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난소 절제에 의해 유발된 골다공증에 대한 간헐적 인공중력 효과 연구
정 기 영 국군의무학교
The Effect of Intermittent Artificial Gravity (IAG) on Osteoporosis Induced by Ovariectomy in Rats - Histomorphometric Analysis by Using 3D Micro-CT -
Ki-Young Chung, M.D., M.S.
The School of Military Medicine, Daejeon, Korea
Background: One of the serious medical growing problems with aging is osteoporosis in human. This study aimed to identify the effect of intermittent artificial gravity (IAG) on osteoporosis induced by ovariectomy in rats. Methods: Eight-week-old female SD (Sprague-Dawley) rats were ovariectomized to induce osteoporosis. Twelve SD rats were randomly assigned to 3 groups (n=4/group): Control with ovariectomy (CON), Ovariectomy and intermittent artificial gravity (IAG) at 2 G for 30 min/day in 5 days every week (OVX＋AG), Group without ovariectomy and IAG (GR). The IAG had been applied to counteract for progression of bone loss. The tibias of rats were scanned by In-vivo Micro-CT at the week 0 (just before ovariectomy) and the week 4 (after ovariectomy). Structural parameters were investigated and analyzed. Results: There were statistically significant differences among 3 groups by ANOVA for bone volume (BV)/trabecular volume (TV), trabecular thickness (Tb. Th), trabecular seperation (Tb. Sp), trabecular number (Tb. N), bone mineral density (BMD) and bone mineral content (BMC) of trabecular bone (P＜0.05). However, there were no significant differences by post test with Dunnet between CON and OVX＋AG. Conclusion:
Application of intermittent artificial gravity (2 G, 30 min, x5/wk for 4 weeks) showed no beneficial effect to prevent osteoporosis induced by ovariectomy in rats.
Key words: Rat, Ovariectomy, Hypergravity, Intermittent artificial gravity, Bone, Centrifugation, Counter- measure, Micro-CT
접수: 2011년 7월 9일, 심사완료일: 2011년 8월 26일 교신저자: 정기영
우 305-878 대전시 유성구 추목동 사서함 78-501호 국군의무학교 Tel: 042-878-4400, Fax: 042-864-1722 E-mail: [email protected]
I. 서 론
인체가 나이를 들면서 발생되는 심각한 문제들 중 하나는 골다공증으로서 골 조직 약화를 유발하여 약한 강도에서도 쉽게 골절될 수 있으며 나이 증가와 함께 정도가 악화되는 질환이다. 이외에도 여성의 경우 폐경과 함께 진행되고, 또 한 장기간 우주 환경에 체류하면 골 손실이 발생하는 것으 로 알려져 있다[1-5]. 최근 평균 수명의 증가로 인해 골다공
증 환자가 급속도로 증가하고 있으며 이를 예방하고 치료하 기 위해 전 세계적으로 사회적인 비용이 늘어나고 있는 실 정이다[6,7]. 이러한 골다공증 문제를 해결하기 위해 운동, 식이 요법, 및 약물 등 다양한 대응책(countermeasures)들을 시 행하고 있지만 아직 해결되지 못하고 있는 실정이다.
뼈는 주기적인 생성과 재흡수를 통해 신체의 항상성을 유 지하는데 뼈의 생성을 촉진하는 요인들은 기계적 부하 (mechanical loading), 호르몬 영향, 식이 영향 및 전기장과 같은 물리적 요인 등이 있으며 뼈의 재흡수를 촉진하는 요인으로 는 부동화(immobilization), 허혈-재관류(ischemia-reperfusion), 호 르몬 영향 및 식이 영향 등이 있다[8]. 골 생성을 촉진하는 요소들 중 기계적 부하요소는 중력에 의한 힘이 기계적인 긴 장(mechanical strain), 압전성(piezoelectricity) 및 골강내액(intrao- sseous fluid) 등으로 인지되어 파골세포 억제 효소(osteoclasto- genesis inhibitory factor)로 알려진 cytokine osteoprotegerin을 분비
Fig. 1. Animal centrifuge for artificial gravity.
하여 골 생성을 유발하게 한다[8]. 최근 기계적 자극의 일종 인 진동을 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다.
이론적으로 골밀도의 감소는 골격계에 부하(loading)에 의 하여 예방이 된다. 뼈의 부하는 체중 부하와 같은 외부적인 요인과 골 근육들에 의한 내부적인 요인에 의하여 발생된 다. 따라서 short-arm centrifuge와 같은 중력을 이용하여 외부 부하와 근육의 운동을 적용함으로서 골 손실을 예방할 수 있다고 본다[9]. 인공 중력(artificial gravity)에 대한 연구들로 서 Morita 등은 지상에서 쥐의 뼈모세포를 가속도에 노출시 켜 osteocalcin 발현이 적절한 정도의 가속도에 의하여 증가 된다고 보고 하였으며, Fizgerald와 Hughes-Fulford는 생쥐 (mouse)의 조골세포를 지상에서 모의 우주 환경에 노출 후 최대 2.94 G, 515초 동안 가속도를 부과하여 골격계의 생성 과 유지에 영향을 주는 8개 유전자(gene)중 c-fos mRNA가 원 심분리 후 30분에서 대조군과 비교하여 89% 의미 있는 증 가된다고 보고하였다[10,11]. Zhang 등은 쥐를 대상으로 4주 간 하지 현수 후, 인공중력 1 Gx, 1.5 Gx, 및 2.6 Gx를 부과하 여 대퇴골의 손실 예방에 대한 연구를 하였다[12]. 대퇴골 의 물리적 및 기계적 지표들(physical and mechanical para- meters)에서 유의한 효과가 있었으나 2.6 Gx에서 1 G, 1.5 G 와 비교하여 추가 예방 효과는 없다고 보고하였다. 또한 인 공중력과 운동을 병행한 연구로서 Iwase 등은 고 중력 부하 (high-G load)와 저강도 에르고미터 운동(low intensity ergome- tric exercise) 하면 혈중 골다공증 표지의(osteoporotic marker) 증가가 억제 된다는 결과를 보고하였다[13,14].
이와 같이 인공 중력이 골 손실을 예방한다는 다수의 연 구를 토대로 본 연구는 현재 의학계에서 많은 연구가 되고 있는 골다공증 예방을 위한 인공중력 효과를 평가하기 위 해 시행 되었다.
II. 재료 및 방법 1. 실험대상
본 실험에서는 생후 8주령의 암컷 흰쥐(Sprague-Dawley, 100∼120 g)를 사용하였다. 실험동물은 SPF(무병) 실험동물 생산업체인 (주)대한 바이오링크(충북 음성)의 흰쥐를 사용 하였으며, 실험에 사용되기 전에 1주일간의 실험 환경 적응 기간을 두었다. 실험동물은 흰쥐 12마리를 대상으로 하였 으며 난소 절제술을 통하여 골다공증을 유도하였다. 실험 실의 온도는 24.5∼25.5oC, 실험실의 습도는 55±5%를 유지 하였고, 12시간 낮, 12시간 밤 주기를 실험기간 내내 유지하 여 실험환경을 안정화 하였으며 사육기간 동안 먹이와 수 분의 섭취는 제한하지 않았다.
2. 실험군 분류
실험동물은 난소절제 및 인공 중력 부하에 따라 아래와 같이 3개 군으로 분류하였고 각 군은 4마리씩 구성되었다.
1. 대조군(CON); 난소 절제술을 시행한 군.
2. 실험군(OVX＋AG); 난소 절제술을 시행 후 인공중력을 적용한 군.
3. 실험군(GR); 난소 절제술 및 인공 중력 없이 성장된 군.
인공중력: 성장쥐에게 부과되는 인공중력은 한국 공군 항공 우주의료원에서 직접 제작된 장비(ASMC, ROKAF)로서 반경 은 2 m이고 말단부에는 케이지(cage)가 (34×35×30 cm) 달려 있다(Fig. 1). 인공중력은 -Gx 방향으로(실험쥐 등에서 복부 방향) 실험쥐의 골격계에 직접 중력이 부과되는 방향으로 설정되었다. 인공 중력을 부과하기 위해 실험쥐들은 이동 하여 각각의 공간에서 중력이 부과 되었다(주 5일, 하루 30 분씩 2 G, 4주간). 인공중력 부하 동안 음식과 수분에 대한 공급은 제한하였다.
3-Dimensional Micro-CT: 인공중력의 효과를 평가하기 위하 여 성장쥐 경골을 난소 절제술 전 및 인공중력 부과가 종료 된 시점에 in-vivo micro-CT (Skyscan-1076, Skyscan, Belgium) 장 비를 이용하여 측정되었다. 실험 전 micro-CT를 측정하기 위 해 성장쥐들은 복강내 ketamine 50 mg/kg (휴온스, 한국)와 xylazine 6 mg/kg (바이엘, 한국)을 투입하였으며 실험 후에는 Ether 흡입 마취 후 경골을 적출하였고 분석할 때 까지 생리 식염수 거즈(saline gauze)에 싸서 −20oC에 보관하였다. 3차원 구조 변수들은 micro-CT로부터 만들어진 영상들을 계산하여 구했다. Volume of interest (VOI, 연구 분석에 선택된 경골 부 위)는 환골단(anular epiphyses) 부위 아래 1.4 mm에 위치한 4.9 mm 길이의 해면골과 피질골이 선택되었다. 3차원 분석을 하여 골 용적계수(BV/TV, Bone Volume Fraction, %)이 계산되 었으며 해면골 두께(Tb. Th., Trabecular Thickness, μm), 해면 골 분리(Tb. Sp, Trabecular Seperation, μm), 해면골 구멍(Tb.
Table 1. Structural parameters of trabecular bone (N=12)
BV/TV (%)* Tb.Th (μm)* Tb.Sp (μm)* Tb.N* SMI*
Week 0 Week 4 Week 0 Week 4 Week 0 Week 4 Week 0 Week 4 Week 0 Week 4
CON (4) 15.497 11.489 0.088 0.099 0.274 0.603 1.739 1.155 2.204 2.289
±3.693 ±0.730 ±0.005 ±0.004 ±0.034 ±0.141 ±0.332 ±0.056 ±0.152 ±0.101
AG (4) 14.345 7.106 0.092 0.095 0.328 0.747 1.566 0.746 2.254 2.254
±3.025 ±1.744 ±0.001 ±0.010 ±0.081 ±0.123 ±0.329 ±0.150 ±0.112 ±0.031
GR (4) 6.29 13.380 0.081 0.099 0.473 0.447 0.734 1.355 2.690 2.229
±2.890 ±2.847 ±0.003 ±0.003 ±0.180 ±0.180 ±0.330 ±0.290 ±0.123 ±0.038
Values are Means±SD.
Abbreviations: CON: Ground Control Group (n=4), HU: Hindlimb Unloading Group (n=4).
*Statistically significant by ANOVA among 3 groups within P＜0.05.
Fig. 2. An example of changes for 3D structure among groups at 0 week (left) and 4 week (right).
Pf, Trabecular Perforation, μm), 해면골 수(Tb. N., Trabecular Number, 1/mm), 골밀도(BMD, Bone Mineral Density, g/cm2), 및 골 미네랄 함유량(BMC, Bone Mineral Content, g/cm)들은 직 접 삼차원 모델에서 측정되었다. 해면골내 막대(rods)와 판 (plates)들의 상대적인 분포는 구조적 표준 지표(SMI, Struc- tural Model Index) 사용하여 측정될 수 있다. 여기서 SMI 값 을 설명하면 0은 가장 이상적인 골소주 형태로서 판구조 모 양(plate-like shape)이며 3은 막대구조 모양(rod-like shape)를 의미한다[15]. 피질골에서는 피질골 두께(Cs. Th., Cross Sec- tion Thickness, μm), 골밀도 및 골 미네랄 함유량 변수들이 측정되었다.
3. 통계 분석
모든 data들은 means±SD으로 기술 되었다. 인공중력의 효
과를 분석하기 위하여 통계는 analysis of variance (ANOVA)를 사용하였으며 각 집단 간의 구조적 지표들(structural para- meters)의 평균치들을 비교하기 위하여 Duncan's Multiple Range Test를 적용하였으며 통계적 유의수준은 P＜0.05로 하였다.
III. 결 과
실험군 경골의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 in-vivo micro-CT로 측정되었으며, 얻어진 영상들을 바탕으로 구조 적인 지표들이 계산되었다. 동일한 실험쥐에서 3차원 구조 에 대한 4주간의 변화의 예를 Fig. 2에서 보여주고 있다.
1. 경골 해면골(Tibia trabecular bone)
Micro-CT 영상 분석에서 구조적 지표들에 대한 실험 전, 후 결과는 Table 1에서 보여주고 있으며 BV/TV, Tb. Th, Tb.
Sp, Tb. N, BMD 및 SMI 변수들에서 3 실험군들 간의 통계학 적 의미 있는 결과를 보였다(Fig. 3, 4) (P＜0.05).
그러나 ANOVA 통계 사후 분석 결과 구조적 지표 변수에 대한 난소 절제술을 시행한 대조군(CON)과 난소 절제술을 시행 후 인공중력을 적용한 군 (OVX＋AG)간의 통계학적 유의한 결과를 보이지 않았다.
난소 절제술 및 인공 중력 없이 성장된 군(GR)과 대조군 (CON), 및 OVX＋AG군 각각에 대한 구조적 지표들에 대한 사후 분석 결과 통계학적으로 의미 있는 결과를 보였다.
2. 경골 피질골(Tibia cortical bone)
피질골의 Cs. Th., BMD, 및 BMC 변수들은 3 실험군들 간 의 통계학적 유의한 차이를 보였으나(Fig. 5∼7) (P＜0.05) 대
Fig. 3. Relative value for structural parameters of trabecular bone normalized to the values for the week 0. *Significant difference among 3 groups.
Fig. 5. Relative change (0∼4 wks) of mean values for Cs. Th.
*Significant difference among 3 groups.
Fig. 6. Relative change (0∼4 wks) of mean values for BMD of cortical bone. *Significant difference among 3 groups.
Fig. 7. Relative change (0∼4 wks) of mean values for BMC of cortical bone. *Significant difference among 3 groups.
Fig. 4. Relative change (0∼4 wks) of mean values for BMD of trabecular bone. *Significant difference among 3 groups.
조군(CON)과 인공 중력을 부과한 두 군(OVX＋AG)을 비교 하였을 때 골다공증을 예방하는 소견은 보이지 않았다.
IV. 고 찰
골다공증은 고령 생존률의 증가에 따라 이환률이 증가되 고 여성의 경우 폐경 후 여성 호르몬의 감소에 의해 더욱 악화되는 질환이다. 또한 우주 환경 노출은 중력의 소실로 인해 장골의 경우 매달 1∼2%의 골 손실이 나타나고, 이러 한 골 손실은 우주 비행 기간 동안 계속되며 장기간 우주 비행 시 특히 문제가 된다[9]. 중력은 체중부하가 있는 뼈에 기계적 부하를 유발하게 하며 이는 골 형성에 직접적인 영 향을 주며 장기간 정상 골격을 유지하는데 기본이다. 기계 적 하중 제거의 영향은 골형성률, 골밀도, 골성장, 골강도 및 골아세포의 감소를 유발한다[16-21].
본 연구는 난소 절제술을 통해 골다공증을 유발 하고, 골 손실을 예방하기 위해 사용되는 기계적 부하의 일종인 인 공 중력이 골 손실에 어떠한 예방 효과가 있는지를 알아보
기 위해 실시되었다. 주 5일, 매일 2 G, 30분 인공중력을 부 여한 실험군의 해면골과 피질골의 구조적 지표들은 난소 절제술을 한 실험군과 비교하여 의미있는 예방 효과는 없 었다. 기계적 부하는 골 생성을 촉진하는 효과에 대해 이미 알려져 있으며 인공 중력은 기계적 부하의 일종으로 당연 히 골 다공증 예방 효과가 있으리라 기대하였다[22-24]. 그 러나 본 연구에서는 전혀 예방 효과 없었는데 이러한 결과 에 대한 설명으로 인공중력 부과 시간과 강도가 미흡하게 적용되었을 가능성이 있다.
정 등은 우주 모의 환경인 하지 현수 모델을 이용하여 골 다공증을 유발한 후 인공중력을 적용하여 예방 효과를 실 험한 연구에서 주 5일, 매일 3 Gx 1시간 부여한 실험군에서 대조군과 비교하여 의미있는 골 손실 예방효과를 보인 결 과를 보고하였다[25]. Zhang 등은 쥐를 대상으로 4주간 하 지 현수 후, 인공중력 1 Gx, 1.5 G, 및 2.6 G를 매일, 하루 1시간 부과하여 대퇴골의 골 손실 예방에 대한 연구를 하였 다[12]. 인공중력이 대퇴골의 물리적 및 기계적 지표들 (physical and mechanical parameters)에서 효과가 있었으나 2.6 Gx의 인공 중력을 주는 경우 상대적으로 1 Gx, 1.5 Gx와 비 교하여 추가 효과가 없다고 보고하였다. 기계적 하중의 일 종인 진동에 대한 연구 결과들이 있다. 여러 연구 결과에서 low magnitude high frequency 기계적 하중은 골다공증을 치료 하고 골 손실을 예방하는데 효과가 있다는 보고들이 있다 [26-29]. 이 연구들에서 적용된 진동을 중력으로 환산하면 0.1∼0.4 G의 낮은 중력에서 골 손실 예방효과가 있다는 것 이다. 그러면 가장 최적의 인공중력 부하량은 무엇인가? 본 연구에서 적용한 인공중력의 강도는 2 Gx이며 부과 시간도 1회 30분으로 위의 연구들과 비교하여 다소 미흡한 것으로 판단되며 향후 인공중력 부과 시간의 확대 및 부하강도를 증가 한다면 골 손실을 예방할 수 있는 결과가 나오리라 추측된다. 또한 진동과 같은 미세 중력(0.1∼0.4 G)에서의 골 손실 효과가 있다는 많은 연구 결과들을 고려해 보면 장기간의 지속적인 중력을 부과 하는 것도 중요하지만 단 기간에는 다양한 인공중력 강도를 교차 부과하는 것이 더 효율적일 수 있으리라 유추 할 수 있겠다. 따라서 향후 연구 에서는 이러한 선행 연구 결과를 기초로 하여 인공중력의 강도와 부과 시간을 증가한 추가 연구는 물론 단 기간 내에 인공 중력의 교차 적용이 골 손실 예방 효과가 있는지에 대한 추가 연구가 필요하다.
금번 연구를 통해 관찰된 내용으로서 인공 중력을 부과 하는 동안 실험 개체의 활동성이 다양하게 나타났다. 즉, 동 일한 중력을 부과하는 동안 일부 실험쥐는 일부 활동을 보 였으나 일부는 전혀 자세의 변화가 없었다. 이러한 개체간 의 차이는 인공중력 효과에 영향을 주게 될 것 이라 판단된 다. 향후 연구에서는 인공 중력 부과와 실험쥐의 활동을 정 량적으로 분류하여 골 손실 효과를 평가하는 연구를 고려
할 수 있겠다.
본연구의 제한 사항으로서 실험 집단군의 개체수가 적은 점을 들 수 있다. 그러나 본 연구는 실험 방법이 여러 단계 를 거쳐야 하는 실험 운영상의 어려움이 있다. 향후 더 많은 개체 수에 대한 실험이 진행되어 연구 결과가 축적된다면 매우 의미 있는 연구결과가 보일 수 있으리라 판단된다.
V. 결 론
본 연구는 8주령의 성장쥐(SD rat) 12마리를 난소 절제술 을 시행한 대조군(n=4), 난소 절제술을 시행 후 인공중력을 적용한 실험군(n=4), 난소 절제술 및 인공 중력 없이 성장 된 실험군(n=4)으로 나누어 난소 절제술에 의해 유발된 골 손실이 인공중력에 의해 얼마나 예방되는가를 3-D micro- CT를 이용한 골의 형태학적 분석을 하여 다음과 같은 결론 을 얻었다.
1. 경골 해면골의 Micro-CT 영상 분석에서 구조적 지표들 에 대한 실험 전, 후 결과는 Table 1에서 보여주고 있으며 BV/TV, Tb. Th, Tb. Sp, Tb. N, BMD, 및 SMI 변수들에서 3 실험군들 간 통계학적 의미 있는 결과를 보였다.
2. ANOVA 통계 사후 분석 결과 구조적 지표 변수에 대한 난소 절제술을 시행한 대조군(CON)과 난소 절제술을 시행 후 인공중력을 적용한 군 (OVX＋AG)간의 통계학적 유의한 결과를 보이지 않았다.
3. 피질 골의 Cs. Th. 와 BMD 변수들은 3 실험군들 간의 통계학적 유의한 차이를 보였으나 대조군(CON)과 인공 중 력을 부과한(OVX＋AG) 두 군을 비교 하였을 때 골다공증 을 예방하는 소견은 보이지 않았다.
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![Fig. 1. Animal centrifuge for artificial gravity.하여 골 생성을 유발하게 한다[8]. 최근 기계적 자극의 일종인 진동을 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다](https://thumb-ap.123doks.com/thumbv2/123dokinfo/4926462.295234/2.892.466.811.844.1075/centrifuge-artificial-생성을-유발하게-기계적-자극의-일종인-진행되고.webp)
