Anti-platelet Aggregation Effect of Ginkgolide B and Ginkgoflavonoids, Extracted from Ginkgo biloba, in Vitro, ex Vivo and in Clinic.

(1)

Ginkgolide B 및 ginkgoflavonoids 의

in vitro

외 ■

ex vivo

및 엄상에서의 항혈전 작용

권광일* • 이영신

층남대학교 약학대학 (Received M ay 3, 1995)

A n ti- p la te le t A g g r e g a tio n E f f e c t o f G in k g o lid e B a n d G in k g o f la v o n o id s , E x tr a c te d f r o m Ginkgo biloba, in Vitro,

ex Vivo a n d i n C lin ic .

K w an g- il K w on* a n d Y o u n g - s in Lee

C o lle g e o f P h a r m a c y , C h u n g n a m N a tio n a l U n iv ersity , T a e je o n 3 0 5 -7 6 5 , K o r ea

Abstract The effects of g in kg olides(natural m ixtu re o f ginkgolides. ginkgolide B. ginkgolide C) a n d flavonoids(quercetin. kaempferol. m yricetin). extracted from G inkg o biloba, o n A DP a n d PAF~induced platelet aggregation in vitro a n d ex vivo were investigated. In these experim ents, b o th of ginkgolides a n d ginkgoflavonoids d id n o t affect the ADP(5 M-M) in d u c e d platelet aggregation in vitro. The IC™ v a lu e o n PAF (0.3 liM ) in d u c e d platelet aggregation were 2.52 띠VI (ginkgolide B) a n d 6.35 u M (n a tu ra l m ix tu re o f ginkgolides) a n d 2.80 |iM (m ixture o f ginkgolide B a n d q u e rc e tin ),

O ral ad m in istratio n o f ginkgolide B(1 a n d 3 m g/kg) a n d quercetin(3 a n d 9 m g /k g ) to rabb its in h ib ite d ex vivo PAF in d u c e d platelet aggregation in a dose-dependent m a n n e r. G in k o m in - F tablets a d m in i

stered to the diabetic patients showed inhib ito ry activities o n the A DP a n d PAF in d u c e d platelet aggregation in a dose a n d tim e depe nd e nt m an n e r.

Keywords□ G inkgolide B. Ginkgoflavonoids. Anti-platelet Aggregation, PAF.

혈견증은 혈관내에 혈소관( p l a t e l e t )이나 W B C ,

R B C , 지방질 흑은 평활근 세포 동이 혈전을 형성. 혈관

내벽에 침착되고 그 앞 ■ 뒤로 혈액이 정체되면서 섬유 소가 형성되는 일련의 반응이 주위 혈관에 까지 파급되 는 것 * 으 로 혈전외 직접적인 원인인 혈소판 응집을 유 발하는 주요 물질로는 혈소판에서 유리되는 A D P ( a d e n o s i n e d i p h o s p h a t e )와 e p i n e p h r i n e . 손상된 조직에서 유리되는 c o l l a g e n . 아스피린에 의해 생성이 억제되는 a r a c h i d o n i c a c i d가 있으며 이 외에도 t h - r o m b i n . P A F ( p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r ) ^{등이 있다세.}

P A F는 1 9 7 0년 I g - E 로 감작시킨 토끼의 b a s o p h i l s

에서 발견된 l - 0 - a l k y l - 2 - ( R ) - a c e t y l g l y c e r o - 3 - p h o - s p h o r y l c h o l i n e ( a l k y l - a c e t y l - G P C )외 구조률 갖는

^본 논문에 관한 문외는 이 저자에게로

용해성외 액상의 매개체로 [■ to P A F^{를 사 용 한}r a d i o l i g a n d b i n d i n g s t u d y . P A F a n a l o g를 이용한 길항 제둘에 대한 연구 등을 통해 이 물질의 e t h e r p h o s

p h o l i p i d 기가 혈소관 응집 . 염증. 급성 알러지 , 기관지

수측 . 혈압감소. 국소번혈 등에 중요한 작용을 하는 것 으로 밝혀졌다®

Ginkgo 에서 분리된 g i n k g o f l a v o n o i d s ( p r o - a n t h o c y a n i d i n s , k a e m p f e r o l . q u e r c e t i n . i s o r h a m - m e t i n e g l y c o s i d e s e t c

.)와

n o n - f l a v o n o i d ^분획인 g i n k g o t e r p e n e s ( g i n k g o l i d e A ( B N 5 2 0 2 0 ) . B ( B N 5 2 0 2 1 ) . C ( B N 5 2 0 2 2 ) . J ( B N 5 2 0 2 4 ) )^{이 혈소판 응집}

억제효과를 보이는데 이 중 g i n k g o l i d e s . ^특히 g i n k g o l i d e B ^는P A F r e c e p t o r에 높은 친화력으로 결 합하면서 l y s o - P A F^의 r e a c y l a t i o n , p h o s p h a t i d i c

a c i d 합성 및 P A F에 의해 유발되는 C a " "외 세포내 유

337

(2)

입을 억제해 강한 혈소관응집 억제효과를 나타낸다

®'"'^®.

본 실험에서는

p y r i d a z i n o n e

구조를 갖고 강심작용

.

혈소판 웅집 억제작용

.

말초혈관 확장 등의 약리작용을 나타내는 새로운

c y c l i c A M P - p h o s p h o d i e s t e r a s e i n h i b i t o r

인

K R 3 0 2 8 9

를

p o s i t i v e c o n t r o l

로 하여

G ;'-

nkgo biloba

추출물인

g i n k g o l i d e s ( g i n k g o l i d e s

의

n a t u r a l m i x t u r e

및

g i n k g o l i d e B , g i n k g o l i d e C

)와

g i n k g o f l a v o n o l s ( k a e m p f e r o l . m y r i c e t i n . q u e r c e t i n )

및

g i n k g o l i d e C

의

- O H g r o u p

을

a c e t y l a t i o n

시킨

유도체인

C N U 2

이외 혈소판 응집에 대한 억제작용을

측정 하였고

. g i n k g o l i d e B

와

f l a v o n o l s

외 흔합물의 혈 소판 응집 억제효과를 측정해 두 약물의 상승효과의 여 부를

in vitro

및

e x w 'p o

에서 관찰하였다

.

또한 은행엎 엑스제제 중의 하나인 징코민-정을 토끼와 혈액 순 환 부전 중상과 망막장애 중상을 보이는 당뇨 환자에 게 일정기

？！•

투약하면서 혈액을 취해 이 제제의 혈소판 웅 집 억제효과릅 측정하였다

.

이러한 일련외 혈액응집 실

험에 있어 응집 유도제로

A D P

와

P A F

를 사용하였다

.

실험방법

실험 재료 및 동 물 -G i n k g o l i d e s

의

n a t u r a l m i x t u r e , g i n k g o l i d e B , g i n k g o l i d e

(그 는 층남대학교 약학 대학 유기화학 실험실에서 추출한 것을

. K R - 3 0 2 8 9

는 한국화학연구소 유기화학 연구실에서 합성한 것을 사 용하였으며

의

- 0 H g r o u p

을

a c e t y l

a t i o n

시킨 물질인

C N U 2 0 1

은 층남대학교 약학대학

유기함성 실험실에서 합성한 것을 사용하였고

3

종의

f l a v o n o l s ( q u e r c e t i n , m y r i c e t i n a n d k a e m p f e r o l )

과

징코민

_ p «

정은 동방제약에서 제공받았다〶 혈소관 응집

유도제로 쓰인

A D P

와

P A F

는

s i g m a ■ c h e m i c a l C o .

L t d

.에서 구입하였다

.

수컷토끼는 삼육 실험동물 농장에서 구입해 층남대 학교 약학대학 실험동물실에서 고형사료(퓨리나 코리 아)와 식수를 제한없이 공급하면서 사육하면서

,

약

2 ~ 3

주 정도외 순화기간을 거쳐 체중이

2 . 5 ~ 3 . 0 k g

정도 가 되었을때 실험에 사용하였다

.

실험동물실의 조건은

온도

2 2 ± 2 " C ,

습도

5 5 ~ 6 0

%를 유시하도록 하였으며

조명시간은

1 2

시간 단위로 조절하였다

.

In vitro Aggregometry -

실험 약

¹

주일 전부터 약물

( P D E

억제제

, C a " '

길항제

) , c a f f e i n e

함유 기호식품 및 마놀을 함유한 옴식을 피하도록 한 건강한 지원자의

상박 정맥으로부터

5 0 ~ 6 ( H i

/외 혈액을 취해 실험하였 다

.

실험 당일 아첨을 먹지 않은 상태에서 혈액을 취해

일회용 시험관에 혈액과

3 .8 ^% s o d i u m c i t r a t e

를

9

：

1

의 비율로 넣고 약하게 아래위로 혼들어서 응고를 방

지한 후 이를 원심분리

( 1 6 0 g . 1 0

분)하여 상등액으로부

터

P R P ( p l a t e l e t r i c h p l a s m a ) #

얻고 잔액을 다시 원심분리

( 2 0 0 0 g , 1 0

분)하여

P P P ( p l a t e l e t p o o r p l a

s m a )

를 얻었다

.

P R P

는 채취 즉시 시험관에 넣고 실험 기간 동안 마개

를 하고 얼음용기중에 방처하여 공기 노출 및 실험 중 온도상승에 의한 번화롤 최소화하였다

. P R P

내의 혈소 판 농도를 일정하게 유지하기 위하여 광학적 밀도를 측

정

, P P P

로

P R P

의 농도를 보정하여

P R P

외 광학적 밀

도를 약

0 . 5 ~ 0 . 6

으로 일정하게 유지시켰다

.

약물의 혈소판 응집 억 제효과는 혈소관응집분석기를

사용하여

B o r n

에 의 한 탁도측정으로 측정하였다

. 2

차

증류수를 사용하여 분석기의 광학적 표준수위를

1 .0 0 0

± 2 5 0

으로 맞추고

P R P

의 광학적 밀도를 보정한 후

,

P R P 2 0 0

률

7 . 2 5 X 5 0 m m

실리콘 처리된 시험관에

취해 소형교반기틀 넣고

1 ~ 2

분간 방치한 후 각

c h a n -

n e l

에 시험약물이나 식염수

( c o n t r o l

용

) 2 5

를 가하고

다시

3 ~ 5

분간 방치 시 킨 다움

P A F

나

A D P

를

2 5 [il

가

하여 혈소판 응집을 유발시켰다

.

실험조작 동안 온도는

3 7 ° C

로

,

교반속도는

5 0 0 ~ 1 5 0 0 r p m

으로 조절하였으

며

5 2 8 n m

에서 응집도를 측정하였다

.

약물에 외해 웅짐이 억제되는 정도를 다옴 식에 의거 하여 광학적투과도의 감소율

( % )

틀 산출하였고

,

농도

-반응 곡선을 이용하여

I C s o

값을 삼출하였다

.

inhibition % A-B

1 0 0

A = c o n t r o l ( v e h i c l e )

외 최고 혈소관응집율

^%

B =

약물 처리시의 최고 혈소관응집율

^%

Ex vivo aggregometry I - ^설

험

2

일전부터 절식시키

고

1 0 % d e x t r o s e

용액을 공급한 체중

2 . 5 - - 3 k g

외 건

강한 토끼롤 대상으로 하였다

.

고정대에 토끼를 넣고

l e v i n t u b e ( 1 8

호

)

를 사용하여 약물(현탁액

. 5 | i

/)을

경구투여하였다

.

각 군외 각각에

g i n k g o l i d e B ( 1 o r 3 m g / k g ) . q u e r c e t i n ( 3 o r 9 m g / k g ) . g i n k g o l i d e B 1 m g / k g q u e r c e t i n 3 m g / k g . g i n k g o l i d e B 1 m g / k g + q u e r c e t i n 9 m g / k g , g i n k g o l i d e B 3 m g / k g + q u e r c e t i n 3 m g / k g

를 투여한 후

0 . 2 5 , 0 .5 . 1 .0 . 1 . 5 ,

Pharm. Soc. Korea

(3)

Q-C Q>Mixtur« Q-B KR 30289 I , ] 0.3uM E 3 luM 행 3uM I I lOuM Fig. 2 Inhibitory effect of natural mixture of

ginkgolides COmixture). ginkgolide B(G^B).

ginkgolide C(G-C) and KR 30289 on human platelet aggregation indued by ADP(0,3 |iM).

Each bar shows the mean ± S. R. M.(n = 5).

설험한 결과를 Fig. 1, 2에 나타내었다. 세 약물 모두 A D P 에 의해 유도된 혈소판 응집에 대해서는 억제효과 를 보이지 않았으나 P A F 에 외한 혈소관 응집에 대해서 는 ginkgolide B, natural mixture, (그의 순으로 억제 효과를 나타내었다. Ginkgolide B 는 P A F 에 의해 유 도된 혈소관 응집에 대해 lO ^M 의 농도에서부터 효과 를 나타내어 3X [에서 68.47 ± 3.54%. ICTiV[에서 91.74± 0.73% 의 강한 억제효과를 나타내어 IC,5o value가 2.52 x 1 0 " ^ 로 나타났다. Ginkgolides외 혼 합물도 P A F 에 의한 혈소판 웅집에 대해 KT^M의 농도 에서 66.40 ± 3.45% 의 억제효과를 보여 IC jo v a lu e 가 6,35 X lO^M 로 나타난 반면 . ginkgolide C 는 10~iVI 의 높은 농도에서 18.49±0.73%의 미약한 억제효과를 실험 약 1주일 전부터 투약기간 동안 약물(PDE 억 제

제, P차단제 및 Ca"" 길항제). caffeine 함유 기호식품 및 마놀을 함유한 움식을 피 하도록 한 망막장에 증상이 있는 당뇨 환자를 대상으로 하여 1주일동안 징코민- 정 (ginkgoflavonglycoside 40 mg 함유) 을 투여 하 면서 약물외 혈소관 응집 억제효과와 혈소관 수 , GOT.

GPT 등외 혈액 화학적 수치 번화를 측정하였다. 실험 은 첫째날 아침을 먹지 않은 상태에서 상박정맥으로부 터 10 m /외 혈액을 채혈한 후 징코민- 2 정을 투약하 고 30분 , 1시간, 2시간 후에 각각 10 m /씩 채혈한 후 저 녁에 다시 1정을 복용시켰다. 이로부터 일수일 동안 계 속 약제를 동일한 방법으로 투약한 후 8일째 되는 날 아 침에 역시 공복시에 약제 2정을 투약하:11 30분 및 1시 간후에 10 m /썩 채혈하였다.

P R P 450 를 7.25 x 50 m m 실리콘 시험관에 취해 교반기를 넣고 1~2분간 방치 후 각 channel 에 PAF 또는 A D P 를 50 가하여 혈소판 응집을 유발시켰다.

이때 약물에 외해 웅집이 억제되는 정도는 in wiro 실험 에서와 같은 방법으로 계산하였다.

결 과

In vitro Aggregometry - 인체혈액을 이용한 혈소판 응집 실험에서 ginkgolides의 natural mixture, gin

kgolide B 와 ginkgolide C 의 혈소판 응집 억 제작용를 Vol. 38, No. 3, 3995.

62 retinopathy G II

48 retinopathy G II. ^

cellulitis c

46 retinopathy G II, I

neuropathy 3

2.0. 3.0 시간에 귀정맥으로부터 4.5^l/씩 채혈하였다.

Exvivo aggregometry II- 체중 3.0 kg의 토꺼에 징 코민-F R (현탁액, 5 ^/)을 1일 2회씩 10일간 경구투여 하였다. 각 군의 예수를 5마리로 하여 saline(대조군), 징코민-F 5 mg 및 20 m g (유효성분으로써) 을 투여하 였다. 약물 투약 전과 투약 1, 2, 3, 5. 7, 10 일 후에 귀 정맥으로부터 각각 4.5 H/씩 혈액을 취해 혈소판 응집 억제효과를 측정하였다.

Fig. 1

Q-Mixture C I i 0.3uM

KR 30280

CT-. I lo u M

Inhibitory effect of natural mixture of gink

golides (G-mixture) . ginkgolide B(G -B ), ginkgolide C(G-C) and KR 30289 on human platelet aggregation indued by ADP(5 liM).

Each bar shows the mean ± S. E. M.(n=5).

임상 실험 Table I ~ Patients profile

subject sex age weight remarks

0 0 06 4 2

%uojslMul F

F

A B C

ill

월

^ 벨 포

*

(4)

Fig. 4 —

보였다

.

그러나

. C N U 2

이의 경우 원 물질인

g i n k -

g o l i d e C

에 비해 혈소관 응집 억제효과가 오히려 감소

한 것으로 나타났다

. P o s i t i v e c o n t r

이로 사용한

K R

3 0 2 8 9

는

A D P

및

P A F

에 외한 응집에 대해

3 x lO '^ M

의 농도에서 각각

3 8 .2 8 ± 1 2 . 0 9 %

및

2 0 . 1 2 ± 7 . 8 2 %

의 억제효과를 보이고

1(T ® M

이상의 농도에서는

6 0 %

이상외 강한 억 제효과를 보여

1 C *

값이 각각

4 ,3 5 X

M . 5 . 4 4 X k T m

로 나타났다

.

3

종외

f l a v o n o l s ( k a e m p f e r o l , q u e r c e t i n a n d m y

r i c e t i n

)외 혈소관 응집 억제효과를 측정한 결과

m y r i c e t i n

이

1 ( T " M

의 농도에서

P A F

에 의한 응집을

2 6 . 3 6 ± 2 . 4 2 %

억제하는 것을 제외하고는 모두 유의성

있는 결과를 나타내지 않았다

( F i g . 3 , 4 ) .

위외

3

중외

f l a v o n o l s

와

g i n k g o l i d e B

의 흔합물의

Kaetnp+Q-B Myrl^Q-B Quer^Q-B Q~6 L J 0.3uM I id luM 3uM I I lOiM Fig. 6 Inhibitory effect of mixture of ginkgolide B and

flavonoids on human platelet aggregation induced by FAF'{0,3 uM). Each bar shows the mean ± S. K. M.(n=5).

[Kaemp+ O B ： Kaempferol + Ginkgolide B.

Myri+ GrB- Myricetin + Ginkgolide B, Quer+

GrB- Quercetin + Ginkgolide B]

혈소관 응집 억제능을 측정한 실험에서

와

q u e r c e t i n

의 혼합물이

1 ( T " M

에서

A D M ]

의한 웅

집에 대해 약한 억제효과

( 2 3 . 5 4 ± 1 . 1 2

%)를 보였고

,

P A F

에 외한 응집에 대해서는 모든 혼합물에서

3 X 1 0 ^

- l O ' ^ M

에서

단득투여시보다 높은 억

제효과를 보였다

( F i g . 5 . 6 ) .

Ex vivo aggregometry I -

토꺼에

g i n k g o l i g e B

및

q u e r c e t i n

을

1

회 경구투여한 후 경시적으로 혈액을 취

헤 약물의 혈소판 응집 억제효과를 측정한 결과를

F i g .

7 , 8

에 나타내었다

. G i n k g o l i d e B

투여군외 경우

1

m g / k g

를 투여했을 때는

P A F

에 의해 유도된 혈소판

응집에 대해 억제효과를 나타내지 않았으나

3 m g / k g

Fig. 3

i-B Q-B C~j lOuM Ka«mp 수 Q*-B Myri*0-B (

luM 3uM

Fig. 5 —— Inhibitory effect of mixture of ginkgolide B and flavonoids on human platelet aggregation induced by ADP(5 |iM). Each bar shows the mean ± S. E. M.(n=5).

KaempUrol Myrio^tin Ou«ro««in Qinkoolide B b해 luM 3uM I I lOuM

Inhibitory effect of three mixture of ginkgolides (Omixture). ginkgolide B(G-B), ginkgolide C (G-C) and KR 30289 on human platelet aggregation indued by ADP(0.3 나M). Each bar shows the mean ± S. E. M.(n=5).

Myricetin QinKgolide Kaempfttrol

luM 3uM I I 1 0uM Inhibitory effect of three flavonoids (kaempferol.

myricetin and quercetin) on human platelet aggregation induced by PAF(0,3 ^M). Each bar shows the mean ± S. E. M.(n=5).

I Pharm. Soc. Korea

o o o o

8

s

4

2

%uo}2jqul

o o o o

8

6

4

2

^

uomqiqcl %uo}l}q!qul

%uoulqll

(5)

( I 0 .6 hr E S 1.0 hr 2 .0 hr Fig. 10 Inhibitory effect of Ginkomin-FR tablet on

human platelet aggregation induced by ADP(5

|iM). Each bar shows the mean ： 3).

k g + q u e r c e t i n 3 m g / k g

투여 군외 경 우 단득실험 시

와 유사한 곡선양상을 보였고 두 경우 모두 투약

1 . 5

시

간 경과후에 가장 높은 억제효과

( 6 2 . 3 6 ± 0 . 9 7 % , 9 2 .

8 3 ± 0 . 7 6 % )

를 보였다

.

Ex-vivo a g g r e g o m e t r y I I -

징 코민

- F R

정 제률 토끼

에

1 0

일 동안 반복투여 하면서 얻은 항혈소판 응집효

과틀

F i g . 9

에 나타내었다

, A D P

에 외한

'

응집에 대해

징 코민-정 제 투여 약

3

일째부터

5 m g

투여 군과

2 0

m g

투여군에서 각각

9 . 2 2 + 0 . 6 6 % , 3 5 . 2 2 ± 4 . 0 6 %

의 억제효과를 보였고

7

일째에는

2 5 . 5 1 ± 2 . 8 8 % , 7 2 . 3 0

± 5 . 2 3 %

의 효과를 보였으며 투여

1 0

일째에는

3 9 . 2 ±

2 , 0 6 %

및

8 8 .5 2 ± 1 0 . 2 9 %

의 강한 억제효과를 나타냈

다

. P A F

에 의한 응집에 대해서도 유사한 경향의 억제

효과를 나타내

5 m g

투여군에서

3

일째에

2 2 . 4 4 ±

Time (hr)

Fig. 8 Inhibitory effect of mixture of ginkgolide B and quercetin on ex-vivo 0.3 (xM of PAF induced platelet aggregation in rabbits. Each point shows the mean ± S. E. M.(n = 3-4).

[#, ginkgolide B 1 mg/kg + quercetin 3 mg/kg：

O. ginkgolide B 1 mg/kg + quercetin 9 mg/kg：

▲. ginkgolide B 3 mg/kg + quercetin 3 mg/kg].

의 용량을 투여한 경우

0 . 5

시간 경파 후부터 응집 억제

효과를 나타내어

1 . 5

시간 후에

8 8 .9 6 ± 2 . 3 4 %

의 강한

억제효과를 보였고 이러한 효과는 그 후 점차 감소하여

3 .0

시간 후에는

1 3 . 2 9 ± 0 . 4 3 %

외 억제효과를 나타내

었다

. Q u e r c e t i n

의 경우에도

1 . 5 ^ 2 . 0

시간 경과 후에

3 3 . 0 4 ± 3 . 2 9 % ( 3 m g / k g

투여군

) 4 9 .8 7 ± 4 . 0 6 % ( 9

m g / k g

투여군)의 억제효과틀 나타내었다

. G i n k g o

l i d e B 1 m g / k g

과

q u e r c e t i n 3 m g / k g

을 병 용투여 한 실험에서는 투약

2

시간 경과 후에

4 2 .8 6 ± 1 . 5 6 %

외 억 제효과를 나타내었고 이러한 효과는 투약

3

시간 경과후 에도 계속 지속되었다

. G i n k g o l i d e B 1 m g / k g + q u e r c e t i n 9 m g / k g

투여 군과

g i n k g o l i d e B 3 m g /

Vol 38. No.

^3,

1995.

Time fl>r)

Fig. 7 — Inhibitory effect of ginkgolide B(#, 1 mg/kg ： O, 3 mg/kg) and quercetin(A, 3 mg/kg： A, 9mg/

kg) on ex-vivo 0.3 |iM of PAF induced platelet aggregation in rabbits. Each point shows the mean ± S. E. M.(n = 3-4).

Day*

Fig. 9 — Inhibitoiy effect of Ginkomin-FR tablet '( • , 5

mg：O . 20 mg) on rabbit platelet aggregation

induced by PAF(dot plot. 0.3 띠VI) or ADPCsolid plot, 5 |iM). Each point shows the mean ± S. E.

M.(n = 5).

/ . X 그 ^

I ^

o o

o 0

8

6

4

2

%uo!2!mci 0 0

80 60 40 20

(6)

first day «ighth day 1 I 0 .6 hr tZZZ3 1.0 hr IgMWH 2.0 hr Fig. 11 Inhibitory effect of Ginkomin-FR tablet on hu

man platelet aggregation induced by PAF (0.3 M-M). Each bar shows the mean ± S. E. M.

(n=3).

7 . 1 5 % , 7

일째에는

5 2 .2 2 ± 6 . 2 3 % , 1 0

일째에

5 5 . 5 8 ±

1 2 . 2 9

%의 억제효과를 나타내었고

2 0 m g

투여군에서

는

3

일째에

4 2 . 2 2 ± 1 . 1 1 % , 7

일째에

8 8 , 2 6 ± 8 . 1 3 %

및

1 0

일째에

9 5 . 2 5 ± 1 0 .8 0

%외 강한 억제효과를 나타

내었다

.

임상실험

3

명의 당뇨 환자를 대상으로 하여 실험한 징코민

-

F «

정제의 혈소판 응집에 대한 효과를

F i g . 1 0 , 1 1

에 나

타내었다

.

대상환자 모두 첫번째 투약 '후에는

A D P

와

P A F

에 외해 유도된 혈소판 응집에 대한 저해효과가 보

이지 않았으나 일주일간 징코민

- F **

정제를 계속 투약한

후

8

일째 채혈하여 측성한 결과 대상환자 모두에게서 유의성 있는 혈소관 옹집 저해효과가 나타났다

. 8

일째 측정결과를 보면

A D P

에 의 한 응집에 대해서 투약

1

시

간 후

2 9 . 8 2 ± 6 . 5 5

%외 억제효과를 보였고

, P A F

에 의

해 유도된 응집에 대해서는 투약

3 0

분 후에 평균

3 4 7 ~

3 . 4

%의 혈소판 응집 저해효과를 보였으며

, 1

시간 후에

는

6 7 , 1 ~ 3 . 5

%외 유의성 있는 항혈소관 응집작용을 나

타내었다

.

고 찰

G i n k g o l i d e s

는

P A F

길항제로

P A F

가 수용체에 결

합하는 것을 억제할 뿐만 아니라

l y s o - P A F

의

r e a c y -

l a t i o n , p h o s p h a t i d i c a c i d

합성 및

P A F

에 의 헤 유발

되는

C a

^엑 세포내 유입 등을 억제한다

. In vitro

항혈

전 실험 결과

가

K T M

의 높은 농도에서

A D P

에 의한 혈소관 응집에 대해

1 2 . 3 5 ± 0 . 9 2

%의 억

제효과를 보인 것을 제외하고는

g i n k g o l i d e s

혼합물

, g i n k g o l i d e C

및

C N U 2 0 1

모두

A D P

에 의한 응집에

는 영향을 미처지 않는 것으로 나타난 반면

, P A F

에 의

한 혈소판 응집에 대해서는 모두 억제효과를 나타냈다

.

이둘 약물 중

의 효과가 가장 높아

I C *

v a l u e

가

2 . 5 2 X 10~® M

로 나타났고

, g i n k g o l i d e s

의

IC50 v a l u e

는

6 . 3 5 x 1(T® ]VI

로 나타난

반면

, g i n k g o l i d e C

및

C N U 2

이은 혈소판 응집 억제

효과가 거의 없었던 것으로 나타났다

. P o s i t i v e c o n

t r o l s

사용한

K R 3 0 2 8 9

는

A D P

및

P A F

에 의 한 응집

에 대해 두 경우 모두에서

3 x 1 ( T M

의 농도에서 약

2 0 ~ 4 0

%의 약한 억제효과를 보이고

l(T * iV [

이상의 농

도에서는 강한 억제효과를 보여

I C s o v a l u e

이 각각

4 . 3 5 X 1 0 " M . 5 . 4 4 X 1 0 " " M

로 나타났는데 이는

P D E

억제에 의한 세포내

c y c l i c G M P

와

c y c l i c A M P

농도

중가에 기인하는 것으로 간주된다

"*. G i n k g o f l a -

v o n o l s

인

k a e m p f e r o l , q u e f c e t i n

과 다른 한 중의

f l a -

v o n

이인

m y r i c e t i n

의 혈소판 응집 억제효과룰 측정한

결과

m y r i c e t i n

이

10"^^^1

의 농도에서

P A F

에 의한 웅

집을

2 6 . 3 6 ± 2 . 4 2 %

억제해 미약한 억제효과룰 보인

■것 을 제외하고는 모두 유의성 있는 혈소관 웅집 억제효

파률 나타내지 않았다

.

그러나

. 3

중의

f l a v o n o l s

틀

와 혼합하여 항혈전효과를 측정한 실험에

서는

와

q u e r c e t i n

흔합물외 혈소판 억제

능력이

A D P

에 의해 유도된 응집에 대헤

g i n k g o l i d e

B

률 단득으로 실험했을때 중가한 양상을 보였는데 이

러한 결과는

q u e r c e t i n

이

P D E

를 억제해 세포내

^zy-

d i e G M P

와

c y c l i c A M P

의

l e v e l

을 높여 응집 유도제 의 종류에 무관하게 활성을 나타낸 것으로 간주된다

.

또

한 약물 흔합 실험시

P A F

에 외한 응집에 대해서도 세

조함 모두

3 X

농도에서

단

득 실험시보다 높은 억제효과를 보였다

.

이러한 결과는

위외

q u e r c e t i n

의 경우와 마찬가지로

f l a v o n o l

들이 일

련의 혈액응집 과정 중

와는 다른 경로에

작용하여 상승효과를 가져온 것에 기인한 것으로 볼 수 있다

7 ,.,,,

G i n k g o l i d e B

와

q u e r c e t i n

을 토끼에 경구투여 한

후 경시적으로 혈액을 취해 약물의 혈소관 응집 억제능

을 즉정한 결과

투여군

( 3 m g / k g

)의 경

우

0 .5

시간 경과 후부터

t i m e - d e p e n d e n t

하게 억제

*i

/. Pharm. Soc Korea

I

o o o o o

0

8

6

4

2

%uo!ljqjqul

(7)

과가 증가되어

1 . 5

시간 후에는

8 8 .9 6 ± 2 . 3 4

%의 강한 억제효과를 나타냈고

, q u e r c e t i n

을 투약한 경우에도

보다는 낮지만 시간 및 용량 의존적으로

억제효과를 보여

1 . 5

시간 경과 후에

3 3 .0 4 ± 3 .2 9 ? ^ ( 3 m g / k g

투여군

) 4 9 .8 7 ± 4 . 0 6 % ( 9 m g / k g

투여군)의 억제효과를 나타내었다

.

이 두 약물을 병용투여한 걸과

g i n k g o l i d e B 1 m g / k g

과

q u e r c e t i n 3 m g / k g - i -

병용 투여한 실험에서는 투약

2

시간 경과 후에

4 2 .8 6 ± 1 . 5 6

%의 억제효과롤 나타내었고 이러한 효과는 투약

3

시 간 경과 후에도 계속 지속되었다

. G i n k g o l i d e B 1 m g / k g . q u e r c e t i n 9 m g / k g

흔합 투여군과

g i n k g o l i d e B 3 m g / k g , q u e r c e t i n 3 m g / k g

혼합 투여군의 경우 단 득실험시 와 유사한 곡선양상을 보였고 두 경우 모두 투

약

1 . 5

시간 경과 후에 가장 높은 억제효과

( 6 2 . 3 6 ± 0 .

9 7 % . 9 2 .8 3 ± 0 . 7 6

%)를 보였다

.

이러한 결과로 미루

어 보아

는

1 m g / k g

외 용량에서는 응집

억제효과를 나타내지 못하지만

q u e r c e t i n

과 병용투여

시

q u e r c e t i n

의 효과를 증가시켜 주는 것을 알 수 있었

고

과

q u e r c e t i n 3 m g / k g - i -

병

용투여한 경우에는

단득투여

시와 비교시 투약

2 ~ 3

시간 경과 후에도

6 0 %

이상의

억제효과를 지속적으로 나타내는 것으로 보아

q u e r c e t i n

이

의

'

혈소핍

:

웅집 억 제효과를 지속시켜 주는 것을 알 수 있는데 이러한 일련의 약물 상호작용은 위에서 언급한 것과 동일한 이유에 의한 것 으로 추측된다

.

이들 여러 항혈소판 응집 실험걸과

s p e c i f i c

한

P A F

a n t a g o n i s t

인

g i n k g o l i d e s

및

q u e r c e t i n

등에서 유의 한 효과를 관찰할 수 있었는데

.

실제로 현재 은행잎 추 출물질이 폭넓은 연구의 대상이 되어 혈류개선 및 혈전

증 치료제로 널리 사용되고 었고

,

또한

S A R ( s t r u c t -

u r e a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p

)에 의거

. g i n k g o l i d e B

의

l i - p o p h i l i c i t y

를 증강시켜

보다 득성 이 낮 고 지속성 및 효력이 큰 약물을 개발하려는 노력이 시도 되 고 있다

.

은행잎 엑스 제제들외 성분이 주로

k a e m p f e r o l ,

q u e r c e t i n , i s o r h a m n e t i n

등의 배당체 복함물질인

g i n k g o f l a v o n g l y c o s i d e

이므로 이들 제제중의 하나인

징코민

- F R

정을 토끼와 당뇨환자에게 투여한 결과 실

험토끼외 경우

,

약물투여

3

일째부터 시간 및 용량 의존

적으로

A D P

와

P A F

에 의해 유도된 응집을 억제하는

것으로 나타났다

.

또한

r e t i n o p a t h y G I I

이상인 당뇨

환자를 대상으로 하여 실험한 결과도 첫날 첫번째 투약 후에는 혈소판 응집 저해효과를 나타내지 않았으나 일

주일간 징코민

- F **

정제롤 계속 투약한 후

8

일째 채혈하

여 측정한 결과에는

3

환자 모두에게서 일관성 있게 유 외성 있는 혈소관응집 억제효과를 나타내었다

. 8

일째

징코민

_ p «

정제를 투여한 후 혈소판 응집 억제능을 측

정한 결과

P A F

에 의해 유도된 응집에 대해 투약

1

시간

후 평균

6 7 . 1 ~ 3 . 5

%외 유의성 있는 억제효과를 나타내

었다

.

이러한 실험결과로 미루어 보아 말초 혈액 순환부 전이 일반적인 합병중으로 문제시되고 있는 당뇨 환자 및 심장순환계 질환 환자의 합병중 예방 및 치료에 은행 잎 제제들이 유효한 임상효과가 있을 것으로 기대된다

.

결 론

Ginkgo biloba

추출물인

g i n k g o l i d e s , g i n k g o f l a -

v o n o l s

와 은행엎 제제인 징코민

- F * "

정외 항혈전능을

측정한 결과 다움과 같은 결론을 얻었다

.

1 . ^{In vitro} p l a t e l e t a g g r e g a t i o n

실험 결과

g i n k g - o l i d e s

의

n a t u r a l m i x t u r e , g i n k g o l i d e B , g i n k g o

l i d e C , C N U 2

이은 모두

A D P

에 의해 유도된 응집에

대해서는 유의한 효과를 나타내지 않았으나

, P A F

에 의

해 유도된 혈소관 응집의 경우

와

g i n k -

g o l i d e s

의

I C s o

값이 각각

2 . 5 2 x l ( y " M . 6 . 3 5 x ] ( r * i V [

로

P A F

에 특이성 있는 억

제효과를 보인 반면

와

C N U 2

이은 혈소

판 응집 억제효과가 거의 없었던 것으로 나타났다

. O i n k g o f l a v o n

이인

k a e m p f e r o l , m y r i c e t i n , q u e r

c e t i n

등은 단득으로 실험시는 모두 혈소관 응집 억제

효과를 보이지 않았으나

와 병용실험시

3 x l 0 ' ' ~ 1 0 ' ® M

농도에서

P A F

에 의해 유도된 혈소판

응집에 대해 약

1 5 ~ 2 5

%외 웅집 억제효과를 나타내어

의 효과를 상승시킨 것으로 나타났고

,

특

히

와

q u e r c e t i n

외 혼합물은

1 (J ® M

에서

A D P

에 의한 응집에 대해서도 약한 억제효과

( 2 3 . 5 4 ±

1 . 1 2

%)를 보였다

.

2 , G i n k g o l i d e B

와

q u e r c e t i n

을 토끼에 투여한 후 채혈하여 분석한 걸과 모두 농도 의존적으로 억제효과 률 나타내었다

. G i n k g o l i d e B

투여군의 경우

1 m g /

k g

투여시에는

P A F

에 의해 유도된 혈소관 응집에 대

해 억제효과틀 나타내지 않았으나

3 m g / k g

의 용량을

투여한 경우에는

1 . 5

시간 후에

8 8 .9 6 ± 2 . 3 4

%의 강한

Vol. 38, No. 3, 1995.

(8)

억제효과를 보였고, quercetin을 투여한 경우에도 1.5시간 경과 후에 3 3 .0 4 ^ 9 .8 7 % 억제효과를 나타내 었다. 이러한 억제효과는 1.5시간 경과 후에 가장 강했 고 그 이후 점차 감소하였다. 두 약물을 병용투여한 경 우에도 비숫한 곡선양상을 보였으며 두 약물의 병용투 여에 외해 혈소관 응집 억제효과가 2~ 3시간 후에도 계 속 지속되는 것으로 나타났다.

3. 정코민-F R 정(5 and 20 m g)을 토끼에게 1일 2회 씩 10일간 반복투여하면서 혈소판 응집 억제능을 측정 한 결과 투여 3일째부터 A D P 및 P A F 에 의해 유도된 응집에 대해 모두 시간 및 용량 의존적인 억제효과를 보 였다. 또한 망막장에가 있는 3명외 당뇨환자를 대상으 로 징 코 민 - 정 외 혈소판 웅집 억제효과를 설험한 결 과 3환자 모두 첫날에는 A D P 및 P A F 에 외해 유도된 혈소판 응집에 대해 영향을 미처지 못했으나 일주일간 계속 투약한 후 8일째 투약 1시간 후에 채혈하여 측정 한 결과 A D P 와 P A F에 외 해 유도된 응집에 대해 각각 29.82 ± 6.55 % 와 67.10± 3.50% 의 억제효과를 나타 내 3환자 모두 유외성 있는 혈소관 응집 억제효과롤 나 타냈다.

감사의 말씀

본 연구는 서울대학교 신약개발센터(ERC) 지원에 의해 연구된 결과의 일부로써 이에 감사드리며 또한 본 실험에 필요한 시약 등을 지원해 주신 (주) 동방제약에게 도 감사드럽니다. 본설험에 사용된 추출물과 합성시료 롤 제공하여 주신 층남대학교 약학대학 안병준. 정상헌 교수와 한국화학연구소 유성은박사께 감사 드럽니다.

또한 임상실험을 시행하여 주신 층남대학교 의과대학 김삼용교수께도 감사 드럽니다.

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