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Methylation Patterns of Tumor Suppressor Genes in Breast DCIS Tumors

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Academic year: 2021

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유방암의 발생과 진행에 있어서 여러 연구가 진행되어 왔으며, 유전자 증폭, 유전자 소실, 점 돌연변이 등의 기존 의 유전자연구에 대별되는 개념으로서 Epigenetic의 기전들 이 최근 제시되고 있다.(1) Epigenetic 정보란 세포 분열 시 에 유전되는 세포의 정보로서 DNA의 염기서열이 아닌 것 을 말하며, 암 발생에 관여하는 epigenetic 기전에는 DNA 메 틸화, 유전자 각인, histone 변형이 있으며, 이 중에서 DNA 의 메틸화가 중요한 기전으로 생각된다. 암 발생과 연관된 유전자의 메틸화는 주로 CpG의 염기반복구역인 CpG island 에서 일어나며 유전자의 기시부(promoter)에 있는 CpG island에서 메틸화가 일어나면 유전자의 발현이 억제되게 된다.(2) 억제의 기전으로는 메틸화된 DNA에 특정한 단백 질이 결합하게 되면 chromatin구조에 변형이 오게 되며 또 한 메틸화된 CpG island에 전사인자의 친화도가 감소하게 된다.(3) 이런 메틸화가 종양억제유전자 기시부의 CpG

유방의 상피내암에서 종양억제유전자의 메틸화의 양상

가톨릭대학교 의과대학 의정부성모병원 외과학교실

조항주·안창혁·김지일·김기환·배자성·박우찬·송병주·정상설·김정수

Methylation Patterns of Tumor Suppressor Genes in Breast DCIS Tumors

Hang Joo Cho, M.D., Chang Hyeok Ahn, M.D., Ji Il Kim, M.D., Kee Hwan Kim, M.D., Ja Seong Bae, M.D., Woo Chan Park, M.D., Byung Ju Song, M.D., Sang Seol Jung, M.D. and Jeong Soo Kim, M.D.

Purpose: The methylation of tumor suppressor genes has been implicated in the development of breast cancer.

However, the role of methylation in the progression of cancer is still unclear. In this study, the methylation stati of nine tumor suppressor genes (p14, p16, DAPK, E-cadherin, RASSF1α, TWIST, RARβ, HIN-1, cyclin D2) in normal, benign, DCIS and invasive cancer tissues were examined, and the methylation patterns in DCIS and hypermethylated genes investigated to see if a change in the methylation status would lead to the development of cancer and progression to an invasive tumor.

Methods: A total of 96 patients, who underwent surgery between March 2003 and March 2005, were retrospectively studied. DNA was extracted from tumor tissues, and the samples examined for aberrant hypermethylation using methylation-specific PCR (MSP).

Results: The total number of methylated genes in each tissue type (normal tissues; 2.97±1.74, benign tumors; 4.36

±1.42, DCIS; 5.73±1.35, invasive cancers; 5.42±2.05) increased with tumor progression (P<0.001). In benign tumors, HIN-1 (83%) was the most frequently methylated gene, but in DCIS, p14 (100%), RASSF (100%) and TWIST (91%) were frequently methylated. In invasive cancer, RAR β (60%) and p16 (37%) were frequently methylated compared to the other tissue types. In a multivariate study, TWIST was commonly hypermethylated in DCIS and invasive cancer; whereas, RARβ and p14 were frequently independently hypermethylated in invasive cancers.

Conclusion: Methylation induced gene silencing appears to affect multiple genes in breast tissues, which increases with cancer progression. TWIST was hypermethylated in both DCIS and invasive cancers; therefore, it was concluded that methylation of the TWIST promoter may be an early event in the development of breast cancer. The hypermethylations of RARβ and p16 are useful marker for the progression of a DCIS lesion to invasive cancer. The methylation patterns of tumor suppressor genes in DCIS were similar to those found in invasive cancer, but also showed intermediate levels of methylation between benign tumors and invasive cancers. (J Korean Surg Soc 2007;72:460-466)

Key Words: Breast cancer, Methylation, DCIS, Invasive cancer, Tumor progression

중심 단어: 유방암, 메틸화, 상피내암, 침윤성암, 암 진행

Department of Surgery, Uijeongbu St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Uijeongbu, Korea

책임저자:김정수, 경기도 의정부시 금오동 65 ꂕ 480-130, 의정부성모병원 외과 Tel: 031-820-3048, Fax: 031-847-2717 E-mail: drbreast@cmc.cuk.ac.kr

접수일:2006년 8월 2일, 게재승인일:2007년 5월 16일

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island에서 일어나면 유전자의 기능이 소실되어 암발생과 진행에 관여하게 되며, 유방암과 다른 암종에서도 종양억 제유전자가 정상세포에 비하여 과메틸화되어 있다고 보고 되고 있다.(4-7)

유방암에서 과메틸화가 일어나는 유전자의 예로는 종양 억제유전자인 p16, p15, p14, p73, APC, BRCA1과 DNA 복구 유전자인 hMLH1, GSTP1, MGMT가 있으며, 수용체인 retinoic acid beta 2 (RARβ) receptor, Estrogen receptor (ER), 세포 흡착에 관여하는 E-cadherin, protease inhibitor인 TIMP-3, 종양유전자를 억제하고 p53과 연관된 세포사에 관여하는 TWIST, 세포신호매개체인 RASSF1α 등이 있다.(1,2) 이러 한 유전자에 대한 메틸화는 비교적 초기의 유방암이나 진 행초기에 일어나는 것으로 알려져 있기 떄문에 환자의 혈 청이나 유관세척액을 이용하여 유방암의 초기 발견에 이용 할 수 있다.(8-10) 또한 대장암에서는 이러한 유전자의 과메 틸화가 임상병리학적 특징들과 밀접하게 관련되어 있다는 보고도 있다.(11) 그러나 정상조직과 유방암과의 메틸화의 특성에 대해서는 보고가 있지만 양성종양과 상피내암종에 서의 메틸화의 특성에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.

이에 저자들은 종양억제인자로 알려진 p14, p16, Cyclin D2, TWIST, E-cadherin, RASSF1α, Death associated protein kinase (DAPK), High-in-normal 1 (HIN-1), RARβ의 9가지 유 전자에 대해서 메틸화 특이적 PCR기법을 이용하여 정상조 직, 양성종양, 상피내암종, 악성종양에서의 각 유전자의 메 틸화의 정도의 차이를 알아보고 또한 메틸화된 유전자의 개수를 비교하여 각 조직별 유전자의 메틸화 특성과 유방 암의 진행에 있어서 양성종양 및 상피내암종의 메틸화의 특성을 알아보고자 하였다(Table 1).

1) 대상

가톨릭대학교 의과대학 의정부성모병원에서 2003년 3월 부터 2005년 3월까지 시행된 수술을 통해서 모두 96명의 환

자로부터 유방조직을 얻었다(정상조직 96예, 양성 종양 29 예, 상피내암 11예, 침윤성암 67예).

2) DNA extraction and methylation-specific PCR (MSP)

파라핀포매조직에서 추출한 DNA를 bisulfite 변형한 후에 MS-PCR을 시행하였다. 종양조직과 정상조직에서 추출한 1∼2 ug의 genomic DNA를 2 mol/L의 NaOH를 첨가하여 37oC에서 15분간 denaturation시킨 후에 3 mol/L의 sodium bisulfite solution과 9 ug의 hydroquinone을 섞어서 16시간 동 안 55oC에 배양하였다. Bisulfite-modified DNA는 QIA quick PCR purification kit (Qiagen, Melbourne, Australia)를 이용하 여 처리하였다. DNA는 50 ul의 10 mM Tris-HCL (pH 8.0)을 이용하여 용출하고 5.5 ul의 3 mol/L의 NaOH를 이용하여 desulphonation시킨 후 37oC에서 15분간 배양하였다. 6 ul의 3 mol/L sodium acetate와 ice-cold absolute ethanol을 이용하 여 DNA를 침전시킨 후 시료를 -80oC에서 30분간 보관하 고 30분 동안 원심분리하여 상청액을 따라내고 결정을 건 조시킨 뒤 20 ul의 milli-Q water에 재부유화시켰다. 이렇게 하여 bisulfite modified DNA가 만들어졌다. 2 ul의 sodium Table 1. Genes investigated in this study

Gene abbreviation Gene Function

p14 p-14 alternative reading frame Cyclin dependent kinase inhibitor

p16 Cyclin dependent kinase inhibitor 4a Cyclin dependent kinase inhibitor

Cyclin D2 D-type cyclin Cell cycle regulation

TWIST TWIST Inhibit oncogene & p53 dependent cell death

E-Cadherin Epithelial cadherin Epithelial cell-cell adhesion

RASSF1α Ras association domain family protein 1 Ras effector homologue

DAPK Death Associated protein kinase 1 Interferon induced apoptotic kinase

HIN-1 High-in-normal 1 Putative cytokine with growth inhibition

RARβ Retinoic acid receptor β Nuclear retinoic acid receptor

Fig. 1. Methylation specific RT-PCR for tumor related genes. U

= unmethylated; M = methylated.

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bisulfite converted DNA에 primer를 첨가한 후에 PCR을 시행 하였다. PCR반응은 94oC에서 30초간 40 cycle을 반복하고, 30초간 annealing, 72oC에서 30초간의 extension 후에 PCR product를 2.5%의 agarose gel에서 전기영동하여 메틸화 상 태를 확인하였다. 양성대조군은 DNA 과메틸화를 나타내는 것으로 알려진 대장암 조직에 대한 시료가 양성대조군으로 사용되었으며, 음성대조군은 DNA가 들어있지 않은 시료가 사용되었다(Fig. 1). Primer sequence와 각각의 PCR조건은 Table 2와 같다.

3) 통계

통계는 SPSS (ver 13.0)을 이용하였으며, 단변량 분석은 Chi-Square test 및 Fisher's exact test, Student t-test, ANOVA 를 사용하였고, 다변량 분석은 다항 로지스틱 회귀분석을 이용하여 양성종양, 상피내암, 침윤성암에 대한 결과를 정 상조직의 결과와 함께 비교하였다. P값이 0.05 미만인 경우 를 통계학적으로 의의 있는 것으로 해석하였다.

1) 각 조직별 9개 유전자의 총 메틸화된 유전자의 수

9개 유전자의 메틸화된 총 개수는 정상조직에서 2.97±

1.74개, 양성종양 4.36±1.42개, 상피내암 5.73±1.35개, 침윤 성암에서는 5.42±2.05개로 정상조직에서 가장 낮았고, 상 피내암과 침윤성암에서 높게 나왔으며, P<0.001로 통계학 적으로 유의한 차이가 있었다(Table 3, Fig. 2). Duncan법으 로 사후 분석결과, 정상조직군, 양성종양군, 상피내암과 침 윤성암군, 세 군 사이에 서로 유의한 차이가 있었으며, 상피 내암군과 침윤성암군 사이에는 유의한 차이는 없었다.

2) 조직별 각 유전자의 메틸화의 특성

p14는 상피내암에서 100%, 침윤성암에서 69%로 정상조 직에서의 42%이나 양성종양에서의 38%에 비해서 메틸화 가 많이 되어 있었으며(P<0.001), p16은 침윤성암에서 37%

로 정상조직에서 20%, 양성종양에서의 7%에 비해 과메틸 화가 되어 있었고(P=0.008), DAPK는 정상조직에서 27%를 Table 3. Number of methylated genes in normal, benign, DCIS,

invasive cancer tissues

n Mean SD P-value

Normal 94 2.97 1.74

Benign 28 4.36 1.42

<0.001

DCIS* 11 5.73 1.35

Invasive cancer 66 5.42 2.05

DCIS = ductal carcinoma in situ; SD = standard deviation.

(4)

제외하고는 양성조직에서 55%, 상피내암에서 45%, 침윤성 암에서 54%를 보이는 등 모두 높은 메틸화를 보였다(P=

0.002). E-cadherin은 상피내암에서 82%로 다른 조직에 비해 서 높은 메틸화를 보였지만 통계적으로 의의는 없었다.

RASSF1α는 상피내암에서 100%의 메틸화를 보였고(P<

0.001), TWIST 또한 상피내암 91%, 침윤성암에서 70%로 정 상조직에서 19%와 양성종양에서의 48%에 비해서 높은 메 틸화를 보였다(P<0.001). RARβ는 침윤성암에서 60%로 정 상조직에서 22%, 양성종양에서 38%, 상피내암에서의 33%

에 비해서 메틸화가 높았으며(P<0.001), HIN-1은 양성종양 에서 83%로 높게 나왔다(P<0.001). Cyclin D2는 상피내암 에서 82%로 침윤성암 49%, 양성종양 45%에 비해서 메틸화 가 높게 나왔다(P=0.001). E-cadherin을 제외하고는 모두 통 계학적으로 유의하였다(Table 4).

3) 다변량 분석

양성종양에서는 DAPK (OR=2.835)와 HIN1 (OR=3.370)이 P=0.037로 정상조직에 비해 의의 있는 인자였으며, 상피내 암에서는 TWIST (OR=15.071)가 의의 있는 인자였다. 침윤 성암에서는 p14 (OR=3.826), RASSF1α (OR=2.715), TWIST (OR=7.384), RARβ (OR=3.153)으로 정상조직에 비해서 의

의 있게 나왔으며, TWIST는 상피내암과 악성종양에서 모 두 독립적으로 의의 있게 나타났다(Table 5∼7).

과메틸화는 여러 유전자들의 기능의 소실로 유방암의 발 생과 진행에서 중요한 역할을 한다.(12) 최근 여러 유전자 들의 과메틸화가 유방암의 발생과 진행에 있어서 의의가 있 다고 보고되고 있다. 과메틸화의 매개체로는 DNMT (DNA cytosine methyltransferase)가 중요한 역할을 하며, DNMT1은 주로 메틸화의 유지에, DNMT3a와 DNMT3b는 새로운 메틸 화에 관여한다.(13,14) 이런 DNMT의 활성화도가 암발생에 관여한다는 보고가 여러 암종에서 있었다. Patra 등(15)은 전립선암에서 양성에 비해서 2∼3배 높은 DNMT활성도를 보고하였고, Huang 등(16)은 유방암에서 정상조직에 비해 3∼12배 높은 DNMT1의 mRNA를 보고하였다. Pu 등(17)은 RARβ, RASSF1α, cyclin D2 세 유전자 중 한 개 이상의 메 틸화가 양성종양에서는 42%, 상피내암에서는 76%, 침윤성 암종에서는 96%로 보고하여 침윤성 암종으로 갈수록 메틸화 가 진행된다고 하였으며, Lehmann 등(9)은 P16, RASSF1α, Cyclin D2, 14-3-3σ 네 유전자 중 한 개 이상이 상피내암종 Fig. 2. Number of methylated genes in normal, benign, DCIS, malignant tissue.

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에서 90% 메틸화되어 있어, CpG island의 메틸화가 상피내 암 단계에서 이미 이루어졌다고 하였다. Hoque 등(6)은 갑 상선에서도 7개의 유전자 중 2개 이상의 메틸화가 과형성 에서는 25%, 양성종양 38%, 갑상선암 48%로 점점 증가한 다고 하였다. 본 연구에서는 9개 유전자 중 총 메틸화된 수

가 정상조직에서 평균 2.97개, 양성종양에서 4.36개, 상피내 암에서 5.73개, 침윤성암종에서 5.42개로 점점 증가하는 양 상을 보여(P<0.001) 기존의 보고와 일치하며, 사후 분석에 서 상피내암과 침윤성암과는 평균의 차이가 없는 것으로 보아 Lehmann 등(9)이 주장한 침윤이 일어나기 전에 대부 분의 Epigenetic 변화가 일어난다고 하는 것과도 일치한다.

각 유전자별로 살펴보면, Shinozaki 등(18)은 유방암에서 RASSF1α가 81%, TWIST 48%, RARβ 24%로 RASSF1α가 가장 많이 메틸화되었다고 보고하였고, Bae 등(8)은 cyclin D2 53%, RARβ 56%, TWIST 41%로 보고하였으며, 본 연구 에서는 침윤성암에서 RASSF1α가 84%로 가장 많이 메틸 화되어 있었으며, 다음이 TWIST 70%, RARβ 60%로 위의 연구들과 유사한 결과를 보였다. p16은 침윤성암에서 37%

로 정상조직(20%)과 상피내암 (18%)에 비하여 과메틸화되 Table 4. The comparison of methylation status of each gene in normal, benign, DCIS, invasive cancer tissue

Tissue type

P-value Normal (%) Benign (%) DCIS* (%) Invasive cancer (%)

p14 Unmethylated 56 (58) 18 (62) 0 (0) 21 (31)

<0.001

Methylated 40 (42) 11 (38) 11 (100) 46 (69)

p16 Unmethylated 76 (80) 26 (93) 9 (82) 42 (63)

0.008

Methylated 19 (20) 2 (7) 2 (18) 25 (37)

DAPK Unmethylated 70 (73) 13 (45) 6 (55) 31 (46)

0.002

Methylated 26 (27) 16 (55) 5 (45) 36 (54)

E-cadherin Unmethylated 57 (59) 14 (48) 2 (18) 36 (54)

0.067

Methylated 39 (41) 15 (52) 9 (82) 31 (46)

RASSF Unmethylated 47 (49) 7 (24) 0 (0) 11 (16)

<0.001

Methylated 49 (51) 22 (76) 11 (100) 56 (84)

TWIST Unmethylated 77 (81) 15 (52) 1 (9) 20 (30)

<0.001

Methylated 18 (19) 14 (48) 10 (91) 46 (70)

RARb Unmethylated 75 (78) 18 (62) 6 (67) 27 (40)

<0.001

Methylated 21 (22) 11 (38) 3 (33) 40 (60)

HIN-1 Unmethylated 50 (52) 5 (17) 8 (73) 18 (27)

<0.001

Methylated 46 (48) 24 (83) 3 (27) 49 (73)

Cyclin D2 Unmethylated 69 (72) 16 (55) 2 (18) 34 (51)

0.001

Methylated 27 (28) 13 (45) 9 (82) 33 (49)

DCIS = ductal carcinoma in situ.

Table 5. Odds ratio of benign tumor to control in multiple logistic regression

Odds ratio 95% CI P-value

P16 0.222 0.044∼1.111 0.067

DAPK 2.835 1.065∼7.547 0.037

TWIST 2.431 0.896∼6.596 0.081

HIN-1 3.370 1.077∼10.548 0.037

Table 6. Odds ratio of dcis to control in multiple logistic regression

Odds ratio 95% CI P-value

TWIST 15.071 1.012∼224.455 0.049

HIN-1 0.154 0.023∼1.022 0.053

DCIS = ductal carcinoma in situ.

Table 7. Odds ratio of invasive cancer to control in multiple logistic regression

Odds ratio 95% CI P-value

P14 3.826 1.651∼8.863 0.002

RASSF 2.715 1.017∼7.245 0.046

TWIST 7.384 3.138∼17.379 0.000

RARb 3.153 1.330∼7.471 0.009

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어 있어서 p16은 양성과 악성종양 모두에서 비슷한 메틸화 를 보인다는 Di Vinci 등(19)의 보고와는 달랐다. RARβ 또한 침윤성암에서 60% 메틸화로 상피내암 33%, 양성종양 38%에 비해 과메틸화되어 있었다. 상피내암에서는 p14와 RASSF1α 가 100%로 과메틸화되어 있었으며, 양성종양에서는 HIN-1 이 83%로 메틸화가 높았고, DAPK가 55%로 다음으로 과메 틸화를 보였다.

유방암의 발생과 진행에 있어서 정상조직과 양성종양에 서 상피내암으로, 상피내암에서 침윤성암으로 되는 과정에 관여하는 유전자의 메틸화에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. Douglas 등(20)은 activator protein-2alpha가 상피내암에 서는 16% 메틸화되었으나 침윤성암종에서는 75% 메틸화 되어 상피내암의 침윤에 유용한 표지자라고 하였으며, Lehmann 등(9)은 14-3-3σ와 RASSF1α가 상피내암과 침윤 성암 모두에서 높게 나와 유방암의 발생초기에 관여할 것 이라고 하였다. Kang 등(21)은 p53도 침윤에 관계없이 유방 암에서 높게 나왔다고 보고하였으며, Umbricht 등(22)은 14-3-3σ 또한 양성종양에서의 38%에 비해서 상피내암 83%, 침윤성암에서 96%로 p53, 시그마 모두 유방암의 초기 변화 에 관여할 것이라고 하였다. 본 연구에서는 TWIST의 메틸 화가 정상 19%, 양성종양 48%에 비해서 상피내암 91%, 침 윤성암 70%로 높게 나타났으며, 다변량분석에서도 상피내 암과 침윤성암 모두에서 독립적으로 의의 있게 높은 것으 로 나와 유방암의 초기에 관여할 것이라고 생각된다. TWIST 는 전사인자의 basic-helix-loop-helix 족에 속해 있으며, 그 역할이 명확하게 알려지지는 않았지만 암유전자를 억제하 고 p53과 연관된 세포사에 관여하는 것으로 생각되고, 과메 틸화로 인한 이러한 기능의 소실로 암발생에 관여하는 것 으로 보이며,(1) Evron 등(23)에 의하면 침윤성암에서 정상 0%에 비하여 42%의 과메틸화를 보여 암발생에 중요한 역 할을 하는 것으로 생각된다. p16은 정상조직에서 20%, 상피 내암에서의 18%에 비해 침윤성암에서 37%로 높게 메틸화 되었으며, RARβ는 정상조직이나(22%), 양성종양(38%), 상 피내암(33%)에 비해서 침윤성암에서(60%) 높게 메틸화된 것으로 나타나 상피내암의 침윤암으로의 진행에 관여할 것 으로 생각되며, RARβ의 경우에는 다변량 분석결과 침윤성 암에서 독립적으로 높게 나와 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. RASSF1α의 경우에는 정상조직 51%에 비해 양성종양 76%, 상피내암 100%, 침윤성암 84%로 악성 으로 갈수록 점차 증가되었으나 통계적 의미는 없었으므로 Lehmann 등(9)과의 보고와 같이 유방암의 초기에 관여한다 고 볼 수는 없었다. Lehmann 등(9)의 보고에 의하면 Cyclin D2의 경우에 상피내암에서 이미 높게 메틸화되어 있었다 가 침윤성이 되면서 급격히 떨어지는 경우를 관찰하였으며 저자들의 경우에서도 Cyclin D2의 경우에 상피내암에서 82%로 높게 메틸화되었으나, 침윤성암에서는 49%로 메틸 화가 감소되었다. 이것은 Cyclin D2가 세포주기에서 두 가

지 작용이 서로 반대되기 때문이라고 설명하였다. 즉 Cyclin D2는 세포주기의 활성체(activator)이면서 또한 증식 의 억제제, 노쇠의 유도체로서 작용하기 때문이라고 하였 다. 유방암의 진행에서 p16의 메틸화가 감소한다는 보고도 있지만 저자들의 경우에서는 발견할 수 없었다.(24)

유방암의 발생과 진행에 있어서 과메틸화는 중요한 역할 을 하는 것으로 생각되며, 정상조직, 양성종양, 상피내암, 침윤성암으로 갈수록, 즉 유방암의 진행에 따라 9개 유전자 의 총 메틸화된 수가 증가하였다.

침윤성암에서 가장 많이 메틸화된 유전자는 RASSF1α였 으며, TWIST의 메틸화가 유방암 발생의 초기에 관여하며, p16과 RARβ는 상피내암에서 침윤성암으로의 과정에 관여 하는 것으로 생각된다.

상피내암의 메틸화의 양상은 침윤성암과 비슷했지만, 또 한 양성과 악성의 중간적인 위치에 있는 것으로 보인다.

이상의 결과에서 실험조직의 수가 정상조직 96예, 양성 종양 29예, 상피내암종 11예, 앙성종양 67예로서 상피내암 의 조직이 다른 군에 비해서 적은 점이 아쉬운 점이며, 앞으 로 많은 다른 유전자의 메틸화의 연구와 더 큰 규모의 연구 를 통해 유방암의 진행에 있어서 메틸화의 명확한 역할과 다른 임상병리학적 특성과의 관계를 밝힐 수 있을 것이다.

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수치

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Table 5. Odds ratio of benign tumor to control in multiple logistic regression

참조

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