실험생화학/12주 2차시/영남대학교 정태완 교수
Chapter 6 Radioisopes in Biochemical Research
방사능 동위원소들이 붕괴할 때 나오는 방사선의 탐지 및 측정기술은 민감도가 매우 높아 (picomole 수준까지 탐지가능) 이들 원소들을 특정 분자에 표지 (label) 시킨후 다양한 실험에서 물질들의 정량분석이나 혹은 탐지용으로 사용한다. 그러나 최근에는 인체및 환경에의 위험성을 감안하여 가능하면 형광으로 표지시켜 동일한 목적의 연구 들을 행하는 빈도가 늘어나고있다.
A. Origin and Properties of Radioactivity
Introduction
방사능(성)동위원소 (radioisotope, radioactive isotope)들은 원자핵내의 양성자와 중성 자간의 비율이 안정적으로 이루어져있지 않아서 불안정하므로 α particle이나 β particle 혹은 γ ray 등의 방사선 (radiation)을 방출하면서 핵이 스스로 붕괴하여 안정 한 다른 원소로 바뀌게된다. 이때 방출되는 방사선의 종류나 양을 다양한 방법으로 탐 지함으로써 방사능이 붙은 물질의 정량, 혹은 위치 추적이 가능한것이다. 일반적으로 생화학분야의 실험에 사용되는 방사능 동위원소들은 주로 β 나 γ선을 방출하는것들이 다. 3H, 14C, 32P, 35S 등은 모두 β emitter들이고 125I 는 γ emitter이다. 그런데 각기 다 른 β emitter들에서 방출되는 β particle들의 에너지 레벨이 각기 다르다-Fig. 6.1. 따 라서 하나의 시료에 두종류의 서로 다른 β emitter들을 (예를들면 한분자에 3H, 14C 두 방사능으로) 표지한후 각각의 표지된 부분을 동시에 추적하는것이 가능하여 이중 표지실험 (dual labeling, double labeling)을 가능하게한다. 방사능동위원소가 붕괴하 여 방사능이 절반으로 감소하는데까지 걸리는 시간을 반감기 (t1/2)라한다.
Isotopes in biochemistry-Table 6.1
생화학 실험에 자주 이용되는 방사성동위원소는 위에서 말한 5가지 정도. 실험실에서 는 아니지만 의료 진단용으로 이용되는 양전자 단층촬영기(PET) 촬영시 18F 등의 동위 원소들도 이용된다.
Units of radioactivity
방사성물질이 지니고있는 방사능의 정도를 나타내는 단위에는 여러 가지가 있다. 이 중에서 생화학 실험실에서 사용하는 단위는 대부분의 경우 큐리 (curie, Ci) 단위이다.
mCi, μCi 등도 함께 사용한다. 1 큐리는 1초에 3.7 x 1010 번 붕괴하는 정도의 방사능 양을 나타낸다. ( 1 Ci = 3.7 x 1010 dps = 2.2 x 1012 dpm). 즉 1 μCi = 2.2 x 106 dpm인 셈이다. 이외에도 베크렐(becqerel, 1Ci=3.7 x 1010 bq), 그레이(Gy), 라드, 렘, 시버트(Sv)등의 단위들이 사용되는데 이중에서 시버트 단위는 방사선의 생물학적 손상 정도를 감안한 방사능을 나타낸다. 예를들어 1 시버트란 100 큐리의 방사능으로부터 1 m 떨어진 거리에서 1시간동안 받은 방사능의 영향을 나타낸다. specific radioactivity (비방사능 활성도)란 방사능원소가 포함된 분자의 단위 mass당의 방사능 을 의미하며 mCi/mmole 등으로 나타낸다. 방사능 탐지기의 효율은 %
efficiency=observed cpm of standard/dpm of standard x100 으로 나타난다.
B. Detection and Measurement of Radioactivity
베타입자들의 방사능은 주로 두가지 측정방법으로 방사능을 측정: Liquid scintillation counting과 Geiger-Muller counting 방법이다.
Liquid scintillation counting
scintillation cocktail (solvent + PPO + POPOP)이 들어있는 vial에 시료를 넣고 이 vial을 scintillation counter에 넣고 측정. 방사성 시료에서 방출된 베타입자가 용매를 여기시키고 여기된 용매가 primay fluor (F1)인 PPO를 여기시키고 다시 secondary fluor(F2)인 POPOP를 여기시킨다. 여기된 F2가 기저상태로 떨어지면서 번쩍이는 섬광 (형광)을 방출하는데 이 빛을 Photo multiplier tube(PMT)가 탐지, 증폭하고 전기신호 로 바꾸어 나타낸다.
Thermal noise in PMT tubes
이때 noise에 의한 오류를 줄이기위해 샘플 바이알 양쪽에 두 개의 PMT tube가 위치 하여 동시에 탐지했다는 전기신호가 coincidence gate에 도착해야 하나의 붕괴로 기 록한다.
Counting more than one isotope in a sample
전기신호의 크기를 분류하여 큰에너지의 베타입자들에서 발생한 신호와 낮은 신호들 을 두 개의 다른 channel에 각각 따로 붕괴횟수를 기록하기 위하여 pulse height analyzer와 discriminator, scaler등이 장착되어있다. 그리고 각각의 채널에 기록된 붕괴 횟수를 기록으로 보여주는 프린트가 붙어있다.
Quenching
방사능시료들은 여러 원인들에 의해서 실제 지니고있는 방사능보다 낮게 측정되는데 (측정기계의 효율성이 아닌 원인들) 이때 quenching이 일어났다고 말하고 그 원인에 는
1. color quenching: 발생하는 형광빛을 흡수하는 다른성분이 칵테일에 들어있는 경우 2. chemical quenching: 시료 용액중에 여기된 용매분자나 fluor분자들과 화학반응을
하는 성분이 포함된 경우
3. point quenching: 시료가 충분히 용매에 녹지 않은 경우
4. dilution quenching: scintillation cocktail에 너무 많은 부피의 시료용액이 첨가된 경우 등이 있다.
이러한 quenching을 보정하는 방법에는 시료용액내에 기지의 표준 방사능을 섞어서 측정하는 internal standard ratio방법과 기계에 아예 표준물질을 영구적으로 장착시켜 놓은 external standard ratio method의 두가지 방법이 있는데 요즘은 주로 후자의 방 법이 이용된다.
Scintillation cocktails and sample preparation
시료가 수용액일경우에는 주로 dioxane을, 유기용액일 경우엔 toluene이나 xylene을 scintillation solvent로 사용.
Geiger Muller counting
실린더 chamber속에는 argon이나 helium혹은 neon gas와 같은 gas가 가득 들어있고 앞쪽 표면은 운모유리로 되어있다. 시료에서 방출된 베타입자들이 유리를 통하여 chamber안으로 들어와 gas분자와 충돌하면 gas분자들이 이온화되면서 gas분자의 양 이온들과 전자들이 발생한다. chamber내에는 양극과 음극이 배치되어 있으므로 이온 들이 이들 전극쪽으로 움직이면서 전류가 발생하고 그 전류의 세기는 결국 방출된 베 타입자들의 양에 달려있으므로 방사능이 측정된다. 이 counter는 크기가 작고 휴대할 수있어서 가지고다니면서 사용이 가능하다(휴대용 portable). 그리고 방사능의 세기에 따라 소리도 들리게되어있어 빠르게 넓은 지역의 방사능의 정도를 스캔할수있다. 그러 나 liquid scintillation counting 만큼 정확히는 측정할수없다.
Scintillation counting of γ rays
γ 선에 의한 방사능도 베타의 경우와 거의 같은 구조와 원리의 기계 (γ counter)로 측정한다. 다만 이때는 fluor로 NaI crystal을 사용한다.
Applications of radioisotopes
물질들의 정량, 물질들의 정성적인 확인 혹은 위치확인 (구체적인 예로는 생화학대사 경로의 탐구, 효소반응의 반응기작 연구, DNA 염기서열 결정반응, Southern, Northern, Western blotting에서의 탐침(조사관, probe) 등 수없이 많음)등을 위해서 표지자 역할 (labeling agent)로 사용됨. 한가지 특이한 방사능을 이용한 연구 방법으 로 autoradiography라는것이 있는데 이방법에서는 방사능을 띤 물질을 화학반응이나 과정에 투입한후 반응이나 과정후에 그 물질이 어떤 분자속에 혹은 위치에 있는지를 x-ray 필름상의 사진으로 판별한다. 이와같은 다양한 실험실에서의 이용뿐만 아니라 방사성 동위원소들은 질병(암)의 진단이나 치료등에도 이용되고(진단방사선, 치료방사 선), 식품등에서 살균, 살충제로도 이용되며 돌연변이능을 이용하여 식물품종개량에도 이용된다. 또한 금속내부를 검사하는 비파괴검사, 생물들의 이동경로나 분포조사등에 도 이용.
C. Safety rules for handling radioactive materials
방사능물질에서 방출된 방사선들은 대부분 세포의 분자들을 이온화(전리)시킴으로서 결합본드들을 끊어버린다. 예를들면 DNA와 같은 분자에 작용하여 변이를 유발하여 결국 세포를 죽게만들고 조직을 죽게만든다. 따라서 취급하는 동안에는 반드시 일회용 장갑을 2중으로 끼고 사용후 용액이나 쓰레기를 버릴때도 반드시 방사능 쓰리기용에 분리 배출하여야한다. 뿐만아니라 방사능 물질을 구매한후 완전히 폐기할때까지 사용 및 폐기일지를 작성하여야한다. 실험후 반드시 자기의 몸과 실험장소 주위에 Geiger-Muller counter로 오염의 유무를 확인하여야한다. 피펫을 입으로 흡입하지 말 아야하고 바닥에 흘렸을때는 방사능세척용 세제로 충분히 세척하고 check하여야한다.
