학 술 논 문
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미세 유체 칩 기반의 히알루론산 미세 실의 제작
이윤경·이광호
강원대학교 공과대학 신소재공학과
Micro-threads of Cross-linked Hyaluronic Acid Hydrogel using a Microfluidic Chip
Yun-Kyung Lee and Kwang-Ho Lee
Department of Advanced Materials Science and Engineering, College of Engineering, Kangwon National University, 1 Kangwondaehak-gil, Chuncheon 24341, Republic of Korea
(Manuscript received 16 February 2017; revised 4 March 2017; accepted 5 March 2017)
Abstract: The successful synthesis of hyaluronic acid micro-threads is very promising approach for the broad appli- cation in tissue engineering such as dermal fillers. Because hyaluronic acid has the excellent biocompatibility and ability to maintain the moisture of up to several hundred times its own weight. In order to generate the hyaluronic acid micro-threads in microfluidic system, we employed two-phase flow microfluidic chip to make a rapid synthesis of the hyaluronic acid hydrogel. Hyaluronic acid was mixed with 0.02N NaOH solution and 1, 4-Butanediol diglycidyl ether (BDDE) solution and then injected into core channel. The ethanol was used for the 3-dimensional micro-thread formation in sheath channel. We manipulated the diameter of HA micro-threads using controlling of flow rates in microfluidic chip, and showed the feasibility of immobilization in HA micro-threads with florescent substances. Also, the generated HA micro-threads were evaluated and showed the suitable properties with tensile strength, bending property, and swelling profiles for dermal fillers. As a result, we suggested an innovative method for microfluidic chip- based HA micro-threads which could safely be applied as dermal filler in tissue engineering.
Key words: hyaluronic acid, 1, 4-butanediol diglycidyl ether, dermal filler, immobilization, swelling, microfluidic chip
I. 서 론
조직공학(Tissue Engineering) 분야에서 생체 조직의 재 생 및 수복을 목적으로 천연 및 합성 고분자 재료를 기반으 로 한 3 차원 지지체(Scaffold)의 활용이 점차 확대되고 있 다[1,2]. 기존에는 생체 내의 조직 및 장기와 형태학적으로 만 유사한 3 차원 지지체 제조에 중점을 두었지만, 최근에
는 조직 혹은 장기의 기능을 대체하며 형태적으로나 기능적 으로도 완성도가 높은 3 차원 지지체의 개발에 목표를 두고 있다[3]. 이를 위해서는 무엇보다 3 차원 지지체가 인체 내 로 이식되었을 시 기존의 조직 및 장기와의 융화가 효과적 으로 이루어져야 하고, 혈액응고 및 염증 반응 등의 부작용 이 유발되지 않으면서 생체 내에 불필요한 이물질이 체내에 남지 않아야 할 것이다[4-7]. 이러한 조건들을 충족시키기 위해 다양한 생체 고분자 재료들이 활용되고 있으며, 이 중 에서 물을 기본적인 분산매로 하며 3 차원적 망목 구조 내 에 많은 수분을 함유 하는 다양한 수화젤(Hydrogel)이 최 적의 생체재료 중의 하나로 제안되고 있다[8-11]. 최근에는 천연 고분자인 히알루론산(Hyaluronic Acid, HA), 콜라젠 (Collagen), 젤라틴(Gelatin), 피브린(Fibrin), 키토산(Chitosan) 등이 다양한 임상 분야에 폭넓게 활용되고 있다[12-17]. 특 히 N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine)과 글루쿠 Corresponding Author : Kwang-Ho Lee
Department of Advanced Materials Science and Engineering, College of Engineering, Kangwon National University, 1 Kangwondaehak-gil, Chuncheon 24341, Republic of Korea TEL: +82-33-250-6269 / FAX: +82-33-259-5545
E-mail: [email protected]
이 연구는 보건복지부 의료기기기술개발 사업(과제번호-HI14-
C0522)과 2015 년도 강원대학교 학술연구조성과제(과제번호-
520150034) 의 지원을 받아 수행하였음.
2
론산(Glucuronic acid)이 교대로 사슬 형태로 결합되어 체 내의 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)을 구성하는 천연 고분자인 히알루론산은 세포와 세포 사이 또는 섬유 사이에 젤 상태로 존재하면서 조직의 빈 공간을 채우고, 세 균의 침입 등을 억제해 콜라젠 재생을 촉진할 수 있어 피부 의 기능 증진, 상처 치유, 연골 기질 안정화 등에 가장 효 과적인 재료로 인식되고 되고 있다[7,18-21]. 또한 체내에 존재하는 천연 고분자 재료이기 때문에 뛰어난 생체적합성 을 지니고 있으며, 스스로의 무게의 수백 배에 달하는 수분 을 보유하는 보습인자 역할을 하기 때문에 약물 및 제약분 야의 활용을 넘어 미용 분야에서 가장 우수한 충진제로 제 안되고 있다[13,22,23]. 이러한 히알루론산을 생체 조직 내 충진제로 사용하기 위해서는 기존 충진제에 비해 생분해 속 도가 길어야 하고 이에 따라 충진제를 보충해야 하는 시기 를 감소 시키는 것이 중요하다. 하지만, 히알루론산은 생체 내에 존재하는 히알루로니다아제(Hyaluronidase)와 같은 효소에 의해 분해가 발생하는 단점이 있으며 이를 방지하기 위해서는 히알루론산 분자들 사이에 다른 고분자와의 가교 공정이 필수적으로 수반되어야 하므로 실과 같은 3차원 구 조체로의 개발에 한계가 있었다[17,18,24,25]. 기존의 연구 에서는 실 형태의 구조체를 제조하기 위해 미세 단위 직경 의 바늘을 통해 실의 직접적인 추출을 유도하는 압출법 [26,27]과 가교제와 혼합된 수화젤을 자외선에 노출시켜 가 교반응을 유도하는 광 가교법[28] 등이 이용되어 왔다. 이 러한 방법들은 제조방법이 용이하며 저비용으로 단기간 내 에 대량으로 제조가 가능하지만 히알루론산 용액과 가교제 만을 사용하여 마이크로 단위의 실을 제작 시 강한 압력에 의해 추출되어 실의 형태가 유지되지 못하고, 무엇보다 히 알루론산 실 제작과 동시에 물질의 고정을 구현하여 기능성 을 부여하거나 다양한 마이크로 단위의 직경으로 제어하기 에 어려움이 있었다. 최근에는 콜라젠, 알지네이트(Alginate) 등의 수화젤을 이용하여 미세 유체 칩 내에 유체의 가교 조 건을 제공하여 기존에 비해 빠른 합성시간을 유도해내고 제 작과 동시에 약물 및 세포 등의 고정도 가능한 합성법이 제 시되고 있으나[29-31], 히알루론산 미세 실을 이용하기 위 해 미세 유체 칩을 이용한 연구는 보고되지 않고 있어, 본 연구에서는 히알루론산의 가교반응을 유도하기 위하여 방적 (Spinning) 이 가능한 미세 유체 칩을 사용하였고 히알루론 산의 가교제인 1, 4-부탄디올 디글리시딜에테르(1, 4- butanediol diglycidyl ether, BDDE) 를 사용하였다. 제작 되는 히알루론산 미세 실이 생체 내에 적용되었을 시, 문제 될 수 있는 가교제의 잔류량을 최소화하여 순수한 히알루론 산 만이 존재할 수 있도록 합성을 수행하였다. 또한, 가교된 히알루론산 미세 실의 화학 조성, 굽힘성, 팽윤성, 물질 고 정성 및 세포안정성에 대한 실험을 통해 손상된 피부 조직
의 수복 및 재생에 대한 히알루론산 미세 실의 활용 가능성 을 검증하였다.
II. 연구 방법
1. 미세 유체 칩 제작
히알루론산(Hyaluronic acid, HA)(Bioland, Korea) 미 세 실 가교를 위한 미세 채널이 내재된 칩 제작을 위해 소 프트 리소그래피(Soft lithograpy)공정을 이용했으며[32], 칩은 히알루론산 및 가교제 혼합용액이 주입될 중앙 채널 (Core channel; 폭 400 µm, 길이 6 mm)과 미세 실의 형 태 유도를 위해 에탄올(Daejung, Korea)이 주입될 측면 채 널(Sheath channel; 폭 400 µm, 길이 13.5 mm)로 구성되 었고, 두 용액이 혼합되는 채널의 폭은 700 µm, 길이는 30 mm 로 설계되었다(그림 1(a)). 제작된 실리콘 웨이퍼 (Silicon wafer) 표면 위에 폴리디메틸실록산(Polydim- ethylsiloxane, PDMS)(Corning, USA)과 경화제를 각각 10:1 의 비율로 혼합한 용액을 도포하였다. 80
oC 실험용 오 븐(Oven)(Biofree, Korea)에서 30 분 동안 열 경화 과정을 통해 도포된 PDMS용액을 경화시킨 후 실리콘 웨이퍼 표 면으로부터 경화된 PDMS칩을 탈착시켜 불필요한 부분을 제거하였다. 상부에는 직경 1.5 mm 크기의 펀치(Miltex,
그림 1. (a) 미세 채널이 내재된 미세 유체 칩의 개략도, (b) PDMS 에 의해 제작된 미세 유체 칩, (c) 화학 가교반응에 의해 추출된 10wt%
히알루론산 미세 실의 표면 사진, (d) 5wt% 히알루론산 미세 실의 광학현미경 사진, (e) 10wt% 히알루론산 미세 실의 광학현미경 사진.
Fig. 1. (a) Schematic image of microfluidic chip containing microchannels, (b) The fabricated PDMS based microfluidic chip, (c) Surface image of chemically crosslinked 10wt%
hyaluronic acid microthreads, (d) Optical micrographs of 5wt% hyaluronic acid microthreads, (e) Optical micro- graphs of 10wt% hyaluronic acid microthreads.
3 USA) 를 이용해 히알루론산 및 에탄올이 주입 될 수 있도
록 주입 구를 먼저 형성시킨 후, 채널이 새겨진 두 PDMS 층을 부착시키기 위해 대기압 산소 플라즈마 장비(Femto science, Korea) 내에 칩을 넣고 1 분 동안 60W 세기의 산 소 플라즈마를 통한 표면처리를 하였다. 마지막으로, 수치해 석으로 설계된 칩의 형상을 정확히 구현하기 위해 칩의 상 부와 하부에 각각 음각으로 형성된 미세 채널의 모든 직선 및 곡선이 정합 될 수 있도록 광학현미경(OLYMPUS, Japan) 을 사용하여 상부와 하부 층을 접합시켰다. 접합 을 견고하게 하기 위해 80
oC 의 핫플레이트(Hot plate) (DAIHAN Scientific, Korea) 에서 30 분 동안 열처리를 하 였다.
2. 히알루론산 미세 실의 제작
히알루론산 미세 실의 제작을 위해 분자량 20,000의 히 알루론산과 가교제로 1, 4-부탄디올 디글리시딜에테르(1, 4- butanediol diglycidyl ether, BDDE)(Sigma aldrich, USA) 가 사용되었다. 4 ml의 0.02N NaOH (Sigma aldrich, USA) 용액을 넣고 10wt% 의 히알루론산을 주입한 후 교반 기(Grant bio, U.K)를 사용하여 12 시간 동안 15rpm의 속 도로 혼합하였다. 충분한 혼합이 이루어진 용액에 히알루론 산의 0.1몰(Mole)에 해당하는 가교제 BDDE를 추가 주입 하였고 다시 12 시간 동안의 기계적 교반 과정을 통해 최 종적으로 10wt% 히알루론산 용액을 제조하였다. 또한, 히 알루론산의 농도 차이에 따른 비교 분석을 위해 0.02N NaOH에 5wt%의 히알루론산을 투여한 후 히알루론산의 0.1 몰에 해당하는 가교제 BDDE를 주입하여 상기 방법과 동일하게 혼합하였다. 칩 채널 내로 주입되는 유량 및 유속 조건을 균일하게 제어하기 위해 실린지 펌프(Kd Scientific, Korea) 가 사용되었으며, 10wt% 히알루론산 용액은 튜브를 통해 칩의 중앙채널로 40 µl/min. 속도로 주입하였으며 (5wt% 인 경우: 30 µl/min.), 중앙 채널을 감싸며 히알루론 산 용액의 추출을 유도하기 위해 설계된 측면 채널에 연결 된 튜브에는 94.5%의 에탄올을 20 µl/min. 속도로 주입하 였다. 추출된 히알루론산 미세 섬유는 94.5% 에탄올에서 즉 시 수확한 후, 12 시간 동안 상온에서 건조하여 잔류 용매 를 제거하였다.
3. 히알루론산 미세 실의 물성 분석
제작된 미세 실을 관찰하기 위해 광학현미경과 전계방사 형 주사전자현미경(Field emission scanning electron microscope, FE-SEM)(Hitachi, Japan) 이 사용되었다.
5wt% 및 10wt% 히알루론산 미세 실의 각각 50 개 시료 에 대한 표면 특성과 거칠기 및 직경을 광학현미경을 통해 분석하였고, 히알루론산 미세 실의 비전도성 특성에 의한
charge-up 현상을 방지 하기 위해 20 초 간 시료 표면을 백금 코팅한 후[33], 시료 표면의 손상을 최소화하기 위해 5 kV 의 낮은 가속전압을 인가하여 FE-SEM을 통한 표면 분석을 수행하였으며 추가적으로 히알루론산 미세 실의 순 수한 표면 구성 성분을 도출 및 증명하기 위해 에너지 분산 분석기(Energy dispersive spectroscopy, EDS)를 이용하 였다. 또한, 적외선 분광기(Fourier transform infrared spectrometry, FT-IR)(PerkinElmer, UK) 를 이용하여 광 원을 통해 얻어지는 히알루론산 고유의 특징적인 흡수 파장 에 의한 화학 결정 구조를 분석하였다. 제작된 히알루론산 미세 실의 기계적 물성을 측정하기 위해서는 미세 실의 인 장강도 시험 및 굽힘성 시험을 수행하였다. 인장강도 시험 을 수행하기 위해서 마이크로 인장 시험 분석장비(Yeonjin, Korea)를 사용하였고, 길이 5 cm 및 평균 직경 139 µm의 10wt% 히알루론산 미세 실에 대한 인장강도를 측정하였다.
굽힘성 시험을 위해서는 각각의 직경(0.55 mm, 2.35 mm) 을 지니는 두 종류의 막대에 대해 각각의 길이(6 cm, 5 cm) 및 직경(150 µm, 250 µm)을 지니는 히알루론산 미세 실을 수 차례 감아 굽힘 특성을 증명하였다.
4. 형광물질 고정 및 팽윤성 분석
미세 칩을 통해서 제작되는 히알루론산 미세 실 내의 물 질 고정가능성을 검증하기 위해 용액 제조 시 히알루론산 용액 내에 적색 파장에서 발현되는 10 µm 크기의 적색 형 광입자(sicastar®-redF) (Micromod, Germany)와 녹색 파장에서 발현되는 10 kDa의 BSA-FITC 녹색 형광용액 (Invitrogen, UK) 을 각각 혼합하여 히알루론산 미세 실 내 부로의 물질 고정가능성을 검증하였다. 또한, 수화젤의 특성 인 미세 실의 팽윤 특성 분석을 위해 히알루론산 혼합용액 내에 500 nm 크기의 녹색 형광입자(sicastar®-greenF) (Micromod, Germany) 를 주입한 후, 입자가 고정된 각각 다른 직경을 가지는 히알루론산 미세 실 표면 위에 PBS 용 액 1 ml를 도포하여 시간에 따라 미세 실의 팽윤 형상을 형 광현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 관찰하였다. 시간 에 따른 미세 실의 팽윤비를 분석하기 위해서는 3 ml의 PBS 에 히알루론산 미세 실을 담근 후 12 시간 동안 상온 에서 건조 시켜 일정한 시간에 따른 무게를 측정하였다. 평 형 팽윤비는 다음 식(1)을 이용하여 분석하였다.
Swelling ratio (SR) = 식(1)
본 식에서, W
s(mg) 는 팽윤된 히알루론산 미세 실의 무 게이며 W
D(mg) 은 건조된 히알루론산 미세 실의 무게를 나 타낸다. 본 연구에서 W
D는 2 mg으로 고정하였다.
W
S– W
DW
D---
4
5. 세포적합성 시험
히알루론산 미세 실의 체내 안정성을 평가하기 위해 세포 적합성 시험을 수행하였다. 12 시간 동안의 자외선 광원 조 사 및 에탄올과 증류수에 의한 세척을 통해 미세 실의 멸균 과정을 거쳤다. 쥐의 신경 교종세포의 한 종류인 C6세포는 Dubecco’s modified eagle’s medium (DMEM) (WELGENE, Korea), Fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Korea) 과 Penicillin (WELGENE, Korea) 이 혼합된 배양액 내에서 배양되었으며, 5%의 CO
2환경이 조성된 37
oC 의 배양기 (SANYO, KOREA) 내에서 3 일 동안 배양 후, 6 well 세 포 배양접시(SPL life sciences, Korea)에 고정된 히알루 론산 미세 실 위에 0.5 × 10
6/ml 의 농도로 세포를 5일동안 배양하였다. 5 일 후 LIVE/DEAD
®kit (Invitrogen, Cal- ifornia, USA)를 이용한 세포 염색을 위해 세포가 배양된 히알루론산 미세 실 주변의 세포 배양액을 제거한 후 PBS 를 통해 2 차례 세척하였다. 2 ml의 PBS 내에 4 µl의 Ethidium Homodimer-1 (Eth-D1) 과 1 µl의 Calcein-AM 을 혼합하여 제조된 LIVE/DEAD
®세포 염색 용액을 80 µl 주입하여 40 분 동안 배양기에서 보관 후, 형광현미경을 통 해 세포의 생존율을 측정하였다.
III. 연구 결과 및 고찰
1. 히알루론산 미세 실의 제작
히알루론산 미세 실의 제작을 위해 음각으로 형성된 미세 채널 및 직경 1.5 mm의 구멍이 형성된 상부와 이와 동일 한 미세 채널이 음각으로 형성된 하부 총 2개의 층으로 이 루어진 PDMS기반의 미세 유체 칩은 그림 1(b)와 같이 안 정적으로 제작되었다. 제안된 미세 유체 칩에서는 가교제와 혼합된 히알루론산 용액이 중심 채널로 유입되면서 가교가 진행되며, 측면 채널에서 유입된 에탄올이 중심 채널의 히 알루론산 외부를 둘러싸며 3차원적 미세 실의 형태로 칩 밖 으로 압출을 유도하였다(그림 1(c)). 주입되는 에탄올은 가 교된 히알루론산 미세 실과 계면을 형성할 수 있어 미세 실 의 형태가 안정적으로 유지되는 역할을 수행하였다. 표 1에 서와 같이 주입되는 히알루론산 용액의 유량의 제어를 통해 서 미세 실의 직경을 제어 할 수 있었으며, 측면 채널에서
유입되는 에탄올의 유량(20 µl/min.)을 고정시키고 중심채 널에서 유입되는 히알루론산의 농도를 5wt%에서 10wt%로 2 배를 높이고 유량을 30 µl/min. 에서 40 µl/min. 으로 증 가시켰을 시, 제작되는 히알루론산 미세 실의 직경을 약 2 배 증가시킬 수 있었다(그림 1(d~e)). 중심채널의 유량 감 소를 통해 히알루론산 미세 실의 직경을 더 감소시킬 수 있 었으나 제작된 실의 기계적 강도가 매우 저하되었으며, 유 량을 증가시켰을 경우 미세 실이 칩 내에서 압출되지 않고 막히는 경우가 발생하여 본 연구에서는 10wt% 의 히알루 론산 용액의 조건이 본 실험에서 가장 최적화된 조건으로 활용되었다. 광학현미경 사진을 통해 각각의 조건에 해당하 는 50 개 시료의 직경을 분석한 결과 10wt% 히알루론산 미세 실의 직경은 중앙채널 유체속도가 40 µl/min. 측면채 널 유체속도가 20 µl/min. 일 경우 평균 약 139 µm이며, 중 앙채널 유체속도를 30 µl/min. 로 감소시킨 경우 평균 직경 이 약 237 µm로 증가하였다. 이는 히알루론산 농도를 고정 하고 칩 채널을 통한 유체 속도를 변화시킴에 따라 다양한 직경의 미세 실이 얻어질 수 있음을 나타낸다. 5wt% 히알루 론산 미세 실의 직경은 평균 약 64 µm로 측정되었다(표 1).
2. 히알루론산 미세 실의 표면 분석
그림 2(a)는 FE-SEM을 통해 측정된 10wt% 히알루론산 미세 실의 표면 사진으로, 미세 실의 추출 과정에서 미세 유 체 칩 내 중앙 채널 및 측면 채널에 유입되는 유체의 유량 및 점도 차이에 의해 중앙부와 측면 사이에 굴곡진 형상이 나타났으나 유체가 흘러가는 축 방향으로는 균일한 표면 형 상이 관찰되었다. 또한 제작된 히알루론산 미세 실의 구성 원소를 분석한 결과 히알루론산과 가교제에 의한 탄소와 산 소, 그리고 수산화나트륨에 의한 소디움 성분이 히알루론산 원재료와 동일한 주요 성분으로 추출되었음을 확인하였다(그 림 2(b)). 그림 2(c)는 BDDE 가교제에 의한 10wt% 히알루 론산 미세 실의 표면을 구성하는 화학 조성을 나타낸 FT- IR 결과로 3265 cm
−1흡광도를 통해서 히알루론산 미세 실 표면을 이루고 있는 C-H결합, N-H결합, O-H결합과 일치 하는 조성 분석 값을 얻었으며, 1598 cm
−1, 1421 cm
−1흡 광도에서는 –COOH, C=O결합에 대한 진동으로 기인하였 음을 확인하였다. 마지막으로 C-O, C-C결합은 1025 cm
−1표 1. 히알루론산 미세 실의 제조 조건 및 평균 직경.
Table 1. Fabrication conditions and mean diameters for hyaluronic acid microthreads.
Condition Core channel Sheath channel
Mean diameter HA + 0.02N NaOH + BDDE 94.5% Ethanol
5wt% HA Thread 30 µl/min. 20 µl/min. 64 µm
10wt% HA Thread 40 µl/min. 20 µl/min. 139 µm
30 µl/min. 20 µl/min. 237 µm
5 흡광도를 통해 확인되었다[34]. 도출된 결과를 바탕으로 히
알루론산 미세 실을 이루는 화학 조성이 히알루론산 원재료
와 일치함을 증명하였다.
3. 인장강도 및 굽힘성 평가
그림 3(a-b)는 10wt% 히알루론산 미세 실의 인장강도 시 험 결과를 나타낸 것으로 평균 0.0152 ± 0.0016MPa 의 값 을 도출하였다. 이러한 측정치는 일반적으로 조직공학용 생 분해성 고분자의 인장강도와 비교했을 경우[35] 이식용 필 러로 사용할 수 있는 기계적 값을 만족시킬 수 있을 것으로 판단된다. 그림 3(c)는 제작된 미세 실의 굽힘성을 검증하기 위한 결과로 약 150 µm의 직경을 지닌 히알루론산 미세 실 은 0.55 mm의 직경을 지닌 막대에 50
o이상의 각도로 23 차례의 굽힘이 가능하였고, 약 250 µm의 직경을 지닌 히알 루론산 미세 실은 2.35 mm의 직경을 지닌 막대에 8 차례 의 굽힘이 가능하였다. 이러한 결과는 제조된 다양한 직경 의 히알루론산 미세 실이 수 차례의 굽힘에도 끊어짐이나 늘어짐의 현상 없이 본래의 물성을 유지하며 안정적으로 굽 혀질 수 있음을 증명하였고, 이는 히알루론산 미세 실이 인 체에 적용될 경우 체내의 굴곡진 부위에도 안정적으로 활용 이 가능함을 나타낸다.
4. 히알루론산 미세 실의 물질 고정
그림 4는 히알루론산 미세 실 제작 시에 미세 실의 가교 및 실의 형성과 함께 고상 및 액상 물질을 동시에 주입하여 제작된 실의 사진이다. 그림 4(a)는 590~630 nm 파장대 부 근에서 적색 파장으로 발현되는 형광입자(직경: 10 µm)가
그림 3. 10wt% 히알루론산 미세 실의 물성 분석, (a) 히알루론산 미세 실의 인장강도 시험, (b) 히알루론산 미세 실의 인장강도 시험 결 과 그래프, (c) 히알루론산 미세 실의 굽힘 특성 분석 사진.
Fig. 3. Analysis of physical properties of 10wt% hyaluronic acid microthreads, (a) Tensile strength test of hyaluronic acid microthreads, (b) Tensile strength graph of hyaluronic acid microthreads, (c) Bending test image of hyaluronic acid microthreads.
그림 2. 10wt% 히알루론산 미세 실의 표면 분석, (a) 히알루론산 미세 실의 FE-SEM 사진, (b) 표면 구성 원소 분석, (c) FT-IR 분석 스펙트럼.
Fig. 2. Surface analysis of 10wt% hyaluronic acid microthreads, (a) FE-SEM image of hyaluronic acid microthreads, (b) Surface composition element analysis, (c) FT-IR spectra.
6
미세 실의 전체에 안정적이며 균일하게 분포되었음을 보여 주고 있으며, 미세 실의 내부에 고상의 입자가 고정되었음 에도 불구하고 제작된 미세 실의 형태나 직경의 변화가 관 찰 되지 않았다. 그림 4(b)는 460~491 nm 파장대 부근에 서 녹색으로 발현되는 10 kDa의 크기를 갖는 BSA-FITC 형광용액이 내재된 히알루론산 미세 실의 형광사진이며 형 광입자가 고정된 경우와 동일하게 히알루론산 미세 실 전체 에 고르게 고정되었음을 확인 할 수 있었고, 이러한 결과로 체내에 이식 시 미세 실 내부에 약물 및 생리활성 물질 등 의 고정을 통해 약물의 전달 제어 등의 기능성을 부여 할 수 있을 것으로 예상된다.
5. 팽윤성 분석
히알루론산 미세 실의 수화 젤 특성을 검증하기 위해 500 nm 의 직경을 갖는 녹색으로 발현되는 형광 입자를 10wt% 히알루론산 미세 실에 고정하여 수분에 의한 팽윤 시에 입자의 이동을 추적해 제작된 실의 팽윤성을 분석하였 다. 그림 5(a-c)는 제작된 미세 실을 직경 50~100 µm, 100~150 µm, 그리고 150~200 µm의 세 군으로 분류하였 으며, 각각의 미세 실에 PBS 용액이 흡수되는 순간을 고속 카메라로 0.2 초 동안 촬영하여 각각의 미세 실 세 곳의 입 자들의 변위를 측정한 것이다. PBS 용액이 닿는 순간 제작 된 실은 물을 함수하며 팽창하였으며, 50~150 µm 직경을 가지는 실에서의 팽윤 속도는 실의 직경과 상관없이 비슷한 약 0.5 mm/sec. 정도의 팽윤 속도를 나타냈으나, 150~200 µm의 직경을 가지는 실의 팽윤 속도가 약 2 배 정도 빠른 1.1 mm/sec. 속도를 갖는 것으로 분석되었다(그림 5(d)). 이 는 미세 실 제작 시 미세 실의 직경을 크게 하기 위해 중심 채널로 유입되는 히알루론산 용액의 유량을 증가 시켰을 경 우 상대적으로 측면 채널로 유입되는 에탄올에 의한 중심
축으로의 압축이 감소되어 미세 실의 내부 밀도가 낮게 형 성이 되어 팽윤 속도가 상대적으로 빠르게 나타난 것으로 분석된다. 그림 5(e)는 식 (1)에서와 같이 10wt% 히알루론 산 미세 실에 물을 함수시켜 발생되는 실의 팽윤비에 대한 그래프로 시간이 경과함에 따라 미세 실 내로 함수되는 물 의 양이 점차적으로 증가하여 5 일 후에는 88.5(mg/mg)의 수치를 나타내었다. 이러한 결과는 고분자 재료 중 친수성 이 가장 우수한 히알루론산의 특성을 보여주는 것으로 판단 된다.
6. 세포적합성 평가
제작된 히알루론산 미세 실의 세포적합성 평가를 위해 10wt% 히알루론산 미세 실 표면에 C6 세포를 배양하였으 며, 총 5일 간의 세포 배양기간 동안 동일한 영역의 미세 실 표면에서 증식되는 세포의 사진을 촬영하고자 했으나, 매일 이루어진 배양액 교체와 히알루론산의 팽윤현상 및 세포의 증식에 따른 문제로 동일한 부위 측정에 어려움이 있었다.
그림 6(a)는 히알루론산 미세 실 표면에 증식된 C6 세포의 3 일차 사진으로 세포가 균일하게 분포되어 배양된 것을 확 인할 수 있었으며, 제작된 히알루론산의 미세 실로 인한 미 세 환경의 변화에 따른 C6 세포의 형태 변화 및 특이성은 관찰 할 수 없었으나, LIVE/DEAD
®kit로 세포를 염색한 결과 그림 6(b)와 같이 미세 실 표면에서 세포의 생존율은 약 98%(녹색발현: 생존, 적색발현: 사멸) 이상으로 높게 관 찰되었다. 제작된 미세 실 표면에서 배양된 세포의 높은 증 식률과 생존율은 3차원적인 히알루론산 미세 실의 형태를 유도하기 위해 가교제와 에탄올을 미세 칩에 함께 주입하여 제작했음에도 불구하고, 원재료인 히알루론산의 우수한 세 포 적합성을 그대로 확보한 것으로 평가되었다.
그림 4. 형광물질이 고정된 10wt% 히알루론산 미세 실의 형광현미경 사진, (a) 적색 형광입자(10 µm)가 고정된 히알루론산 미세 실의 형 광현미경 사진, (b) 녹색 형광용액(10 kDa)이 고정된 히알루론산 미세 실의 형광현미경 사진.
Fig. 4. Fluorescence microscope images of 10wt% hyaluronic acid microthreads immobilized fluorescence materials, (a) Fluorescence microscope image of hyaluronic acid microthreads immobilized 10µm red beads, (b) Fluorescence microscope image of hyaluronic acid microthreads immobilized 10 kDa green solution.
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IV. 결 론
본 연구에서는 조직수복용으로 사용되는 천연 고분자인 히알루론산을 주 재료로 미세 실을 제조 하였다. 히알루론 산은 생체 내에 진피 필러 등으로 이식하고자 할 경우, 수 화젤의 특성에 기인하여 기계적 강도가 낮은 단점으로 구조 체로 형성이 어렵고, 무엇보다 기존의 공정으로는 마이크로 단위의 실로 제작 시 기계적 물성 저하가 커서 제작의 어려 움이 있었다. 하지만, 제안된 연구에서는 미세 유체 칩 내에 서 최소한의 가교제 사용과 에탄올을 이용해서 가교와 동시 에 3차원적인 미세 실의 형태로 제작에 성공하였다. 사용된 미세 유체 칩은 칩 내로 유입되는 히알루론산과 에탄올의 유량 제어를 통해 중심 채널로 유입되는 히알루론산의 유량 을 증가 또는 감소시켜 제작되는 직경을 제어 할 수 있었으 며, 직경에 따른 팽윤 특성, 인장 강도, 굽힘 특성 등의 다
양한 물성을 제시할 수 있었다. 특히, 히알루론산 미세 실의 제작 시에 나노 혹은 마이크로 단위의 입자 및 용액이 히알 루론산 미세 실 표면 내에 균일하게 안정적으로 고정이 가 능하였음을 제시하였다. 미세 실 내에 물질의 고정을 통해 정량적인 물질의 방출 또한 가능 할 것으로 판단되며, 이러 한 결과를 토대로 약물 또는 생리활성 물질이 고정된 히알 루론산 미세 실을 생체 내에 이식하여 손상된 피부 조직의 재생 및 미용 분야에 적용 가능함을 나타내었다.
References
[1] K.H. Lee, S.J. Shin, C.B. Kim, J.K. Kim, Y.W. Cho, B.G.
Chung, et al., “Microfluidic synthesis of pure chitosan microfibers for bio-artificial liver chip,” Lab on a Chip, vol.
10, pp. 1328-1334, 2010.
[2] R. Langer and D.A. Tirrell, “Designing materials for biology 그림 6. (a) 히알루론산 미세 실 표면에서 3 일 동안 배양된 C6 세포의 광학현미경 사진(Scale bar = 250 µm), (b-c) 히알루론산 미세 실 표면에서 5 일 동안 배양된 C6 세포의 LIVE/DEAD 염색 사진((b): Scale bar = 250 µm, (c): Scale bar = 100 µm).
Fig. 6. (a) Optical micrographs of C6 cell cultured on the surface of 10wt% hyaluronic acid microthreads for 3 days (Scale bar = 250µm), (b-c) LIVE/DEAD staining image of C6 cells cultured on the 10wt% hyaluronic acid microthreads for 5 days((b): Scale bar = 250µm, (c): Scale bar = 100 µm).
그림 5. 10wt% 히알루론산 미세 실의 팽윤 특성 분석, (a-c) 녹색 형광입자(500 nm)가 고정된 히알루론산 미세 실의 형광현미경 사진, (d) 히알루론산 팽윤 속도 그래프, (e) 히알루론산 평형 팽윤비 그래프. Scale bar = 250 µm.
Fig. 5. Swelling characteristics of 10wt% hyaluronic acid microthreads, (a-c) Fluorescence microscope images of hyaluronic acid microthreads immobilized 500 nm green beads (threads diameter; (a) 50~100µm, (b) 100~150 µm, (c) 150~200 µm), (d) Swelling velocity graph of hyaluronic acid microthreads, (e) Equilibrium swelling ratios of swelling hyaluronic acid microthreads. Scale bar = 250µm.
8
and medicine,” Nature, vol. 428, pp. 487-92, Apr 1 2004.
[3] B.G. Chung, K.H. Lee, A. Khademhosseini, and S.H. Lee,
“Microfluidic fabrication of microengineered hydrogels and their application in tissue engineering,” Lab on a Chip, vol.
12, pp. 45-59, 2012.
[4] J. Park, “Biomaterials: Science and Engineering Plenum Press,” New York, 1984.
[5] I. Park, S.H. Oh, and J.H. Lee, “Fabrication and characteriza- tion of pore size gradient alginate scaffold by a centrifuga- tion method,” Tissue Eng Regen Med, vol. 1, pp. 164, 2004.
[6] W. Jang, S. Kim, I. Lee, M. Kim, J. Rhee, G. Khang, et al.,
“Neurogenesis of bone marrow stromal cell using controlled release of butylated hydroxyanisole from PLGA films,” Tis- sue Eng Regen Med, vol. 2, pp. 100, 2005.
[7] C.-Y. Choi, J.-K. Park, W.-S. Kim, M.-K. Jang, and J.-W.
Nah, “Preparation and Characterization of Deoxycholic Acid- Grafted Hyaluronic Acid as a Durg Carrier,” Polymer Korea, vol. 35, pp. 119-123, 2011.
[8] J. Kim, J. Choi, and D. Lee, “Pyrogenicity of hyaluronic acid hydrogel crosslinked by divinyl sulfone for soft tissue aug- mentation,” Natural Science, vol. 2, pp. 764, 2010.
[9] J.T. Kim and J.H. Choi, “Production and evaluation of hyalu- ronic acid gel for soft tissue augmentation,” Biomaterials Research, vol. 13, pp. 105-108, 2009.
[10] J.-T. Kim, D.-Y. Lee, Y.-H. Kim, I.-K. Lee, and Y.-S. Song,
“Effect of pH on Swelling Property of Hyaluronic Acid Hydrogels for Smart Drug Delivery Systems,” Journal of Sensor Science and Technology, vol. 21, pp. 256-262, 2012.
[11] I.-Y. Kim, S.-J. Seo, H.-S. Moon, M.-K. Yoo, I.-Y. Park, B.-C.
Kim, et al., “Chitosan and its derivatives for tissue engineer- ing applications,” Biotechnology advances, vol. 26, pp. 1-21, 2008.
[12] E. Song, S.Y. Kim, T. Chun, H.-J. Byun, and Y.M. Lee, “Col- lagen scaffolds derived from a marine source and their bio- compatibility,” Biomaterials, vol. 27, pp. 2951-2961, 2006.
[13] O. Jeon, S.J. Song, K.-J. Lee, M.H. Park, S.-H. Lee, S.K.
Hahn, et al., “Mechanical properties and degradation behav- iors of hyaluronic acid hydrogels cross-linked at various cross-linking densities,” Carbohydrate polymers, vol. 70, pp.
251-257, 2007.
[14] A.P. Sclafani and T. Romo III, “Collagen, human collagen, and fat: the search for a three-dimensional soft tissue filler,”
Facial plastic surgery, vol. 17, pp. 079-085, 2001.
[15] K. Kofuji, T. Ito, Y. Murata, and S. KAWASHIMA, “The controlled release of a drug from biodegradable chitosan gel beads,” Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol. 48, pp.
579-581, 2000.
[16] Y.-H. Kim, I.-K. Lee, J.-T. Kim, J.-H. Park, and D.Y. Lee,
“Dependence of Crosslinking Temperature on Swelling Behavior of Hyaluronic Acid Porous Microbeads Synthe- sized by a Modified Spray Method,” Journal of the Korean Ceramic Society, vol. 49, pp. 518-522, 2012.
[17] M. Al-Sibani, A. Al-Harrasi, and R.H. Neubert, “Evaluation of in-vitro degradation rate of hyaluronic acid-based hydro- gel cross-linked with 1, 4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) using RP-HPLC and UV-Vis spectroscopy,” Journal of Drug Delivery Science and Technology, vol. 29, pp. 24-30, 2015.
[18] F. Roig-Roig, C. Solans, J. Esquena, and M.J. García-Celma,
“Preparation, characterization, and release properties of hydrogels based on hyaluronan for pharmaceutical and bio-
medical use,” Journal of Applied Polymer Science, vol. 130, pp. 1377-1382, 2013.
[19] J. Yeom, S.H. Bhang, B.-S. Kim, M.S. Seo, E.J. Hwang, I.H.
Cho, et al., “Effect of cross-linking reagents for hyaluronic acid hydrogel dermal fillers on tissue augmentation and regen- eration,” Bioconjugate chemistry, vol. 21, pp. 240-247, 2010.
[20] G.D. Prestwich, D.M. Marecak, J.F. Marecek, K.P. Vercruysse, and M.R. Ziebell, “Controlled chemical modification of hyaluronic acid: synthesis, applications, and biodegradation of hydrazide derivatives,” Journal of Controlled Release, vol. 53, pp. 93-103, 1998.
[21] S.-N. Park, H.J. Lee, K.H. Lee, and H. Suh, “Biological char- acterization of EDC-crosslinked collagen-hyaluronic acid matrix in dermal tissue restoration,” Biomaterials, vol. 24, pp. 1631-1641, 2003.
[22] M. Lerner, “Hyaluronic acid makers enjoy growth from old and new uses,” Chemical market reporter, vol. 252, pp. 12, 1997.
[23] C. Mao and W.S. Kisaalita, “Characterization of 3-D col- lagen hydrogels for functional cell-based biosensing,” Bio- sensors and Bioelectronics, vol. 19, pp. 1075-1088, 2004.
[24] J.-Y. Kwon and S.-I. Cheong, “Characterization of hyalu- ronic acid membrane cross-linked with lactide,” Polymer Korea, vol. 29, pp. 599-604, 2005.
[25] J.T. Kim, D.Y. Lee, and J.H. Choi, “Preparation and charac- terization of hyaluronic acid microbeads,” Biomater. Res, vol. 14, pp. 157-160, 2010.
[26] S. Zhang, M.A. Greenfield, A. Mata, L.C. Palmer, R. Bitton, J.R. Mantei, et al., “A self-assembly pathway to aligned mon- odomain gels,” Nature materials, vol. 9, pp. 594-601, 2010.
[27] S. Sugiura, T. Oda, Y. Aoyagi, M. Satake, N. Ohkohchi, and M. Nakajima, “Tubular gel fabrication and cell encapsulation in laminar flow stream formed by microfabricated nozzle array,” Lab on a Chip, vol. 8, pp. 1255-1257, 2008.
[28] S.A. Zawko, S. Suri, Q. Truong, and C.E. Schmidt, “Photo- patterned anisotropic swelling of dual-crosslinked hyaluronic acid hydrogels,” Acta Biomaterialia, vol. 5, pp. 14-22, 2009.
[29] W.J. Jeong, J.Y. Kim, J. Choo, E.K. Lee, C.S. Han, D.J.
Beebe, et al., “Continuous fabrication of biocatalyst immo- bilized microparticles using photopolymerization and immis- cible liquids in microfluidic systems,” Langmuir, vol. 21, pp.
3738-3741, 2005.
[30] Y. Jun, M.J. Kim, Y.H. Hwang, E.A. Jeon, A.R. Kang, S.-H.
Lee, et al., “Microfluidics-generated pancreatic islet microfi- bers for enhanced immunoprotection,” Biomaterials, vol. 34, pp. 8122-8130, 2013.
[31] I.-R. Hong and Y.-J. Kim, “Self-Aggregated Nanoparticles of Lipoic Acid Conjugated Hyaluronic Acid,” Polymer Korea, vol. 32, pp. 561-565, 2008.
[32] Y. Xia and G.M. Whitesides, “Soft lithography,” Annual review of materials science, vol. 28, pp. 153-184, 1998.
[33] B. Hafner, “Scanning electron microscopy primer,” Charac- terization Facility, University of Minnesota-Twin Cities, pp.
1-29, 2007.
[34] H.-Y. Lee, S.-H. Jeong, J.-U. Baek, J.-H. Song, and H.-E.
Kim, “Mechanical Improvement of Hyaluronic Acid (HA) Hydrogels and Incorporation of Polyethylene Glycol (PEG).”
Biometaerials, 2015.
[35] 박병규, “조직 공학용 생분해성 고분자 : 총설,” Journal of Biomedical Engineering Research, vol. 36, pp. 251- 263, 2015.
