을 이용하여 시약의 성능을 평가한 후 검사에 사용하는 것이 바람직하다

： 년 월 일 ： 년 월 일 ： 년 월 일

：김 명 한 서울시 노원구 상계 동 대한적십자사 혈액수혈연구원

1ㆍ ¹ㆍ ²ㆍ ²

대한적십자사 혈액수혈연구원¹, 혈액관리본부²

바이러스 핵산증폭검사

는 검사 방법과 시약의 종류에 따 라 검출부위 와 민감도가 달라서 동 일 검체에 대해서도 바이러스 검출률

이 다르며 동일 시약이라 할지라도 지역에 따라 유행하는 바이러스의 특성과 변이형으로 인 해 지역별로 민감도가 다르게 나타날 수 있다 그 러므로 각 나라에서는 바이러스 핵산검사의 검출 률을 높이기 위해서 나라별로 유행하는 바이러스 유전변이형의 특성을 반영하는 국가표준물질

과 국제표준품

을 이용하여 시약의 성능을 평가한 후 검사에 사용하는 것이 바람직하다

헌혈 및 혈장분획제제용 혈액에 대한 검 사는 년부터 외국에서 사용되었으며 국내에 서는 년 월부터 와 핵산증폭검사 를 실시하였으며 핵산증폭검사는 년 월부터 전국적으로 실시되었다 그러나 년 대한정도관리협회 진단분자유전분과의 국내 검 사실 품질관리에 대한 신빙도 조사결과 보고서에 따르면 국내 검사실의 바이러스 검사시약 은 대부분 외국에서 제조된 시약으로 과거 영국 에서처럼 동일 검체임에도 불구하고 검사실간에 바이러스 정량 값이 서로 다르게 나타났다 더 욱이 년 월부터는 혈액관련

및 의 종의 바이러스 진단시약이 고 위험군 체외진단분석기용 등급 시약으로 분류 되어서 국내에 신규 도입되는 이들 시약은 국내 에서 채취한 검체를 이용하여 민감성과 유효성 시험 분석을 실시하도록 권유하는 형태로 품목허 가ㆍ신고ㆍ심사 규정이 개정되었다 그러므로 국내의 혈액관련 등급 바이러스 핵산검사용 시 약의 품질관리와 성능평가를 위해서는 국내의 바

이러스 변이형을 검출할 수 있으면서 양적으로 풍부하고 경제적으로 저렴하게 공급되어 사용할 수 있는 국가표준물질의 개발이 시급한 상황이 다 이에 본 연구는 혈액관련 고위험군 등급

및 바이러스 유전자 체외진단분 석기용 시약의 성능평가와 품질관리를 위하여 국내에서 채취한 혈장 검체를 원료로 하여 국내 바이러스 특성을 다양한 역가로 포함하는 국가표 준물질을 제조하고 그 기술을 확립하고자 하였 다

표준물질의 원료혈장 후보 군으로 대한적십자 사의 부적격 혈장 중 검사에서 양성인

양성혈장 단위 양성혈장 단 위와 양성혈장 단위를 연구대상으 로 하였다

연구대상 혈장에 대하여 핵산 정량 검사

를 실시하여 각각의 바이러스 농도를 분석하였다

이들 중 고역가를 보인 혈장에 대해

또 는 방법을 이용하여 각각의 바이 러스의 유전자형을 분석하였다

양성혈액 중 고역가를 보이는 단위

의 혈장에 대해 유전자형을 분석하였다 유전자

형은 유전자에 대한 및

을 실시하였다 의 유전자형은 을 실시한 후 하 여 그 결과를 이미 알려진 각 의 염기 서열과 계통발생학적 으로 비교하였

다 의 혈청형은 을 실

시한 후 하여 그 결과를 이미 알려진 각 의 염기서열과 비교 분석하였다

양성혈액 중 고역가를 보이는 단위 의 혈장에 대해 유전자형을 분석하였다 유전자 형은 양성혈장 각각 로부터

를 이용하여

에 장착하여 를 추출하였다 과 을 분석하기 위하여

를 증폭하였다 증폭산물 과

를 이용하여 검사를 수 행하였다 발색 반응을 보인 밴드의 양상을 확인 하여 시약제조사가 제시한 를 사용하여 표준패널의 과 을 분석 하였다

양성 단위의 혈장에 대하여 유전 자형을 분석하였다 유전자형은 양성 혈장 각각 로부터

를 이용하여 를 추출하여 을 실시하였다 에는

와

와

를 사용하였다 결과 증폭이 확인된 산물

에

을 처리하여 증폭산물 을 처리하였다 정제된 증폭산물을

로 하여 에

와 를 첨가하여

전체 부피가 로 하여 을 수 행하였다 이 완료된 반응산물은

를 사용 하여 정제하였으며 최종 정제산물 에 대한 염기서열 분석을

에서 실시하였다

결과 산출된 를

에서 하여 유전자 증폭 여부를 확 인하였다 분석에는 의

을 이용하였다

고농도의 원료 혈장을 고농도 중농도 및 저농 도 고중저 농도 로 희석하기 위하여 모든 헌혈혈 액 선별검사에서 음성이면서 수치가

이상으로 수혈부적격 처리된 혈장을 대상 으로 및 정량검사를 실시하 여 음성결과를 보인 혈장 단위를 희석용 혈장 으로 사용하였다

연구대상 혈장의 바이러스 핵산의 정량분석과

바이러스 유전자 분석 후 국내에서 유행하는 유

전자형의 바이러스 특성을 나타낸 후보물질 중

바이러스 역가가 가장 높은 물질을 바이러스별로

각각 단위씩 선별하여 고농도의 원료물질로 지

정하였다 고농도 원료물질로 선별된 단위씩의

혈장을 음성용 희석혈장으로 계대희석하고 희석

배수에 따른 핵산의 농도를 계산하여 완제품 구

성에 필요한 고중저 농도의 범위를 결정하였다

이때 저농도는 국내에서 사용되는 시약들의 검출

한계 범위를 문헌 조사하여 그 주변값으로 표준

† † †

↑

∼

∼

∼

∼

†

물질의 저농도를 제조하기 위하여 종류 이상의 저농도를 선택하였고 고농도는 시약회사에서 공 급하는 시약 내 대조용 양성물질의 농도를 조사 하여 평균값의 주변 농도로 선택하였다 이때 희 석된 혈장은 보존제 을 첨가하여 최종 농도가 가 되도록 하였으며 희석된 물질을 에 씩 분병하

여 완제품으로 제조하였

다

완제품에 대한 바이러스핵산의 최종 정량분석 을 위하여 국내 혈액원과 병원에서 가장 많이 사 용하는 종의 시약

을 선택하여 개 검사 기관에서 각각의 바이러스핵산에 대한 정량 분석 을 일간 중복하여 분석하고 그 평균과 표준편 차 값을 이용하여 표준물질의 역가 범위를 결정 하였다

연구대상 혈장의 바이러스 핵산 정량분석 결 과 농도 분포는 ∼

농도 분포는 ∼ 및

농도 분포는 ∼ 로 각 바이러스 의 평균 역가는

이었다

정량검사에서 고역가를 보인 양성 혈장 단위에 대하여 유전자형은

의 염기서열과 계통발생학적 으로 비교한 결과 은 모두 형이었다

의 혈청형은 유전자에 대한

을 통해 번 과 번 아미노산 에 따라 혈청형을 분석한 결과 단위는 형이고 나머지

단위는 형이었다

양성혈장 단위의 대한 유전자형 분석결과 단위는 형이고 나머지 단위는

형이었다

양성혈장 단위에 대한 유전자형 분석결과 단위는 유전자형이 분석되지 않았으 며 단위의 혈액은 이었다

상기의 유전자 분석 결과에 따라 국내에서 흔 히 관찰되는 유전자형을 나타낸 형

단위 단위와 형 단위를 희

석용 혈장에 계대희석하여

의 원료물질을 다양한 농도로 제조한 후 희석 배수 값을 토대로 완제품 세트에는 고농도 중농 도 및 저농도 물질이 각각 종 이상 포함되도록

구성하였다 즉 는

형으로 한 세트에 종의 바이러스 농도가 각각 씩 포함되도록 구성하였고

와 의

는 각각 형과 형으로 각각의 세트에는 가지 바이러스 농도가 씩 포함되 도록 하였다

완제품의 정량값을 분석하기 위하여 각각 가

지 시약을 이용하여 서로 다른 검사실 곳에서

이를 정량 분석하여 평균과 표준편차를 구하였다

∼ 완제품의 정량 분석 결과 와 의 표준물질 최저 농도는 이상 으로 대부분의 국내 시약의 검출한도를 상회하였 으나 표준물질의 최저 농도는

이하로 시약의 고유 민감도에 따라서 검 출되지 않는 경우도 있었다

수혈용 혈액과 혈장분획제제용 원료혈장에 대

한 와 바이러스 선별검사

는 전염병 파급의 위험도가 커서 선별검사법의 품질관리가 매우 중요하다 특히 와 바이러스에 대한 선별검사 중 핵산증폭검 사는 년부터 유럽과 미국에서 도입되기 시작 하였으며 국내에서는 년 월부터 와

의 핵산증폭검사를 실시하였고 핵산검 사는 년 월부터 전국적으로 선별검사가 실 시되고 있다 이때 핵산검사실은 모든 마다 상 업용으로 판매되는 저역가의 물질을 사용하여 검사의 품질을 관리한다 그러나 이러 한 에 이용되는 핵산검사용 표준물질 은 이제껏 국내에서 제조된 바가 없으므로 전량 외국에서 수입하여 사용하고 있으며 이에 따른 수급량의 불균형과 고비용이 국내 핵산검사실의 품질관리에 있어서 문제점으로 대두되고 있다 바이러스 핵산증폭검사는 검사시약별로 검사방 법에 따라 민감도 및 특이도의 차이가 있다 특 히 바이러스의 유전변이형이 심하게 나타나는 경 우 나라별로 변이형의 특성이 달라서 시약별로 민감도 차가 크게 나타나고 있다 그러므로 바이 러스 핵산검사의 민감도를 높이기 위해서는 각 나라별 바이러스 유전변이형의 특성에 맞는 시

약 표준물질 및 표준품

을 사용하여 검사를 품질관리하는 것이 중요하다 특히 는 국내에서 군중면역

때문에 유전자 변이형이 쉽게 나타나는 바이러스로서 외국에서 제조된 검사시약을 사용 할 경우 때때로 국내 바이러스 유전변이형의 특 성을 반영하지 못하여 검출력이 낮아질 수 있다 그러므로 외국시약이 국내에 처음 도입될 때는 국내에서 유행하는 바이러스를 잘 검출하는 시약 인지를 검증한 후에 사용하는 것이 바람직하다 그럼에도 불구하고 년까지 국내에서 시판되 는 외국시약의 경우 별도의 국내 성능평가 없이 수입허가만으로 판매가 가능하였다 또한 국가가 국내에 시판되는 핵산시약의 품질을 보증하기 위 하여 최저검출농도 기준을 통과하는 시약에 대해 서만 시판허가를 하기 위해서는 이를 검증하기 위한 저역가의 표준물질을 이용하여 시약의 검출 능력을 확인하는 것이 필요하나 국내에서는 아 직 저역가의 핵산검사용 표준물질이 제조된 바 없고 정성검사 시약의 최저 검출농도에 대한 기 준도 아직 없다 다만 현재 국내에서 제조된 핵산 검사용 표준물질은 년도에 식품의약품안전 청에서 제조한 고농도의 로 농

도가 인 표준품

한 종류뿐이며 그 외의 와 핵산검 사용 표준품은 개발되지 않은 실정이다 영국 의

와 네덜란드의

가 중심이 되어 혈장의 바이러스 핵산 검사

를 국제적으로 공동연구 한 결과 각 나라별 검사

실 간에 검출률에 있어서 커다란 차이가 있었다

즉 동일 검체를 검사했음에도 불구하고 검사시약

간 약 배까지 민감도 차이가 발생하는 것을

확인하였다 유럽에서는 년 월 일부터 혈

액제제 원료혈장의 핵산검사법을 의무화하고 핵

산검사결과 농도가 이상인 혈장은 원료물질로 사용할 수 없도록 기준을 정 하였다 이에 바이러스의 정확한 핵산 농도를 규 정짓기 위해서 검사를 표준화하는 것이 필요하 며 이에 사용되는 핵산표준품의 필요성도 활발 히 논의되어 국제표준품 이 처 음으로 제조되었다

는 질환의 예방과 진단에 필요한 체외진 단용 시약의 개발과 평가 표준화 그리고 품질관 리를 실행하기 위하여 국제생물학적 표준품

을 관리하 는

조직과 생산을 담당하는

조직을 구성하였다 는 표준품에 대한 검토와 정책을 결정을 하는 기구 로 년부터 매년 회의를 통해 국제표준 품에 대한 모든 사항을 결정하고 있으며

를 통해서 국제표준품을 제조한다 년 는 처음으로 용 혈액유래 바이 러스 표준품으로 의 역가가

인 국제표준품

과 의 역가가

인 국제표준품을 제조 하였다 표준품은 형의 역가가

인 로 제

조하였다 년에도 세계보건기구

는 혈액안전을 위한 체외진단 의약품의 품질관리용 생물학적 표준품

의 개발 계획을 수립하 여 다양한 유전자 검사용 표준물질을 생산하였 다 미국 일본 및 유럽은 체외진단분석기용 등급 시약에 해당하는 수혈관련 고위험군 바이러 스 종 중 일부 바이러스에 대하여 나라별로 핵 산증폭검사를 실시하고 일상 검사를 할 때 자국

의 국가표준품을 이용하여 검사의 품질을 관리하 고 있다 국제표준품은 각 나라별 유행하는 유전 자변이형을 모두 구하기 어려운 경우가 종종 있 고 그 가격이 고가이며 공급량도 제한적이어서 모든 검사실마다 국제표준품을 사용하는 데에는 제한이 있다 또한 국제표준품을 사용할 경우 각 국의 전염병 물질 전파규제 강화로 인하여 유통 상에 어려움이 있어서 자국의 바이러스 특성이 반영된 국가표준품을 제조하여 사용하도록 에서는 권고하고 있다 그래서 각 나라별로 자 국의 표준품을 제조하는 기관을 별도로 지정하여 국가표준품을 제조하는데 대표적으로 네덜란드 의 표준품 독일의

스페인의 와 미국의

의 표준품이 있다 독일의 는

등을 대상으로 품질관리 및 시약 평가를 하 기 위하여 자체적으로 개발한 품질관리용 표준 품 국제표준품 및 상용 표준품을 보유하고 있 다 영국의 는 다양한 유전자형이 포함 된 와 의 을 제조하여 공급 하고 있다 이들 표준품은 각 혈액원이나 혈장분 획제제 제조사에 공급되어 혈액제제용 핵산증폭 검사를 실시할 때 표준품으로 사용된다 그 외에 도 품질관리 물질을 전문 상업용으로 제조 판매

하는 회사로 가

있다 에서 제조된 상업용 패널은 세계 각국 에서 진단제제 허가 혈액원에서의 진단시약 평 가와 외부 정도관리 등의 목적에 맞추어 다양하 게 사용되고 있다 또 은 여러

에 대해 약 양성 결과를 보이는 로

서 매 검사에 대한 이나 오류를 체계적

으로 발견할 수 있는 를 구성하는 컴

퓨터프로그램과 연결되어 각 나라의 검사실 품질

관리용으로 사용되고 있다

국내에서 사용되고 있는 시약의 과

검출한계 를 조사한 결과 는

이 와 이였고

는 으로 모든 시약이 동일한 부위를 증폭하고 있었다 의 경우는 시약에 따라 증폭부위에 차이가 있었다 또 시약 별 최소 검출한계는 과 시약사에 따라 차이가

있었는데 는 ∼ 는 ∼

이고 는 ∼ 로 나타났 다 그러므로 본 연구에서는 국내에 도입된 다양한 검사시약의 성능을 비교 평가하기 위한 로서 활용할 수 있도록 하기 위하 여 각 시약의 검출범위를 포함하도록 고중저 농 도의 종 이상의 다양한 농도로 와

핵산증폭검사용 물

질을 생산하였다

년 국내 유통되는 검사시약의 관리를 강 화하기 위하여 신약심사 서류에서 국제공통기술 문서를 적용하도록 하는 것을 의무화하고 의약품 등의 적정 관리와 현행 제도의 운영상 나타난 일 부 미비점을 합리적으로 개선하기 위하여 의료기 기관련 규정이 개정되었다 이에 따라 년

월부터 혈액제제 선별검사에 이용되는 그리고 종의 바이러스 진단 시약이 체외진단분석기용 등급 시약으로 분류 되고 국내에 신규 도입되는 이들 바이러스 검출 시약은 국내 검체를 이용하여 시약의 유효성 시 험분석을 실시할 것을 권유하는 것으로 품목허 가 신고 및 심사 규정이 개정되었다 그러므로 국내의 생물학적 표준물질의 생산은 매우 긴급하 고 지속적으로 이루어져야 하는 상황이며 특히 국내에서 발견된 바이러스 검체를 원료로 한 국 가표준물질이 지속적으로 풍부하게 생산되어야 규정의 취지를 살리고 규정의 효과도 얻을 수 있

다 국가표준물질은 약 ∼ 여명의 바이러스 감염자로부터 유래된 다양한 종류의 시약성능 평 가용 표준패널

로 구성하여야 하며 매년 새로이 발생하는 바이러스 양성자의 인체 유래 검체로부터 원료를 확보하여 새로운 바이러스 변 이형의 출현을 조기에 인지하고 국가표준물질의 원료가 물량적 부족을 겪지 않도록 하여야 할 것 이다 이러한 체계적 시스템을 갖추기 위해서는 향후 국가표준물질 생산에 관한 법적 규정과 예 산확보가 추가적으로 진행되어야 한다

본 연구의 한계점은 국내 검사실 중 바이러스 의 핵산정량 검사를 실시하는 기관과 시약 종류 가 다양하지 못하여 주어진 시간적 경제적 여건 하에서 정량검사 시약 종만을 이용하여 표 준물질의 정량 값을 제시하였다 또 시약에 따라 정량 값의 차이가 있었는데 이는 검사시약 의 경우 증폭하는 의 부위와 검출감도 가 다른 것에 기인한 것으로 판단하였다 그러므 로 향후 여러 검사실에서 다양한 시약으로 표준 물질을 정량 분석한 후 추가적으로 표준물질의 정량 값을 재산정하는 것이 바람직하며 표준물 질의 안정성 평가를 위하여 앞으로 매년 정량 분 석을 실시하여 표준물질의 안정성을 관찰하여야 할 것이다

본 연구를 통하여 제조된 혈액관련 고위험군

와 의 표준물질은 검사시약

의 민감도와 유효성을 객관적으로 검증하는데 활

용할 수 있으며 향후 민감도 분석을 위해 수 백

명의 검체에서 유래된 민감도패널 표준물질 제조

를 위한 기초 기술로 활용될 수 있을 것이라 사료

된다

년 월부터 국내에 신규로 도입되는 고위험군 바이러스 검사시약은 국내 검체를 이용 한 성능 시험분석을 실시하여 식품의약품안전청 허가를 득하도록 일부 규정이 개정되었다 이러 한 바이러스 진단시약의 성능시험과 품질관리 규 정을 이행하기 위해서는 국내 검체에서 유래된 국가표준물질이 필요하다 이에 본 연구에서는 바이러스 핵산증폭검사시약의 성능평가와 품질 관리를 위하여 다양한 농도로 구성된

와 의 핵산증폭검사용 혈장유래 표준물질 을 제조하고자 하였다 수혈 부적격의 양성혈장 단 위 양성혈장 단위 그리고

양성혈장 단위에 대해 핵산 정량검사와 유전자형 검사를 실시하였다 이를 바탕으로 국 내에서 유행하는 바이러스의 유전자형을 가진 고 농도의 원료혈장을 선정하였다 또 표준물질의 다양한 농도는 국내외 검사시약의 검출범위에 근 거하여 적정한 농도범위를 선택한 후 다양한 농 도로 원료물질을 희석하고 분병 처리 한 후 정량 적으로 분석하였다

와 의 체외진단분석기용 핵산증폭검사의 성능평가용

는 총 종의 다양한 농도물질로 제조되었 다

국내에서 혈액관련 고위험군

와 의 체외진단용 핵산증폭검사 시약의 성능 평가에 필요한 바이러스 핵산 검사용 국가표준물 질을 처음 제조하여 그 기술을 수립하였다

연구 중 표준물질의 정량역가 결정에 참

여 해 주신 고대구로병원 서울성모병원과 분당

서울대병원에 감사의 뜻을 전합니다