경제형질 간 의 연관성 분석에 관한 연구가 활발히 진행되어져 왔다.

최근 Stephen 등(1984)의 보고에 의하면 본 연구에서 활 용한 GPD1 유전자는 소의 근내 지방축적을 평가 및 예측 하는 데 잠재적 능력을 가진 유용한 후보유전자로 알려져 있다. 그러나, 현재까지 GPD1 유전자의 SNP와 한우를 포 함한 기타 육우품종의 경제형질 간의 연관성 분석에 대한 연구는 전무한 실정이며, 주로 인간의 비만과 관련된 질환 들의 유전적 분석 연구에 많이 이용되어져 왔다 (Pihlajamki et al., 2001). GPD1 유전자로부터 생성되는 산 물들은 지방조직 지질분해 효소의 일종으로 지방조직 내 에 존재하며, 부신수질호르몬과 갑상선 자극호르몬의 활성 에 관여하며, 인슐린을 억제하고, 생장호르몬의 분비에 관 여하는 것으로 알려져 있다(Plee-Gautier et al., 1996;

Donsmark et al., 2003). 또한 지방조직에서 중성지방을 지 방산으로 분해하여 혈액 내로 방출하므로 지방의 축적이 일 어나게 되며, subcutaneous 지방조직보다는 intramuscle 지 방조직 발달에 연관이 있는 것으로 보고되어 있다(R. L.

Hood et al., 1978). 따라서, GPD1 유전자는 새로운 한우의 육량 및 육질관련 후보유전자로 활용하기에 매우 적합한 유 전자이다.

(8)

www.earticle.net

본 연구에서는 GPD1 유전자의 exon 5번 영역 내 존재 하는 g.2766C>T SNP와 한우 도체중량 및 근내지방도와의 유의적 연관성이 입증되었다. 특히 도체중량 형질과는 고 도의 유의적 연관성(p<0.01)을 지닌 것으로 나타났으며, CC 유전자형을 가진 개체들이 TT 유전자형을 가진 개체 들에 비해 도체중량에 대한 통계학적 평균 중량 약 23.967kg 정도 상대적으로 매우 높게 나타난 것으로 분석 되었으며, 근내지방도에서도 CC 유전자형을 가진 개체들 이 TT 유전자형을 가진 개체들에 비해 비교적 높은 값을 나타내는 것으로 분석되어 향후 한우의 육량 및 육질형질 관련 분자표지로서의 활용 가치가 매우 높을 것으로 사료 된다. 뿐 만 아니라 본 연구에서 발굴된 2개의 SNP들을 조 합하여 구성한 haplotype과 도체중량과의 유의적 연관성 이 입증되어 도체중량 형질 예측과 관련된 본 유전자의 활 용 가치는 더욱 더 높을 것으로 사료된다.

따라서, 본 연구를 통해 발굴된 GPD1 유전자의 g.2766C>T SNP는 한우의 육량 및 육질형질이 우수한 한 우 개체 조기 선발을 위한 새로운 DNA marker로 활용될 가능성이 있음을 확인하였다.

Ⅳ. 요약

본 연구는 한우 GPD1 유전자의 exon 영역 내 존재하는 SNP를 발굴하여 육량 및 육질형질과의 연관성을 분석하고 자 수행하였다. g.2766C>T 와 g.5105A>G 등 각각 exon 5 번 및 8번 영역에 존재하는 두 개의 SNP marker를 발굴하 였다. PCR-RFLP 분석을 통해 두 개 SNP에 대한 genotyping을 수행하고, SNP marker와 한우 육량 및 육질 형질과의 연관성을 분석하였다. 그 결과, exon 5 영역 내에 존재하는 g.2766C>T SNP가 도체중량 및 근내지방도 형질 과 유의적인 연관성이 있는 것으로 분석되었으며, 상가적 효과가 입증되었다. 즉, CC 유전자형을 가진 개체들은 CA 및 AA 유전자형을 가진 개체들에 비해 유의적으로 더욱 무거운 도체중량을 갖는 것으로 분석되었으며, 또한 유의 적으로 더 높은 근내지방도를 갖는 것으로 분석되었다. 이 들 SNP에 대한 연관불평형분석을 통해 haplotype을 구성 하고, haplotype과 한우 육량 및 육질형질과의 연관성을 분석한 결과 도체중량과의 유의적 연관성이 입증되었다. 즉, CA haplotype을 가진 개체들이 TG haplotype을 갖는 개체들에 비해 유의적으로 더 무거운 도체중량을 갖는 것 을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 발굴된 GPD1 유전자

의 SNP는 육량과 육질형질이 우수한 한우를 선발하기 위 한 분자 마커로 활용 가능할 것으로 사료된다.

사사

본 논문은 농촌진흥청 차세대 바이오그린21사업(세부과 제번호:PJ01103201)의 지원에 의해 이루어진 것임.

Ⅴ. REFERENCES

1. Bhuiyan, M. S. A., Kim, N. K., Cho, Y. M., Yoon, D., Kim, K. S., Jeon, J. T. and Lee, J. H. 2009.

Identification of SNPs in MYOD gene family and their associations with carcass traits in cattle. Livest. Sci.

126:292-297.

2. Cheong, I. C., Hyun, S. C., Yoon, D. H., Park., B. L., Kim, L. H., Bae, J. S., Namgoong, S., Lee, H. W., Han, C. S., Kim, J. O. and Shin, H. D. 2008. A single nucleotide polymorphism in CAPNI associated with marbilng score in Korean cattle. BMC Genet. 9:33.

3. Chung, E. R., Shin, S. C. and Heo, J. P. 2011a.

Association analysis between SNP marker in Neuropeptide Y (NPY) gene and carcass and meat quality traits in Korean cattle. Korean J. Food Sci. Ani.

Resour. 31:537-542.

4. Chung, E. R., Shin, S. C. and Heo, J. P. 2011b.

Association between SNP marker of Uncoupling Protein 3 gene and meat yield and marbling score traits in Korean cattle. Korean J. Food Sci. Ani.

Resour. 31:530-536.

5. Donsmark, M., Langfort, J., Holm, C., Thorkil, P. and Henrik, G. 2003. Contractions activate hormone- sensitive lipase in rat muscle by protein kinase C and mitogen-activated protein kinase. J. Physiol.

550:845-854.

6. Gabriel, S. B., Schaffner, S. F., Nguyem, H., Moore, J.

M., Roy, J., Blumenstiel, B., Higgins, J., DeFelice, M., Lochner, A., Faggart, M., Liu-Cordero, S. N., Rotimi, C., Adeyemo, A., Cooper, R., Ward, R., Lander, E. S., Daly, M. J. and Altshuler, D. 2002. The structure of

(9)

www.earticle.net

haplotype blocks in human genome. Science. 296:2225- 2229.

7. Hedrick, P. W. 1987. Gametic disequilibrium measures:

proceed with caution. Genetics. 117:331-341.

8. Kim, S. W., Lee, J. H., Kim, J. H., Won, Y. S., Kim, N.

S. and Kim, K. S. 2010. Effect of the fatty acid synthase gene for beef quantity traits in Hanwoo breeding stock. J. Anim Sci. Technol. 52:9-16.

9. Kong, H. S., Oh, J. D., Lee, J. H., Yoon, D. H., Choi, Y, H., Cho, B. W., Lee, H. K. and Jeon, G. J. 2007.

Assocaition of sequence variations in DGAT 1 gene with economic traits in Hanwoo (Koran cattle). Asian Austral. J. Anim. Sci. 20:817-820.

10. Lee, H. J., Lee, S. H., Cho, Y. M. and Yoon, D. H.

2004. Association between the polymorphism on intron 5 of the lipoprotien lipase gene and carcass traits in Hanwoo (Korean cattle). Kor. J. Anim. Sci.

Technol. 46:947-956.

11. Lee, S. H., Cho, Y. M. and Yoon, D. H. 2014.

Validation of DNA markers for carcass traits with commercial Hanwoo population. J. Agri. Life Sci.

48:133-141.

12. Lee, Y. S., Park, S. R., Lee, S. K., Kim, J. W., Lee, H.

K., Jeong, D. K. and Lee, S. J. 2013. A C1069G SNP of the MC4R gene and its association with economic traits in Korean native cattle (brown, brindle, and black). Electron. J. Biotechn. 16(5). Doi: 10.2225/vol16 -issue5-fulltext-5.

13. Miller, S. A., Dykes, D. D. and Polesky, H. F. 1998.

A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl. Acids Res.

16:1215.

14. Hood, R. L. and Allen, C. E. 1978. Lipogenesis in isolated intramuscular adipose tissue from four bovine muscles, J. Anim. Sci. 46:1626-1633.

15. Park, J. J., Berggren, J. R., Hulver, M. W., Houmard, J. A. and Hoffman, E. P. 2006. GRB14, GPD1, and GDF8 as potential network collaborators in weight loss-induced improvements in insulin action in human skeletal muscle. Physiol. Genomics. 27:114 -121.

16. Park, S. R., Homg, M. W., Kim, H., Lee, S. K., Lee,

Y. S., Kim, J. W., Song, Y. H., Kim, K. B., Oh, J. D., Lee, H. K., Choi, J. W. and Lee, S. J. 2012.

Association between a SNP of stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD1) gene and economic traits using PCR-RFLP in Hanwoo. Ann. Anim. Resour. Sci.

23:1-7.

17. Pihlajamaki, J., Valve, R., Karjalainen, L., Karhapaa, P., Vauhkonen, I. and Laakso, M. 2001. The hormone sensitive lipase gene in familial combined hyperlipidemia and insulin resistance. Eur. J. Clin.

Invest. 31:302-308.

18. Plee-Gautier, E., Grober, J., Duplus, E., Langin, D.

and Forest, C. 1996. Inhibition of hormone-sensitive lipase gene expression by cAMP and phorbol esters in 3T3-F442A and BFC-1 adipocytes. Biochem. J.

318:1057-1063.

19. Serão, N. V., González-Peña, D., Beever, J. E., Faulkner, D. B., Southey, B. R. and Rodriguez- ZasEmail, S. R. 2013. Single nucleotide polymorphisms and haplotypes associated with feed efficiency in beef cattle. BMC Genet. 14:94.

20. Shin, S. C. and Chung, E. R. 2007a. SNP detection of carboxypeptidase E gene and its association with meat quality and carcass traits in Korean Cattle.

Asian Austral. J. Anim. Sci. 20:328-333.

21. Shin, S. C. and Chung, E. R. 2007b. Association of SNP marker in the thyroglobulin gene with carcass and meat quality traits in Korean cattle. Asian Austral. J. Anim. Sci. 20:172-177.

22. Shin, S. C., Heo, J. P. and Chung, E. R. 2011a.

Genetic variants of the FABP4 gene are associated with marbling scores and meat quality grades in Hanwoo (Korean cattle). Mol. Bio1. Rep. 39:5323- 5330.

23. Shin, S. C., Heo, J. P., Yeo, J. S., Lee, C. Y. and Chung, E. R. 2011b. Genetic association of phosphodiesterase 1B (PDE1B) with carcass traits in Korean cattle. Mol. Bio1. Rep. 39:4869-4874.

24. Smith, S. B. and Grouse, A. D. 1984. Relative contributions of acetate, lactate and glucose to ipogenesis in bovine intramuscular and subcutaneous adipose tissue. J. Nutr. 114:792-800.

(10)

www.earticle.net

25. Swierczynski, J., Zabrocka, L., Goyke, E., Raczynska, S., Adamonis, W. and Sledzinski, Z. 2003. Enhanced glycerol 3-phosphate dehydrogenase activity in adipose tissue of obese humans. Mol. Cell Biochem.

254:55-9.

(Received 26 May 2016, Revised 18 November 2016, Accepted 22 November 2016)