Synthesis of Phenyl <i>m</i>-coumarylamide Analogs and Their Anti-platelet Aggregation Activity

김민우·백인환

^#

^#

경성대학교 약학대학

Synthesis of Phenyl m-coumarylamide Analogs and Their Anti-platelet Aggregation Activity

Minwoo Kim, In-hwan Beak^#, and Jae-Hwan Kwak^#

College of Pharmacy, BB21 Plus Program, Kyungsung University

(Received November 28, 2018; Revised December 19, 2018; Accepted December 21, 2018)

Abstract Phenyl m-coumarylamide analogs were designed based on phenylpropanoid analogs such as coumaric acid, ferulic acid, and caffeic amide having anti-platelet aggregation activity. They prepared through concise synthetic method.

Their anti-platelet aggregation was confirmed using ADP-induced rat platelet by aggregrometer. Compound 1b and 1d having dimethylamine and methoxy group on para-position of phenylamide ring, respectively, exhibit potent inhibitory activity (92.3 and 89.3% at 80µg/mL). The results suggest that phenyl m-coumrylamide analogs could be used to develop potent anti-platelet aggregation agents.

Keywords platelet, aggregation, ADP-induced, coumarylamide

서 론(Introduction)

선진국에서 주요한 사망의 원인으로 작용하는 심혈관계 질환 은 전세계적으로 전체 사망의 31%에 달하는 연간 1790만 명이 관련 질환으로 사망하지만, 위험요소를 제거함으로써 예방할 수 있는 질환으로 알려져 있다.

위험요소 중, 포유류에서 혈관이 손상이 있을 때 혈소판과 같은 요소는 결집과 안정화에 따라 응 괴를 형성하고 상처의 출혈을 막아주는 반응을 하지만, 심혈관 계 질환에서는 아테롬성 동맥 경화증을 유발하기도 한다. 그 중, 혈소판은 혈관을 좁게 만드는 죽상동맥혈전의 진행과 관상동맥 의 스텐트 시술부위에 혈전을 생성하는 과정에 중요한 역할을 한 다.

혈관에 상처가 날 경우, von Willerbrand factor (vWf)와 콜 라겐과 같은 물질이 방출되고 glycoprotein (GP IIb/IIIa) 수용체

에 결합하여 혈소판을 활성화하며

, ADP (adenosine diphosphate), arachidonic acid, TXA

(thromboxane A

) 등의 저분자 화합물 및 혈소판 활성 인자(platelet-activating factor; PAF)와 같은 세포 내 인자가 혈소판의 활성화를 유도한다.

하지만, 비정상적으로 활 성화된 혈소판은 피브리노겐에 교차 결합을 하여 응집을 일으 키고 심혈관 질환뿐만 아니라 일부 염증 반응의 발생을 활성화

한다.

특히, ADP는 G-protein linked P2Y

과 P2Y

purinergic

receptor 에 결합하여 혈소판 모양을 변화시키고 혈소판을 활성화 하여 응집을 일으킨다.

그리고 혈소판에서 생성된 TXA

는 혈 관을 수축시키며, 혈전 생성을 유도한다.

따라서, 혈소판의 응 집과 관련된 다양한 질병을 억제하기 위하여, 피브리노겐에 교 차 결합을 억제할 수 있는 혈소판 응집 억제제를 임상에서 사 용한다.

일반적으로 혈관 혈전색전증을 예방하는 용도로 사용 되는 혈소판 응집 억제제는 ADP 수용체 길항제

, COX (cycloox- ygenase) 억제제

및 GP IIb/IIIa 수용체 길항제

가 가장 일반 적으로 사용된다.

최근, 식품에 함유한 p-coumaric acid와 ferulic acid 유도체들 은 항산화, 항염증 및 혈소판 응집 억제효과가 보고가 되었고, caffeic acid amide 유도체들은 항산화 효과와 혈소판 응집 억제 효과가 나타나는 것이 확인되었다(Fig. 1).

따라서, 본 연구 에서는 다양한 심혈관계 질환의 예방을 위하여 phenyl m-cou- marylamide 유도체들을 설계 및 합성하고 이들의 혈소판 응집 억제 활성을 측정하고자 한다.

#

Corresponding authors

In-hwan Beak, College of Pharmacy, BB21 Plus Program, Kyung- sung University, Busan 48434, Korea

Tel: +82-51-663-4880, Fax: +82-51-663-4809 E-mail: [email protected]

Jae-Hwan Kwak, College of Pharmacy, BB21 Plus Program, Kyung- sung University, Busan 48434, Korea

Tel: +82-51-663-4889, Fax: +82-51-663-4809

E-mail: [email protected]

실험 방법(Experimental Methods)

시약 및 분석 기기

본 실험에서 사용한 용매 및 언급하지 않은 시약은 별도의 정 제과정을 거치지 않은 시판품을 사용하였으며, 반응에 사용한 무 수 용매 중 THF (tetrahydrofuran)는 sodium과 benzophenone을 이 용하여 증류하여 사용하였고, DCM (dichloromethane)은 calcium hydride 를 이용하여 증류하여 사용하였다. Column chromatography 용 silica gel 60 (230-400 mesh, Merck)를 사용하였고, thin layer chromatography (TLC)는 Kieselgel 60 F254 plate (Merck)를 사용 하였다.

H NMR 및

C NMR 은 JEOL JNM-EX400으로 측정하 였으며, chemical shift는 parts per million (ppm, δ)으로 coupling constant는 Hertz (Hz)로 나타내었다. Low resolution mass spectra (LRMS)는 atmospheric pressure chemical ionization (APCI) 방법 으로 Biotage Dalton 2000을 사용하여 m/z로 나타내었다.

(E)-N-Phenyl-3-(3-hydroxyphenyl)acrylamide 유도체의 일반적 인 합성법(Method B; 1b-1f)

m-Coumaric acid (2; 1.00 equiv.)를 DMF (dimethylforma- mide) 에 녹인 후 triethylamine (TEA; 1.00 equiv.)을 0

C에서 넣 고 교반한 용액에 substituted aniline (1.00 equiv.)과 BOP ((ben- zotriazol-1-yloxy) tris(dimethylamino)phosphonium hexafluoro- phosphate; 1.00 equiv.) 을 녹인 DCM 용액을 적가하여 16-24시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 감압 농축하고 EtOAc와 6N- HCl을 이용하여 불순물을 제거한다. 유기층을 모아 감압 증류 하고 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/hexanes = 1:2~2:1)를 이용하여 최종 화합물 1b-1f를 얻었다.

(E)-N-(4-Chlorophenyl)-3-(3-hydroxyphenyl)acrylamide (Method A; 1a)

m-Coumaric acid (2; 1.00 equiv.)와 thionyl chloride (2.00 equiv.) 를 THF에 녹인 후 환류 및 교반하여 3시간 동안 반응하 고, 감압 농축한다. 농축하고 남은 혼합물을 THF에 녹이고 4- chloroaniline (1.00 equiv.) 과 TEA를 과량 넣고 상온에서 교반하 였다. 2시간 후 감압 증류하고 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/

hexanes = 2:3) 를 이용하여 최종 화합물 1a를 얻었다.

Yield 92%;

H NMR (400 MHz, CD

OD) δ 7.65 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.21 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.99 (m, 1H), 6.81 (m, 1H), 6.69 (d, J = 15.7 Hz, 1H);

C NMR (101 MHz, CD

OD) δ 166.7, 159.1, 143.3, 138.9, 137.4, 131.0, 130.1, 129.8, 122.5, 121.8, 120.5, 118.3, 115.2; LRMS (APCI) m/z [M+H]

274.2

(E)-N-(4-(Dimethylamino)phenyl)-3-(3-hydroxyphenyl) acryla- mide (1b)

Yield 34%;

H NMR (400 MHz, CD

OD) δ 7.51 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.19 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.98 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 6.80 (ddd, J = 8.1, 2.5, 0.8 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 2.89 (s, 6H);

C NMR (101 MHz, CD

OD) δ 166.3, 159.1, 149.6, 142.2, 137.7, 131.0, 130.1, 122.7, 122.3, 120.4, 118.0, 115.2, 114.4, 41.3; LRMS (APCI) m/z [M+H]

283.2

Fig. 1. Structures of anti-platelet drugs

and phenylpropanoid analogs having anti-platelet effects

1H);

C NMR (101 MHz, CD

OD) δ 166.4, 159.1, 155.5, 142.4, 137.6, 131.9, 131.0, 123.1, 122.2, 120.4, 118.0, 116.3, 115.2; LRMS (APCI) m/z [M+H]

256.4

(E)-3-(3-Hydroxyphenyl)-N-(4-methoxyphenyl)acrylamide (1d)

Yield 52%;

H NMR (400 MHz, CD

OD) δ 7.53 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 15.1 Hz, 1H) 7.19 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.98 (m, 1H), 6.88 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.79 (ddd, J = 8.1, 2.4, 0.8 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H);

C NMR (101 MHz, CD

OD) δ 166.5, 159.1, 158.0, 142.6, 137.6, 133.0, 131.0, 122.9, 122.1, 120.4, 118.1, 115.2, 115.0, 55.8; LRMS (APCI) m/z [M+H]

270.2

(E)-N-(4-Ethoxyphenyl)-3-(3-hydroxyphenyl)acrylamide (1e) Yield 37%;

H NMR (400 MHz, CD

OD) δ 7.50 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.49 ( d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.17 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.83 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.77 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 3.96 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.0 Hz, 3H);

C NMR (101 MHz, CD

OD) δ 166.4, 159.1, 157.3, 142.6, 137.6, 132.9, 131.0, 122.9, 122.1, 120.4, 118.1, 115.6, 115.2, 64.7, 15.2;

LRMS (APCI) m/z [M+H]

284.2

(E)-3-(3-Hydroxyphenyl)-N-(4-phenoxyphenyl)acrylamide (1f)

Yield 63%;

H NMR (400 MHz, CD

OD) δ 7.60 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.29 (dd, J = 8.6, 7.4 Hz, 2H), 7.17 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.03 (m, 2H), 6.97 (m, 1H), 6.92 (m, 4H), 6.78 (ddd, J = 8.0, 2.4, 0.8 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 15.6 Hz, 1H);

C NMR (101 MHz, CD

OD) δ 166.6, 159.1, 159.0, 155.0, 142.9, 137.5, 135.6, 131.0, 130.9, 124.2, 122.9, 122.0, 120.5, 120.4, 119.5, 118.2, 115.2; LRMS (APCI) m/z [M+H]

332.4

혈소판 응집 저해능 평가

신규 화합물에 대한 혈소판 응집 저해능 평가는 Chrono-Log 570 VS Platelet Aggregometer를 이용하여 투과도(turbidity)로 측 정하였다. 혈소판 응집 저해능 평가를 위하여 정상 SD 랫드의 복대정맥혈에서 3.8% sodium citrate 처리가 된 주사기(1:9, v/v) 를 이용하여 약 10 mL 채혈하였다. 얻어진 혈액을 1000 rpm 에서 10분 동안 원심 분리한 후 상층액 취하여 혈소판 풍부 혈

록 하였다. 모든 시료를 5분 동안 37

C 에서 교반하였다. 시료 처 리한 PRP에 혈소판 응집을 유도하기 위하여 10 µM ADP를 2.5 µL 가하고 약 5분 동안 결과를 모니터링하였다. 얻어진 각 시 험 물질에 대한 혈소판 응집 저해능은 PPP 시료 (100%)에 대 한 비율로 산출하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

유도체의 합성은 시판품인 m-coumaric acid (2)을 출발 물질로 하여 substituted aniline (3a-f)과의 반응을 통하여 이루어졌다. 화 합물 1a는 SOCl

를 사용하여 acyl chloride를 합성한 뒤, 4-chloroa- niline (3a)과 TEA 염기를 이용하여 92%의 높은 수율로 합성을 할 수 있었다. 화합물 1b-f는 동일한 acyl chloride를 경유한 방 법으로 합성을 시도하였지만, 부반응이 발생하여 원하는 화합물 은 낮은 수율로 얻을 수 있었다. 따라서, 본 연구는 화합물 1b- f를 얻기 위하여 caffeic amide 유도체의 합성에서 보고된 바와 같이 BOP를 이용한 펩타이드 coupling 반응

을 통하여 28~63%

의 수율로 합성할 수 있었다(Scheme 1).

합성된 유도체의 혈소판 응집 억제 활성을 확인하기 위하여 ADP로 응집을 활성화하여 ex vivo 모델로 정상 SD 랫드의 복 대정맥혈을 이용하여 측정하였다(Table 1). 생리활성에 있어서 P2Y

수용체의 가역적 억제제인 ticagrelor를 이용하여 활성의 비교 평가를 하였다. 80 µg/mL에서 합성한 m-coumarylamide 유 도체의 혈소판 응집 억제효과를 본 결과, 15.5~92.3%의 다양한 억제 활성을 나타내었다. 그 중, 화합물 (E)-N-(4-(dimethy- lamino)phenyl)-3-(3-hydroxyphenyl)acrylamide (1b)와 (E)-3-(3- hydroxyphenyl)-N-(4-methoxyphenyl)acrylamide (1d)에서 각각 92.3% 와 89.3%의 높은 혈소판 응집 억제 활성을 보여주었다. 이 는 유사 농도에서 대조 약물인 ticagrelor 보다는 약간 낮은 활 성을 보여주었다.

보고된 phenyl caffeic amide의 유도체의 경우 phenyl 그룹의 치환기에 따라 혈소판 응집 억제 활성의 차이를 보여주었으며, 그 활성은 Br > Cl, F, CO

Et > OH > OMe > CN의 순으로 할로겐 치환기나 에스터의 소수성 치환기가 친수성 치환기보다 좋은 활 성을 보여주었다.

하지만, 합성한 phenyl coumrylamide 유도체 의 구조-활성 상관관계를 위하여 amide의 phenyl 치환기를 살펴 보면, ethoxy와 phenoxy와 같은 큰 치환기보다는 상대적으로 작 은 methoxy나 hydroxyl 구조가 보다 좋은 활성을 나타내었다.

또한, methyl의 치환기가 달린 dimethylamine의 구조도 좋은 활

성을 보여주었다. 그러나 phenyl caffeic amide의 경우와 다르게

상대적으로 높은 활성을 보여준 chloro 치환기에서는 좋은 활성

을 보이지 않았다. 4번 위치의 치환기에 따른 활성 차이를 살펴

보면, NMe

(1b) > OMe (1d) > OH (1c) > Cl (1a), OEt (1e), OPh (1f)의 순으로 활성이 나타남을 확인하였다. Phenyl coumary- lamide 의 경우에도, phenyl caffeic amide의 유도체와 유사하게 친 유성 특징이 활성과 연관됨을 보여주였다. Phenyl caffeic amide 의 좋은 활성을 지니는 할로겐과 에스터 화합물의 CLogP 값은 2.80~3.52 의 범위의 값을 가지는 것을 확인하였다. Phenyl m- coumarylamide에 각각의 치환기가 달린 유도체의 CLogP 값을 살펴보면, 활성에 따라서 각각 1b (ClogP = 3.16), 1d (ClogP = 3.07), 1c (ClogP = 2.33), 1a (ClogP = 3.97), 1e (ClogP = 3.60), 1f (ClogP

= 5.10) 와 같은 값을 보여 주었다. 활성이 좋은 화합물 1b와 1d 의 경우에 치환기 dimethylamine과 methoxy에 의하여 CLogP 값 이 약 3 정도를 나타내는 것을 확인할 수 있었고 CLogP 값이 크지만, ethoxy와 phenoxy와 같이 크기가 큰 치환기는 낮은 활 성을 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 본 연구 결과를 바탕으 로 ADP로 유도된 혈소판 응집 억제 능력을 보이는 화합물 1b 와 1d는 G-protein linked P2Y

과 P2Y

purinergic receptor에 작용하는 약물의 가능성을 보여주었다.

결 론(Conclusion)

본 연구는 ADP로 응집을 활성화한 혈장에서 혈소판 활성을 억제할 수 있는 새로운 m-coumarylamide 유도체를 설계 및 합 성하였다. 기존의 다양한 활성을 보이는 phenylpropanoid 유도체 구조를 바탕으로 caffeic amide 유도체의 혈소판 억제 작용이 있

는 것이 보고가 되었고, 본 연구에서는 phenylpropanoid의 유도 체 중, m-coumarylamide 유도체에 대한 작용을 살펴보았다. m- coumarylamide 유도체 중 4번 위치에 dimethylamine과 methoxy 의 치환기가 있는 (E)-N-(4-(dimethylamino)phenyl)-3-(3-hydrox- yphenyl)acrylamide (1b)와 (E)-3-(3-hydroxy phenyl)-N-(4-methox- yphenyl)acrylamide (1d)에서 높은 혈소판 응집 억제활성을 보였 으며, 이 결과는 심혈관 질환의 예방을 위한 혈소판 응집 억제 제의 개발에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

본 논문은 2018년도 BB21+사업에 의하여 지원되었고 부산과 학기술기획평가원의 지역특화 기술개발확산 개방형연구실 운영 사업의 일환으로 수행된 결과입니다.

References

1. WHO Cardiovascular diseases. Geneva; 2017. Available at: http://

www.who.int/news-room/factsheets/detail/cardiovascular-diseases- (cvds). Accessed 27 November 2018.

2. Gopal, K., Meganathan, M., Vithiavathi, S., Shankar, S., Balamurugan, K. and Deepa Kameswari, P. K.: Rosuvastatin plus fenofibrate in diabetic dyslipidemia: A hospital record based study.

Int. J. Basic Clin. Pharmacol. 7, 2297 (2018).

3. Badimon, L., Padro, T. and Vilahur, G.: Atherosclerosis, platelets and thrombosis in acute ischaemic heart disease. Eur. Heart J.

Acute Cardiovasc. Care. 1, 60 (2012).

4. Lievens, D. and Hundelshausen, P. V.: Platelets in atherosclerosis.

Thromb. Haemost. 106, 827 (2017).

5. Kukula, K., Klopotowski, M., Kunicki, P. K., Jamiolkowski, J., Debski, A., Bekta, P., Polanska-Skrzypczyk, M., Chmielak, Z. and Witkowski, A.: Platelet aggregation and risk of stent thrombosis or bleeding in interventionally treated diabetic patients with acute coronary syndrome. BMC Cardiovasc. Disord. 16, 252 (2016).

6. Song, S., Mody, M., Freedman, J., Ellis, J. and Lazarus, A. H.:

von Willebrand factor (VWF)-dependent human platelet activation:

Porcine VWF utilizes different transmembrane signaling pathways than does thrombin to activate platelets, but both require protein phosphatase function. J. Thromb. Haemost. 1, 337 (2003).

7. Chignard, M., Le Couedic, J. P., Tence, M., Vargaftig, B. B. and Benveniste, J.: The role of platelet-activating factor in platelet aggregation. Nature. 279, 799 (1979).

8. Hosford, D. and Braquet, P.: Platelet-activating factor (PAF).

Encyclopedia of Immunology (Second Edition). 1971 (1998).

9. Esmon, C. T.: The interactions between inflammation and coagulation. Br. J. Haematol. 131, 417 (2005).

10. Wolberg, A. S.: Primed to understand fibrinogen in cardiovascular Scheme 1. Synthesis of phenyl m-coumarylamide analogs (1a-f). Reagents and conditions: Method A: SOCl

, K

CO

, THF; then 3a, TEA, THF, 18 h, 92%, Method B: 3b-f, BOP, TEA, DCM/DMF, 16-24 h, 28-63%

Table I. ADP-induced anti-platelet aggregation activity and CLogP value of phenyl m-coumarylamide analogs

Compound Concentration in

plasma ( µg/mL) Anti-platelet activity

a

(% inhibition)

ClogP value

Ticagrelor 75 98.8 -

15 91.7 -

1a 80 21.9 3.97

1b 80 92.3 3.16

1c 80 37.8 2.33

1d 80 89.3 3.07

1e 80 15.5 3.60

1f 80 16.6 5.10

a

% inhibition values are reported as the mean of four experiments

inflammation. J. Thromb. Haemost. 12, 126 (2014).

13. Floyd, C. N. and Ferro, A.: The platelet fibrinogen receptor: From megakaryocyte to the mortuary. JRSM Cardiovasc. Dis. 1, cvd.

2012.012007 (2012).

14. Wijeyeratne, Y. D. and Heptinstall S.: Anti-platelet therapy: ADP receptor antagonists. Br. J. Clin. Pharmacol. 72, 647 (2011).

15. Warner, T. D., Nylander S. and Whatling C.: Anti-platelet therapy:

Cyclo-oxygenase inhibition and the use of aspirin with particular regard to dual anti-platelet therapy. Br. J. Clin. Pharmacol. 72, 619 (2011).

16. Schneider, D. J.: Anti-platelet therapy: Glycoprotein IIb-IIIa antagonists. Br. J. Clin. Pharmacol. 72, 672 (2011).

ferulic acid derivatives. J. Chem. 1-7 (2015).

19. Hung, C., Tsai, W., Kuo, L. Y. and Kuo, Y.: Evaluation of caffeic acid amide analogues as anti-platelet aggregation and anti- oxidative agents. Bioorg. Med. Chem. 13, 1791 (2005).

20. Shi, Z., Li, N., Shi, Q., Tang, H., Tang, Y., Li, W., Yin, L., Yang, J. and Duan, J.: Design, synthesis and biological evaluation of caffeic acid amides as selective MMP-2 and MMP-9 inhibitors.

Drug Dev. Res. 73, 343 (2012).

21. Se,o E. J., Lee, D., Kwak, J. H., Lee, S., Kim, Y. S. and Jung, Y.:

Antiplatelet effects of cyperus rotundus and its component (+)-

nootkatone. J. Ethnopharmacol. 135, 48 (2011).