Cytokine Profiling of Prostatic Fluid From Cancerous Prostate Glands Identifies Cytokines Associated with Extent of Tumor and Inflammation

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•교신저자：조인래, 인제대학교 일산백병원 비뇨기과학교실 경기도 고양시 일산구 대화동 2240

Tel: 031-910-7230, Fax: 031-910-7239 E-mail: [email protected]

•교신저자：조인래, 인제대학교 일산백병원 비뇨기과학교실 경기도 고양시 일산구 대화동 2240

Tel: 031-910-7230, Fax: 031-910-7239 E-mail: [email protected]

Cytokine Profiling of Prostatic Fluid From Cancerous Prostate Glands Identifies Cytokines Associated with Extent of Tumor and Inflammation

전립선 암 조직을 이용한 전립선액의 면역학적 분석에서 전립선암의 상태 및 염증 정도에 의미를 갖는 싸이토카인

Fujita K, Ewing CM, Sokoll LJ, Elliott DJ, Cunningham M, De Marzo AM, Isaacs WB, Pavlovich CP

(The Prostate 2008;68:872-82)

인제대학교 의과대학 비뇨기과학교실 조 인 래․송 현 동

[초 록]

배 경: 싸이토카인은 전립선암의 시작과 진행에 관련될 수도 있는 주요한 염증의 매개체이며, 전립 선암, 전립선암과 관련된 염증에 유용한 표지자이다. 싸이토카인과 전립선암의 관련성을 더 잘 이해하 기 위해서, 암에 걸린 전립선에서 얻어진 전립선액에서 싸이토카인을 분석하였고 암의 상태와 염증의 등급에 관련지어 보았다.

방 법: 전립선액은 근치적전립선적출술 검체에서 모아졌고 싸이토카인 항체 micoroarray로 분석되었 다. 각 검체들은 병리소견에서 전립선암의 용적이 최소인 군과 광범위한 군으로 분류되었으며, 분류된 두 군 사이에 가장 큰 차이를 보이는 싸이토카인 중에서 8개의 싸이토카인이 ELISA에 의하여 정량화 되었다. 추가로 호중구, 대식세포, 림프구에 의한 전립선 염증의 등급을 각각 점수화하였으며, 싸이토 카인의 수준과 관련하여 검사하였다.

결 과: 분석된 174개의 싸이토카인들 중에서, HGF가 가장 크게 증가되었고 (6.57배), 이외에 최소 용 적의 암을 가진 환자들과 비교하여 광범위 용적의 암을 가진 환자들에게서 IL18Bpa가 의미 있게 증가 되어 있었다. 전립선 내강에 현저한 호중구 침윤을 보인 검체에서 IL17, GITR, ICAM-1이 증가되어 있 었으며, 전립선 간질에 현저한 림프구 염증을 가진 검체에서 IL18Bpa, IL17, GITR, ICAM-1이 증가되어 있었다.

결 론: 전립선액에서 얻어진 싸이토카인들은 조기 암 발견, 예견과 전립선 염증의 평가에 유용하며 특히 ex vivo에서 얻어진 전립선액 뿐만 아니라 정상 남성의 전립선에서 얻어진 expressed prostatic secretion (EPS)이나 소변에서 얻어진 것도 유용한 것으로 평가되었다.

핵심 단어들: 암, 염증, 싸이토카인

(2)

서 론

전립선암은 가장 흔한 암이며 미국에서 40대 이 상의 남성에서 암으로 인한 사망의 두 번째 원인이 다.

¹

전립선암의 원인은 잘 밝혀지지 않았으나 위, 간, 대장에서 만성 염증과 감염은 암의 원인이다.

조직병리학적, 분자조직병리학적, 역학적, 유전역학 적 연구로부터 나온 자료에 따르면 전립선암 발생 에 만성 염증이 또한 중요한 역할을 할 것이라고 판 단된다.

²

염증과 관련되어 나타나는 형태학적으로 단순 위축을 가진 증식성 선상피가 보이는 증식성 염증성위축 (proliferative inflammatory atrophy; PIA)은 전립선암의 전구 단계로 생각한다.

³

만성이나 급성 의 전립선염증은 많은 근치적전립선적출술 검체에서 관찰된다.

⁴

싸이토카인은 면역, 상피, 간질 세포에서 분비되어 선의 내강으로 배출되는 단백질이다.

^5,6

세포들은 관 련된 싸이토카인에 의해서 서로 상호작용을 한다. 싸 이토카인은 염증의 주요한 매개체일 뿐만 아니라, 전립선암의 시작과 진행에 있어 중요한 역할을 한다.

Expressed prostatic secretion (EPS) 에서 얻은 전립선 액내 싸이토카인들의 분석은 시행되었지만,

^5,6

전립선 암 조직에서의 싸이토카인들의 포괄적인 분석은 아 직까지 보고되지 않았다. 그러한 싸이토카인들의 분 석을 통해서 전립선암의 시작과 진행의 기전에 대해 서 잘 이해할 수 있으며, 전립선암과 염증의 새로운 표지자를 쉽게 발견할 수 있을 것이다. 전립선의 염 증을 감소시키기 위해 화학예방적 전략이 시행되는 경우, 이러한 과정에서 비침습적 표지자들이 유용하 게 쓰일 수 있을 것이다. 이 연구에서 전립선암 조직 에서 얻은 전립선액의 싸이토카인들을 분석하고 암 의 상태와 염증의 정도를 연관시켜 보았다. 전립선염 증상의 평가는 NIH-CPSI를 이용하였다

대상 및 방법

1. 샘플의 수집

전립선액은 ex vivo에서 쥐어짜는 방법으로 수집

하였다. 전립선은 근치적전립선적출술 후에 얻어졌 고 전립선액은 요도의 잘린 끝 (apical urethral stump) 에서 얻어졌다. 근치적전립선적출술 검체는 표준 프 로토콜대로 일반적인 포르말린 고정, 절단, 병리학 적 분석 순으로 진행되었다.

⁷

이번 연구를 위해 암 용적에 의해 평가된 최소 전립선암 (M, n=20)이나 광범위 전립선암 (E, n=20)을 가진 전립선이 선택되 었다. 최대 종양 면적이 15mm

²

이하인 검체는 M군, 최대 종양 면적이 80mm

²

이상인 검체는 E군으로 분 류하였다. 전립선액은 싸이토카인 결정 실험 때까지 -80℃에서 보관되었다. 연구를 시작하기 전에 Instititui- tonal Review Board에서 승인을 얻었으며 모든 환자 에게서 서면으로 사전 동의를 얻었다.

2. 싸이토카인 항체 배열

174개의 싸이토카인들을 포함하는 Raybio

^TM

Human Cytokine Array kit (Raybiotech, Norcross, GA)가 제작 자의 추천대로 사용되었다. 간단히 말해 포획 항체로 고정된 막들은 5% bovine serum albumin/triethanolamine- buffered saline (TBS)으로 1시간 동안 차단하였다. 그리 고 나서 막들은 전립선액 샘플 [1ml, in 10-fold dilution with TBS, complete protease inhibitor cocktail tablets (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)]과 함께 실온에 서 2시간 동안 배양하였다. 결합되지 않은 싸이토 카인들을 제거하기 위해 TBS/0.1% Tween 20 (매 5분 마다 3번), TBS (매 5분마다 2번)로 강력하게 세척 후, 막은 biotin-conjugated anticytokine antibodies와 함 께 배양되었다. 막은 세척 후, horseradish peroxidase- conjugated streptavidin (2.5pg/ml)과 같이 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 결합되지 않은 물질들은 TBS/

0.1% Tween 20, TBS로 세척이 되었다. 마지막으로

향상된 화학발광시스템을 사용하여 신호를 발현시

켰다. 향상된 화학발광시스템에 의해서 발현된 신호

(spot)들은 시각화되었다 (ECL plus Western Blotting

System, Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA). 각각

의 막은 Kodak X-Omat 방사선 필름에 이미지 당 1

분 동안 노출하였다. 각각의 필름은 TIFF 이미지 파

일로 스캔 되었고, 신호들은 Gel-Pro-Analyzer (Media

Cybernetics, Bethesda, MD)를 가지고 밀도로 디지털

(3)

화 되었다. 신호들의 밀도는 Microsoft Excel로 보내 졌고, 배경의 강도는 분석 이전에 감산되었다.

3. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

전립선액으로부터 8개의 싸이토카인들이 ELISA를 통하여 측정되었다. ELISA kit는 hepatocyte growth factor (HGF), interleukin 12p70 (IL12), glucocorticoid- induced tumor necrosis factor receptor (GITR), intercellular adhesion molecule1 (ICAM-1), neurotrophin-3 (NT-3) 를 찾기위해 사용하였다. Quantikine human immunoassay kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)는 interleukin 17 (IL17), epithelial-neutrophil aqctivating peptide (ENA78) 을 찾기 위해 사용하였다. DuoSet ELISA development system (R&D Systems)은 interleukin 18 binding protein a (IL18Bpa)을 찾기위해 사용하였다. 각각의 싸이토카 인들은 제작자들의 추천대로 측정되었다. 예를 들어, HGF, IL12, GITR, ICAM-1, NT-3를 측정하기 위하 여 전립선액은 희석되었고 샘플들은 2.5시간 동안 실온에서 배양되어 2배로 첨가되었다 (100μl/well).

Biotinylated antibodies도 첨가되었고 (100μl/well) 1시 간 동안 실온에서 배양되었다. Streptavidinhorseradish- peroxidase (15분 동안)으로 배양한 후에 3,3V, 5,5V- tetramethylbenzidine (TMB)으로 30분간 처리한 후 발 견되었다. 반응은 1.5M H

2

SO

4

을 첨가한 후에 중지 되었다. Plate들은 microplate reader (PHERA star, BMG LABTECH, Durham, NC)에서 450nm의 파장을 사용 하여 읽었다.

3. 조직학적 분석

Hematoxylin과 eosin 염색된 절편을 전립선의 염 증 상태를 평가하기 위해 사용하였다. 각각의 경우 에, 두 개의 절편이 (전립선의 첨부와 중간부분에서) 우후방, 좌후방, 우전방, 좌전방에서 (총 8절편) 선 택되었고, 호중구, 대식세포, 림프구의 존재를 확인 하기 위하여 광학현미경으로 검사하였다. 호중구나 대식세포에 관한 염증등급 1 (저등급 염증)은 검체 에서 호중구나 대식세포가 단지 전립선 내강에서만 발견되고 상피세포의 파괴가 없거나, 호중구가 전

혀 관찰되지 않을 때로 정의되었다. 염증 등급 2 (고 등급 염증)는 전립선 내강이 면역 세포나 고름으로 차고 10개 이상의 호중구나 대식세포가 상피세포 상 에 40배 확대에서 발견되거나 상피 파괴와 관련되 어 면역세포들이 간질에서 발견될 때로 정의되었다.

림프구에서 1등급은 결절/소포의 형성을 가진 염증 세포가 국소적, 또는 다발성으로 간질에서 발견되는 (50% 이하의 면적) 검체에 주어졌으며, 2등급은 적어 도 한 절편의 간질에서 광범위하게 관찰되는 (50%

이상의 면적) 검체에 주어졌다.

⁸

4. 자료 분석과 통계

각각의 막에서의 양성조절 신호가 싸이토카인 항 체 array에서 싸이토카인 신호강도를 표준화하기 위 해 사용되었다. 그런 후 자료들을 실제 전립선에서 나온 전립선액의 양의 차이를 보정하기 위해 각각 의 전립선액 샘플에서 나온 PSA 수준으로 표준화 하였다. 각 전립선액에서 총 PSA 수준은 Hybritech PSA assay on the Beckman Coulter Access Immunoassay System (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA)으로 측정되었다. 각각의 군에서 (M 또는 E) 표준화된 싸 이토카인의 강도는 군 간의 상대적인 n배로 전환되 었다. 전립선액에서 ELISA로부터의 자료들은 각각의 전립선액 샘플의 평균 PSA 수준으로 표준화되었다.

전립선액에서 얻어진 자료들은 종양의 크기 (M 과 E), Gleason 점수 (6 과 7 이상), 염증 등급 (1 또는 2)로 분류되어 분석되었다. 통계분석은 GraphPad Prizm 4.0 for Windows를 사용하여 이루어졌다. Mann–

Whitney tests가 두 군 간의 차이를 분석하기 위해서 사용되었다. 종양 크기와 염증 등급 사이의 상관관 계를 분석하기 위하여 chi-square tests가 이용되었다.

Spearman’s correlations이 두 개의 싸이토카인들의 상

관관계, 그리고 싸이토카인과 조직 무게나 나이와의

상관관계를 분석하기 위해서 사용되었다. 통계학적

유의성은 p-value<0.05로 산정하였다.

(4)

Table 1. Cytokine profile of prostatic fluid

Cytokine Ratio (Ext/Min) Average signal of Ext group (SD) Average signal of Min group (SD)

HGF 6.57 118.24 (164.50) 18 (14.90)

IL18Bpa 2.58 4.37 (6.67) 1.69 (2.60)

ICAM-1 2.41 53.34 (68.50) 22.15 (23.09)

IL17 2.34 1.74 (2.78) 0.74 (1.15)

NT3 2.32 1.79 (2.38) 0.77 (1.31)

IL12p70 2.32 4.41 (5.92) 1.90 (1.48)

GITR 1.99 3.80 (4.56) 1.91 (1.69)

ENA78 1.74 20.93 (28.61) 11.99 (18.71)

Complete cytokine profile shown in supplementary table.

Ext; extensive prostate cancer, Min; minimal prostate cancer

결 과

1. 싸이토카인 array에 의한 전립선액의 싸이토카 인 프로파일

E군 (광범위 전립선암)으로부터 나온 싸이토카인의 표준화된 강도는 상대적인 n배 변화를 계산하기 위 해 M군 (최소 전립선암)에서 나온 강도로 나누었다.

싸이토카인 array로 얻어진 상대적인 n배의 싸이토 카인 프로파일 순위는 표 1에 있다. 분석된 174개의 싸이토카인 중에, HGF가 E군에서 가장 증가된 싸이 토카인이었다 (6.57배).

2. ELISA에 의한 암 상태와 HGF와 IL18BPa의 상관 관계

E군과 M군 사이에서 가장 큰 차이를 보이는 싸이 토카인들 중에서, 연구자들은 추가연구를 위해 8개 의 싸이토카인들을 선택했다 (HGF, IL18Bpa, ICAM-1, IL17, NT-3, IL12, GITR, ENA78). 그리고 ELISA로 정량화하여 전립선액에서 수준을 파악하였다. 이들 각각의 싸이토카인들은 E군에서 상승되었고, HGF와 IL18Bpa는 M군에 비교해서 통계적으로 유의한 상승 을 보였다 (Fig. 1). Gleason 점수에 기초한 분석에서 오직 IL18Bpa만이 높은 Gleason 점수 (≥7)를 가진 표 본들에서 유의하게 상승하였다. 몇몇 싸이토카인들

사이에서 강한 상관관계가 나타났다. 특히 ICAM-1 과 GITR (Spearman's correlation coefficient r=0.820), ICAM-1과 ENA78 (r=0.782), NT3과 GITR (r=0.782) (Table 2)에서 나타났다. 각각의 싸이토카인들과 표 본의 무게 사이에서는 어떤 상관관계도 나타나지 않 았다. 연령의 증가와 IL12사이에서 (r=0.3480) 그리 고 연령의 증가와 NT3 (r=0.4001)사이에서는 약한 상관관계를 보였다.

3. 싸이토카인 수준과 전립선 염증 사이의 관계

기본적인 조직화학적 분석을 통해 호중구와 대식

세포가 전립선 내강 (등급 1 염증, Fig. 2)과 전립선

상피세포 내층 (등급 2 염증)에 존재한다는 것을 확

인하였다. 관 (duct)을 둘러싼 간질 내에 고립된 응

집 림프구들 (등급 1)과 림프구 소포들 (등급 2)이

때때로 관찰되었다. 각각 평가된 면역 세포의 유형

(호중구, 대식세포, 림프구)에 의한 염증 등급과 종

양 용적 (M과 E) 사이에는 통계적 상관관계가 없었다

(Chi-square test). 전립선액에서 발견되는 8개의 싸이

토카인들에 관한 자료들은 근치적절립선적출술 검

체에서 염증 등급에 따라 분석되었다. 호중구 염증에

의해 분류한 경우에는 IL17, GITR, ICAM-1이 통계

적으로 유의하게 염증의 증가 (등급 2)와 관련이 있

었고 (p<0.05), ENA78 (p=0.0594)과 NT-3 (p=0.0554)

수준은 통계적 유의성에 근접하였다 (Fig. 3). 대식

세포 염증에 따라 분류한 경우에서는 등급 1 침윤에

(5)

1.2×10³ 9.0×10³ 6.0×10³ 3.0×10³

0

M E

P value 0.0158

IL 18Bpa 5.0×10³

4.0×10³ 3.0×10³ 2.0×10³

0

M E

P value 0.1308 IL 17

1.0×10³

2.0×10³ 1.5×10³ 1.0×10³ 5.0×10³

0

M E

P value 0.2196

IL 12 1.5×10³

1.0×10³

5.0×10³

0

M E

P value 0.1881 GITR

1.5×10³

1.0×10³

5.0×10³

0

M E

P value 0.2451

ENA78 6.0×10³

5.0×10³ 4.0×10³ 3.0×10³

0

M E

P value 0.1367 ICMA-1

2.0×10³ 1.0×10³

4.0×10³ 3.0×10³

2.0×10³ 1.0×10³

0

M E

P value 0.4946

NT-3 1.0×10³

7.5×10³

5.0×10³ 2.5×10³

0

M E

P value 0.0090 HGF

Fig. 1. Correlation of cytokines with cancer status. Each cytokine level measured by ELISA was analyzed stratified by cancer status.

The HGF and IL18Bpa elevations of group E were statistically significantly compared to groupM [M: minimal prostate cancer (n=20), E: extensive prostate cancer (n=20)].

비교하여 등급 2에서 이러한 싸이토카인들의 유의한 증가가 없었다

(Fig. 4). 림프구 염증에 따라 분류한 경우에서는

IL18Bpa, IL17, GITR, ICAM-1이 등급 2 림프구 침

윤에서 유의하게 증가하였다 (p<0.05) (Fig. 5).

(6)

Table 2. Correlations between eight cytokines

IL18Bpa IL17 IL12p70 GITR ENA78 ICAM-1 NT-3 HGF

IL18Bpa 0.2585

(0.1072)

0.2992 (0.0643)

0.5417 (0.0004)

0.339 (0.0324)

0.6246 (<0.0001)

0.4507 (0.0035)

0.3732 (0.0177)

IL17 0.2585

(0.1072)

0.6486 (<0.0001)

0.4986 (0.0012)

0.4026 (0.01)

0.4829 (0.0016)

0.4865 (0.0015)

0.2568 (0.1096) IL12p70 0.2992

(0.0643)

0.6486 (<0.0001)

0.6175 (<0.0001)

0.5767 (0.0001)

0.5227 (0.0006)

0.5832 (<0.0001)

0.3227 (0.0451)

GITR 0.5417

(0.0004)

0.4986 (0.0012)

0.6175 (<0.0001)

0.6854 (<0.0001)

0.8203 (<0.0001)

0.7816 (<0.0001)

0.3967 (0.0124)

ENA78 0.339

(0.0324)

0.4026 (0.01)

0.5767 (0.0001)

0.6854 (<0.0001)

0.7822 (<0.0001)

0.5548 (0.0002)

0.3946 (0.0118) ICAM-1 0.6246

(<0.0001)

0.4829 (0.0016)

0.5227 (0.0006)

0.8203 (<0.0001)

0.7822 (<0.0001)

0.6576 (<0.0001)

0.4927 (0.0012)

NT-3 0.4507

(0.0035)

0.4865 (0.0015)

0.5832 (<0.0001)

0.7816 (<0.0001)

0.5548 (0.0002)

0.6576 (<0.0001)

0.2874 (0.0721)

HGF 0.3732

(0.0177)

0.2568 (0.1096)

0.3227 (0.0451)

0.3967 (0.0124)

0.3946 (0.0118)

0.4927 (0.0012)

0.2874 (0.0721) The value listed is the Spearman's correlation coefficient, and that in parentheses is the p-value.

A B

C D

Fig. 2. Inflammation of prostate by neutrophils, macrophages or lymphocytes. A. Some neutrophils or macrophages were observed

only in gland lumina, with no epithelial destruction. B. A gland lumen filled with neutrophils and pus, with neutrophils noted

within the epithelial lining (inflammation grade 2). C. A gland lumen filled with macrophages and pus, with macrophages noted

within the epithelial lining (inflammation grade 2). D. In grade2 lymphocytic inflammation, confluent sheets of inflammatory cells

with nodule/follicle formation were observed diffusely in the stroma (more than 50% of the area) in at least one section.

(7)

Neutrophil Inflammation

1.2×10³ 9.0×10³ 6.0×10³ 3.0×10³ 0

P value 0.1726 IL 18Bpa

Grade 1 Grade 2

3.0×10³

2.0×10³

1.0×10³

0

Grade 1 Grade 2

1.2×10³ 5.0×10³ 4.0×10³ 3.0×10³ 0

Grade 1 Grade 2

1.2×10³ 5.0×10³ 4.0×10³ 3.0×10³ 0

P value 0.0177 GITR

Grade 1 Grade 2

1.5×10³ 1.2×10³ 3.0×10³ 4.0×10³ 0

P value 0.0594 ENA78

Grade 1 Grade 2

5.0×10³ 4.0×10³

3.0×10³ 2.0×10³

0

P value 0.0042 ICAM-1

Grade 1 Grade 2 1.0×10³

3.0×10³

2.0×10³

1.0×10³

0

P value 0.0554 NT-3

Grade 1 Grade 2

1.0×10³ 7.5×10³ 5.0×10³ 2.5×10³ 0

P value 0.0730 HGF

Grade 1 Grade 2

Grade 1: n=22, Grade 2: n=15

Fig. 3. Relationship between cytokine levels and neutrophil inflammation. IL17, GITR, and ICAM-1 were significantly associated

with grade 2 inflammation (p<0.05).

(8)

Macrophage Inflammation

1.2×10³ 9.0×10³ 6.0×10³ 3.0×10³ 0

Grade 1 Grade 2

3.0×10³

2.0×10³

1.0×10³

0

Grade 1 Grade 2

1.2×10³ 9.0×10³ 6.0×10³ 3.0×10³ 0

Grade 1 Grade 2

1.2×10³ 5.0×10³ 4.0×10³ 3.0×10³ 0

P value 0.4581 GITR

Grade 1 Grade 2

1.5×10³ 1.2×10³ 3.0×10³ 4.0×10³ 0

Grade 1 Grade 2

5.0×10³ 4.0×10³ 3.0×10³ 2.0×10³

0

6.0×10³

3.0×10³

2.0×10³

1.0×10³

0

P value 0.0554 NT-3

Grade 1 Grade 2

1.0×10³ 7.5×10³ 5.0×10³ 2.5×10³ 0

P value 0.4719 HGF

Grade 1 Grade 2

Fig. 4. Relationship between cytokine levels and macrophage inflammation. No cytokine was significantly elevated ingrade 2 versus

grade1 inflammation.

(9)

Lymphocyte Inflammation

1.2×10³ 9.0×10³ 6.0×10³ 3.0×10³ 0

Grade 1 Grade 2

3.0×10³

2.0×10³

1.0×10³

0

Grade 1 Grade 2

9.0×10³ 6.0×10³ 3.0×10³ 0

Grade 1 Grade 2

1.2×10³ 5.0×10³ 4.0×10³ 3.0×10³ 0

P value 0.0147 GITR

Grade 1 Grade 2

1.5×10³ 1.0×10³ 0.5×10³ 0

Grade 1 Grade 2

4.0×10³

2.0×10³

0

3.0×10³

2.0×10³

1.0×10³

0

P value 0.1127 NT-3

Grade 1 Grade 2

9.0×10³ 6.0×10³

3.0×10³

0

P value 0.8853 HGF

Grade 1 Grade 2

Fig. 5. Relationship between cytokine levels and lymphocyte inflammation. IL18Bpa, IL17, GITR, and ICAM-1 were significantly

elevated in grade 2 lymphocytic inflammation (p<0.05).

(10)

고 찰

전립선은 citric acid, polyamines, 아연, 싸이토카인 들을 포함하는 많은 물질들을 분비한다. 싸이토카인 들은 림프구, 대식세포, 비만세포 그리고 또한 전립 선 상피세포와 간질세포에 의해 분비된다.

^9-11

최근 에는 싸이토카인들이 전립선 염증, 암 발생, 암의 진 행에서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다.

^9,12,13

이 번 연구에서는 처음으로 전립선암 조직에서 나오는 전립선액의 싸이토카인의 프로파일을 기술했다. 전립 선액에 존재하는 싸이토카인들에 대해 잘 이해하게 되면, 전립선 염증, 전립선암 발생과 진행의 전립선 싸이토카인 망 (network)의 의미를 이해하는 데 도움 이 될 것이고 획기적으로 암을 발견하는 전략을 찾 을 수 있을 것이다.

처음에는 최소 암을 가진 전립선 검체와 비교하여 광범위 암을 가진 전립선 검체에서 얻어진 전립선액 으로부터 가장 많은 싸이토카인들의 목록을 만들고 정렬을 통해 전립선 싸이토카인들을 연구했다. 광범 위 침윤을 가진 경우에서 가장 증가된 싸이토카인들 중 HGF, IL18Bpa, ICAM-1, IL17, NT-3, IL12, GITR, ENA78을 선택했고 좀 더 정량적인 측정을 위해 ELISA 를 이용했다. 이 싸이토카인들은 암과 염증과의 관련 경로에서 알려진 역할 때문에 증가된 싸이토카인들 로부터 선택되었다.

HGF는 전립선암의 진행, 침윤, 전이에서 중요하다 는 것이 밝혀졌다.

¹⁴

IL18Bpa와 IL-12는 Th1 면역반 응에 관련되어 있다.

^15,16

IL-12는 IFN-r의 강력한 생 산자인 T도움세포의 분화를 책임지는 주요 싸이토카 인이다.

¹⁵

IL18Bpa는 염증과 면역 반응에서 중요한 역할을 하며 항암작용을 갖는 IL-18의 강력한 억제 자이다. ICAM-1은 백혈구, 상피세포, 내피세포, 종 양에 의해 발현되며, 새로운 혈관생성을 자극하며,

¹⁷

암을 가진 환자의 혈청에서 증가된다.

¹⁸

IL-17은 전- 염증 (pro-inflammatory) 싸이토카인이다. 이는 자가 면역과 알러지 반응을 발생에 중요한 역할을 하며, Th17로부터 IL17의 발현은 종양 빈도와 성장을 조 장하는 IL23에 의해 자극되어진다.

¹⁹

NT-3은 호중성 백혈구 (neurotrophil)의 한 종류이며 전립선암 조직

의 전립선 상피세포와 간질세포들에서는 발현되지만 양성 전립선 조직에서는 발현하지 않는다.

¹⁰

GITR 은 활성화된 T세포과 NK세포뿐 아니라 T조절세포 (Treg)로부터 발현된다. 단핵세포, 대식세포, 섬유아 세포, 내피세포, 여러 종류의 상피세포에 의해 생산 되는 ENA-78은 chemokine의 CXC family 중의 한 구 성원이며 암에서 혈관생성 요소로뿐 아니라 강력한 chemoattractant와 호중구 기능의 활성화제로써 역할 을 한다.

^20,21

이 연구의 싸이토카인 항체 array 부분에서, 전립

선액의 HGF는 ELISA에 의해 통계적으로 확증된 광

범위 암에서 가장 증가된 싸이토카인이다. 다양한 조

직으로부터 유도될 수 있는 HGF는 전이성 전립선암을

가진 남성의 혈청에서 증가되는 것으로 알려졌다.

²²

전립선에서 간질 세포들은 HGF를 분비하며, HGF

는 수용체인 tyrosine kinase c-Met를 발현하는 전립

선 상피세포에 국소적으로 작용한다. 전립선암 또

한 간질 세포로부터 유도되는 IL-1β, PDGF, bFGF,

VEGF, EGF에의한 자극을 통해 HGF를 발현한다.

²³

c-Met phosphorylation에 이차적으로 일어나는 세포내의

단계적 반응들은 pro-mitogenic, antiapoptotic 특성과

발생학적 세포 이동에 대한 작용을 포함하는 HGF의

대부분의 작용에 책임이 있는 것으로 보인다. HGF

의 변화나 c-Met 수준은 암 진행과 연관된 이러한

또는 다른 생물학적 경로에 영향을 미칠 수 있다.

¹⁴

전립선액 HGF와 IL-18Bpa 수준은 종양 크기와

연관이 있는 반면, 전립선액 IL-18Bpa, IL17, GITR,

ICAM-1 수준은 염증과 상관관계가 있었다. 이러한

결과들은 위의 싸이토카인들이 아마도 전립선 내강

(호중구) 또는 상피세포 lining 또는 간질 (림프구)의

특이 면역 세포에 의해 조절되고 유리되는 것을 시사

하는 것일 것이다. 사실 IL17은 염증이 있는 장소로

호중구을 끌어들이는 싸이토카인의 생산을 자극하는

독특한 T세포인 Th17에 의해 발현되어진다.

²⁴

호중

구는 상피세포 lining을 건너기 위해 상피세포에 있는

ICAM-1을 이용한다.

²⁵

그리고 ICAM-1 또한 IL17에

의해 유도되는 싸이토카인들 중 하나이다.

²⁴

이러한

싸이토카인들 중에서 IL18Bpa와 GITR은 아마도 암 시

작 또는 진행과 관련된 전립선 염증의 새로운 표지

자일 것이다. 중요한 것은, 이 연구에서 IL18Bpa는

(11)

암과 염증 상태 양쪽과 다 상관관계가 있다는 것이다.

IL18은 다양한 감염원에 대한 숙주 반응에서 중 요한 역할을 하지만, IL18의 과다생산은 자가면역질 환과 염증조직손상을 일으킨다.

²⁶

단핵세포와 NK세 포로부터 IL18Bpa의 분비는 IL12와 interferon gamma 에 의해 유발되고 IL18Bpa는 IL18에 의해 유발되는 염증반응을 제한한다.

²⁷

IL18Bpa는 또한 interferon gamma 자극 후에 대장암 세포에 의해서도 분비된 다.

²⁸

이것은 또한 전립선암 세포 스스로 염증이 있을 때 싸이토카인으로부터 유래된 림프구에 의한 자극에 의해 IL18Bpa를 분비할 것이라는 점을 시사한다.

IL18Bpa는 항종양 싸이토카인 IL-18을 억제하기 때 문에 전립선암 조직에서 IL18Bpa이 발견되는 것은 면역 감시를 피하기 위한 종양의 저항을 보여주며 아마도 나쁜 예후와 관련되어 있을 것이다.

GITR은 T세포를 공통자극하며 Treg의 억제를 없 앤다.

²⁹

그리고 NK세포 항종양 면역을 줄인다.

³⁰

GITR 은 또한 호중구 침윤과 상관관계가 있다. GITR-/-생 쥐에서 관절염 영역에 호중구 침윤은 GITR+/+생쥐 보다 현저하게 줄었다.

³¹

반면, GITR 발현 Treg은 정 상 조직에서 강력한 항균성 면역 반응에 의해 일어 나는 주위 조직의 손상을 제한하게 돕는다.

³²

Treg 세포는 인간의 고형암에서 증가하고, 증가된 Treg 세 포의 수는 나쁜 예후와 관련이 있다.

³³

염증에 의해 유도된 GITR의 증가는 항종양 면역을 억제하는 Treg 의 증가와 연관이 있을 것이다.

이 연구에서 특정 싸이토카인 (ICAM-1과 GITR, ICAM-1과 ENA78, GITR과 NT-3)의 발현 수준 사 이에서 강한 상관관계를 찾아냈다. ENA-78은 호중 구를 강력하게 끌어들이며, 염증이 있는 곳의 혈관 벽 또는 상피세포에 호중구의 부착은 ICAM-1을 통 해 발생한다.

³⁴

조절성 T세포나 NK세포 같은 GITR 발현세포들이 전립선암 세포 상에서 NT-3나 ICAM-1 의 발현을 자극할 가능성이 있다. GITR 발현세포들 이 또한 ICAM-1 과/또는 NT-3을 발현할 것이다. 이 러한 싸이토카인의 쌍들의 상관관계에 대한 이유에 대해서는 추가연구가 필요할 것이다.

이번 연구의 한계는 양성인 전립선으로부터 얻은 전립선액내 싸이토카인들의 프로파일을 평가하지 않았다는 것이다. 그 이유는 근치적전립선적출술이

전립선암이 없는 환자에게는 시행되지 않았기 때문 이다. 병리학적으로 전립선암이 아닌 남성들의 근치 적방광전립선적출술의 경우로부터 유래된 전립선액 내의 싸이토카인 프로파일을 분석하려고 하였으나 정의에 의해 이러한 남성들은 전립선 주위에 고등 급 그리고/또는 근육-침윤 방광암을 가지고 있었고, 이는 요상피세포암 (전립선 요도에도 존재할 수 있 는)과 관련이 있는 싸이토카인들의 프로파일과 구별 하는데 어려움을 주었다. 이 연구에서는 그런 환자들 을 선택하는 대신 최소 전립선암 (M)을 가진 경우들 과 광범위 전립선암 (E)를 가진 경우를 비교하였다.

흥미롭게도, M 그룹의 한 경우에서는 조직검사로 전립선암을 진단받았으나 intensive re-sectioning에도 불구하고 근치적전립선적출술 표본에서는 암이 발견 되지 않았다. 이 경우가 전립선암에 대해 완전히 음 성인 대조군이라고 할 수는 없지만, 이 경우의 ELISA 에 의한 전립선액의 분석은 M군의 평균 자료와 비 교해서 유의한 차이를 보여주지 않았다. 게다가 전 립선비대증의 대용으로 표본 무게를 조절했을 때, 모든 경우에서 싸이토카인들의 수준에서 의미 있는 차이점을 발견할 수 없었다. 근치적수술을 통해 전 체 전립선을 얻은 이번 연구에서 분석된 전립선액 들의 근원으로 근치적전립선적출술 검체들을 사용 하는 이점은 암과 염증에 대해 전체 전립선을 검사 할 수 있다는 점이다. 비록 분석된 최소 전립선암들 의 대부분이 (한 경우가 예외) 암을 가지고 있었지 만, 암의 양이 적다 (<15mm

²

)는 것을 확실하였다.

그러므로 이번 연구에서 기술한 싸이토카인들의 프 로파일이 조기, 최소 암들과 말기, 광범위 암들과의 차이점과 관련된 전립선의 염증 상태에 관해서 개 략적이나마 윤곽을 그렸다고 판단한다.

결 론

본 연구의 싸이토카인 자료들이 전립선에서 싸이

토카인 망 (networks), paracrine 자극 경로, 종양생성

을 연구하는 사람들에게 도움이 되는 정보를 주길

희망한다. HGF와 IL18Bpa는 광범위 전립선암 환자

로부터 추출된 전립선액에서 상승되어 있었다. IL17,

GITR, ICAM-1, IL-18Bpa는 전립선 내강 내에 호중구

(12)

염증 소견을 보이는 표본에서 추출된 전립선액에서 상승되어 있었고, IL18Bpa, IL17, GITR, ICAM-1 전 립선 간질 내에 림프구 염증 소견을 보이는 표본에 서 추출된 전립선액에서 상승되어 있었다. 이러한 싸 이토카인들과 다른 싸이토카인들은 조기 암 발견, 예후 평가 노력에서, ex vivo에서 얻어진 전립선액만 이 아니라 정상 남성의 전립선에서 얻어진 EPS나 직 장수지검사 후 소변에서 얻어진 전립선액들도 유용 한 것으로 생각한다.

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◈ 저자 논평 ◈

본 논문은 최근 들어 전립선암과 염증과의 관련 성에 대해 진행되고 있는 여러 연구 중에서 전립선 암이 염증과 관련되어 어떠한 관계를 가지는지 새 로운 정보를 알려주고 있으며 인간의 면역체계 내 에서 전립선암세포의 생존과 싸이토카인들간의 관 계에 대한 중요한 의미를 주는 연구라고 생각한다.