vi RNA - In Situ viral RNA

임상병리검사과학회지

:

1998.

Unicryl

In Situ Hybridization Rabbit hemorrhagic disease viral RNA

광주보건대학 임상병리과

;ζ

-r

In Situ Hybridization for light and electron microscope using unicryl block

- Identification of Ra bbit heIOOrrhagic

vi ra1 RNA -

Joo , Kyeng Woong

De partment 01 CHnical pathology Kwang-ju Health college,

Korea

Rab bit heImrr hagic

wbich was frrst

in China in 1 ffi4 spread via

Eas따n 퍼n다le

to many countries of

and other

of the world.

Thi s study is ^PJI1X) sed to detection of RHD

RNA by In situ

as

뾰 따lIIUlI1ohistoc밟ni떠1

technique on

of

hemagglutinin inhibition

and changes

innoculation of rabbits with isolates of RHDV

from RHD

æll.

A旅표· 잉q:airæn떠1 intramusc버따

infections with isolates of the virus, Inf ection were

100최

acute RHD

showed

and

bl <XXl y or

nasa1

of all cases show SO Ire fever sho rt1 y before death.

In OI바~

to

to RHDV, the hemagglutinin inhibition tes t. animal wbich survived an infection

RHDV

to RHDV, wbich

highly

dec떠ble

at 12 hours after IX> st infection these antitxxly

the highest on 48 hours

in

liver

infection were detected of

h없Pπ뼈ges. dE휠enerative 없ilob버않 al따빼ons

in

strongly

or Pll e

cytopla sm,

pyknosis ,

of karyolysis were observ ed.

Anti빼ies

to RHDV

found in

that

the existenæ of an pathogenic

wbich is related to RHDV

Simple

and light

ISH

possible using

to the

post-uniαyl err따빼어

block for electron

ISH

it was established

corr뼈I어

m

focal

at

for detætion of

RNA in

using

84ba똥s oligonucl∞tide

probes labelled by

cyanæthyl with 4717-- 4æ)

of RI-ID V

πle

best results were

to retention

acæssibility of RI-ID V in 0. (0)/0

of ædehyde group by

resin block and block stain, biotinylated

acetylation, hybridization dtning 2 hours at '51

C and signæ marked by antibiotin

ISH

signæ on light

in situ hybridization on serni -thick sections of norrnal ælls

liver using

It

as if indicate the

of RIID

nu c1 eic acids by showed gold

the cvtoolasrn of

of sudden

ælls are easily nucleus and cen tra1 vacuoles. But , The light

ISH were not showed to positive reaction be::a use of

of resolving power of light

and

At the electron

IS H, RI-ID

RNA was

widelv in the liver æll. Go ld

were

of irmer and outer

with destruction of the rrembrane , and dilatation of rough endoplasrnic reticulum in the æll.

Many

RNA gold puticles are present in the

cytoplasm and in the vicinity of rER of na tura1

of sudden death and

of virus

are

the

Kev words : Rabbit hemorrhagic disease virus , Unicrv l. In situ hvbridization , Oligonucleotide probes. Acetvlation , Biotin , Electron microscope.

1. 서 론

토끼 출혈증 바이 러스(rabbit

hermrrhagic dis-

ease; 이하 따ID로 약기함)는 1004년 중국에서 최 초로 발견되었다 우리 나라에서도 같은 질환이

보고되었으며 2 1~년 12월 중국산 냉동육에 의 해서 멕시코에서 각각 발병되었고 3 19.X>년 유럽 여러 나라 4 세계 여러 나라에서도 보고되었다.

따표〕 찌rus( 이하 RI-IDV로 약기함)는 초기에

picomavirus , 5

like

밀도 등 바이러스의 분자생물학적인 자료에서

2

7-40nm정도의 떠lici、rinís(35--40nm)로 증명되었 다 많E는 보통 과급성(않àcute) 또는 급성 (acute)으로 감염된다. 과급성 따표〕에서는 폐사되 기 전에 임상증상이 불분명하거나 나타나지 않지 만， 급성 많ID에서는 식욕 감퇴， 무감각， 빈호홉，

경련， 머리의 후방염좌(torsion) ， 부전마비 등을

일으키며， 때로는 비강출혈 또는 혈성 포말 그리 고 죽기 전에 짧은 기간의 체온 상승을 나타낸 다 8 비강이나 근육을 통한 접종실험에서 대부분 접종 후 48--72시간에 폐사하지만 때때로 8일 후 또는 수주 후에 폐사하는 경우도 었다. 현재까지

RI-IDV의 기본 성상 병리학적 특성 9 임상화학적 특성 10 예방 목적의 백신 11 적혈구응집 및 응집억 제 반웅12등이 보고된 바 있다. 따IDV의

geno ^rn::!

은

polyrærase

poly

완전하게 증명되어 13 분자생물학적인 확인 검출이 가능하게 되었다.

In situ

John

hybridization

의 선택 등에 따라 그 결과에 많은 차이가 나타 난다고 제시되어 졌다. 본 실험의 현미경적

ISH

는 포매 후 방법(IX>St-em빼ing rreth여)을 응 용하였다 16 본 실험에서는 현미경적 ISH를 이용 한 RHDV의 증명을 위하여

RHDV

block

으로 제작하여 하나의 block에서 3개의 절편올 만들어

1% toluidine blue

11

1.

본 실험 토끼는 몸무게 2.7:!:O.3kg정도의 건강 한 4-5개월령의

Newzealand

inhibition

m

라 약기함)을 시행한 후 성별과 관계없이 항체가 음성인 개체만을 실험군으로 사용하였다.

본 질병으로 폐사한 토끼로부터 얻은 간 재료 를 토끼에 3대 계대 후 3대째 폐사한 것의 간올 접종 재료로 사용하였다. 이 간장 조직올 f웰lks’

æs(없ricillin

G 100U,

sulfate 0.1

mg, gentamycin

0. <Emg,

B

2.5μwmR" S핑rm)올 사용하여 比m땅없찮(BiOSIE 74(05)로 균질화하여

10%(W !V)

æntrifuge( Hi tachi H1l\1A C SCR 2DBA,

ll00 ^{X g}

1% BSA- Pffi(1%

O.OlM

O.ffi%

pH

7.2)를 사용하여 용해된 유제 5mL를 2flO/o가 되도 록 희석시킨 후， 전체의 반을 비trafiltra디on

rre-

였다.

접종 유제의 적혈구 웅집반웅은17 00공

micro-

plate(U형， comi때)를 사용하여 뻐 7.2의

1%

BSA-PBS

25μL를 2배 계단 희석하였다. 여기에

0.5%(V !V)

의 O형 사람적혈구액 2) μL를 가하여 실온에 정 치 후 대조군의 적혈구가 가라앉은 다음 판정된 접종 재료의 밟naggl따inin 역가는 1:64였고， 4마 리의 토끼 대퇴부 근육내 강마 주사 후에 사육시 켰다. 급여 사료는 토끼의 전용 사료(프리나-펠레 트， 프리나코리아)를 이용하였고， 물은 수돗물로 공급하였다.

음성대조군(r쩔a디ve ∞ntrol; 이하 N으로 약기 함)은 농장에서 운반된 즉시 채혈과 장기를 절취 하여 실험재료로 사용하였다. 또한， 따IDV에 감 염되었다고 예상되눈접종 후 자연 폐사핸natura1 S따뼈표1

death

inoculation;

1%

toluidine blue

0.02%

2. Oligonucleotide probes

Greg or

cD NA 7 4'r1

bases (Fig.

oligonucleotide

DNA sy-

nthesi앙(OUGHmM，

BACKMAN,

5 ’

85

fre-

Quency

복하였다. Purine과 pyrimidine의 비는 48:36으로，

rmlecular

uv

sp:ctrophotoræ따(SCANSl45) 에서

to ^ta1 OD

1. 2

nrmle이 였다'. Olignucleo디des를

biotin-cyanoethyl

Ph ospho rarrlÍ dite(ABI & Phannac ia

phosphoarnidite

DNA

4711 AACTC CATTT GTCAT TGGTT ^GCπT GGTCC 4740

Ol-Æ때

: 3 ’ - TAAA CAGTA ACCAA CGAAA CCAGG 4741 GCAGC αìm‘ ACAAG T C1‘ TG TG C1‘ G 때Aπ’ 4770

C:GTCG GC뼈A TGTTC A없AC ACGAC TTTAA 4771 GGCTT ACACT GC1‘ CC

GTACG AGGAC 4800

C℃패A TGTGA CGAGG TTGGA CATGC TCCTG - 5 (Complenentary to posi tion 4717-4800b)

Fi g. 1. Oligonucleotide

for in situ hybr- idization of light & electron

on cDNA

of rabbit

agic disease vi ra1 RNA

N과 An의 간장 조직을

1mm

4%

며raforrnal따1Yde와 O.따% glutara1dehyde로

4

C

에서 24시간 후고정한 후 cao여ylate 완충액으로 세척하였다. 그리고

1% amrmnium

2<>/0 uranyl

block

resin(Bio

24

시간， 자외선 램프에 노출시켜 중합하였다.

5. 1% Toluidine blue

초박절기(버tramiα"Otoræ; LKHl없"

Brorrnna,

rmnomer

5 ’

semi-thick

slide

cyanæthyl

10

slide

1% toluidine

따의

1 x 1E

Tris-HCl , pH 7.5;1 blue 1

mM

hybridization

였다.

6.

in Situ Hybridization 3. Hemagglutinin inhibition test

1% toluidine blue

block

접종 전， 후 항체생성 유무와 정도， ISH를 위한 에서 초박절기로 1μm의 두께로 였미-thick 뚱해- 재료 션태을 하기 위하여 따IDV의 때 항체가를 ons하여

poly-L

pH

1% BSA-PBS

액 2)따씩 분주한 다음에 혈청 2)뼈를 2배 단계

in

0.01M triethanol-amine-HCl , pH 8. 0) 16

HA

buffer + glycine + 10% oovine

15

난 후 0.5%(VN)의 O형 적혈구 정μM씩을 가하고 분간씩 2회 반응시켰다. 증류수로 5분간 행군 후，

대조군의 적혈구가 가라앉은 다음 항체가를 판정 다시 PBS로 5분 세척하고 공기 건조시켰다.

하였다. 음성 대조는

1%

Oligonu-

hybridiz- ation

tRNA 1%

sahnon spenn DNA

5)%

사용하였다 fonnamide

in 4 ^X standard

hybridiza- tion

4. Unicryl embedding block

,

rubber

æ~nt로 봉입하였다. 가 mL당 200ng이 포함된

hybridization

rnoist

sa1mo n spenn DNA

간 실시하였다.

Hybridization

100jl g!mL

fonnamide in 4 X standard

제거하고 여분의 probe를 제거하기 위하여 슬라 S여ium citrate)을 제조하고， 이

hybridization

biotin

sterile

&따피m을 시행하였다. 표본을

0 .1%

rnoist cha- serum

5% nonnal

Moist

4

(TBS;았메1:

Tris-HCl pH 8.2 , 0.9% NaCl ,

100 /0

1: 2)

10nm gold

Ii fe

Sciences) 이 결합된 염소

antibiotin

O .1 M

Pro tein

1%

O .1 M caco-

φlate buffer로 5분간씩 3회 세척하고， 증류수에 서 10분간 수세하였다. 대조 염색은

1% borate

수용액으로 희석한

1% toluidine

7.

in Situ Hybridization

1% toluidine blue

00

^JX) lyvinyl fonnal

chlorofonn

표본을 때여ion-carbon이 코팅된 grid에 부착하

Xstandard

fonna- mide

로 평형을 유지시켰다.

Hybridization

biotin det-

때on φ따::01을 시행하였다. 표본을

0 .1% bovine

serum

5% nonnal

혈청 (TBS;았nM

Tris-HCl pH 8.2 , 0.9% NaCl ,

빠메1: NaN3)으로 덮어 $분간 반응시켰다. 그리 고

100 /0

1:25

10nm gold partic1 es(Auro Pro be On e , Janssen Life

Scienæs) 이 결합된 염 소

antibiotin

반응 후 ffiB로 5분간씩 3회 세척하고

O .l M

cac때late buffer로 5분간씩 3회 시행하여 신호 를 증강시켰다.

Pro tein

1%

O .l M cacodylate

증류수에서 10분간 수세하였다.

대조 염색은

3% uranyl

lead

C x,

川. 성 적

여， hybridiza:디m전에 절편은 10분간 왔tyl화{0.7 출혈성 질병을 일으키는 토끼 출혈증 바이러스

mL

anhydride in EOOmL O.OlM triethanol

-amine-HCl , pH

1% toluidine blue

probes

Fig. 2. In situ hybridization

on light

in situ hybridization using

bio디nylated

probe on semi-thick

there is no definitively positive gold signal in the nonnal and

(a) Negative rontrol of liver æll. (b)

as

피{e 、rirus 탱rtic1es sugges뼈:l

the

of RHDV ,

in the case of sudden

&월'th.

Th e wash-out nudeous, and

v) &

rmnonudear æll (rrm) in cytoplasm are found in the

æl l. C,cytoplas rr1 H, hemorrhage;

M，rmnonud않r

æll; N , nudeus;

W , wash out nudeous (a)

(b)

An;natural sudden death

inoculation. lEOO ^x

T a bl e 1. Distributions of æll

change and in situ hybridization signa1 on light and electron

rontrol; An(natura1

death after

꿇않r light microscopic ISH electron microscopic ISH

cell morpholgy * I ISH signa l** ultrastructure * ISH signa l**

N +

An ⁺⁺

* +++: >7CP /o ælls with visible abnonnal structure

++ : >!j)O/O ælls with visible abnonnal structure + : lO -fÐ% 떠1s with visible abnonnal structure ::t : <lCP /o c머Is with visible abnonnal structure

- : abnonnal 띠없structures are r쩔ative

-

+ ++

**+++: >7CP /o 따1s with visible gold 끼ra1 며rtic1es ++ : >!j)O/O ælls with visible gold 찌ra1 뼈rtic1es

- +

+ : lQ -fi)% c머1s with visible gold 꺼ra1 뼈tic1es

::t : <lCP /o c머Is with visible gold 끼ra1 따tic1es

- : all 따1s are r쩔a디ve

1. Hemagglutinin inhibition titer

실험에 사용하기 전에 음성군과 접종군 모두의

m

2. 1% Toluidine blue

간세포의 변성， 혈관 주위에 단핵세포 침윤 둥 이 보였으며， 특히 폐사한 경우-접종 후 21시간과 41시것!-에서의 출혈과 충혈 및 괴사가 심하게 나 타나 있었다.

3.

in Situ Hybridization

음성대조군(N)에서는 황금 입자가 보이지 않았 다'. An군 간세포의 변성 세포질에서도 미립자 형 태의 양성 신호를 확인할 수 없었으나， 바이러스 입자가 존재할 때만 보이는 중앙 공포률 확인할 수 었었으며，

1%

blue

2 , Table 1).

4.

in Situ Hybridization

접종토끼(An)에서 간조직의 파괴된 동양혈관

(sinusoid)

RlID

RNA

viral RNA

RNA

like

함께 간세포의 세포질 내에 산재 또는 집단올 이 루기도 하였다(Fig.

3).

N. 고 찰

RlIDV로 폐사한 토끼의 간조직으로 부터 추출

한

virus

H

와

1% toluidine blue

ISH

파IDV에 감염된 토끼의 급성 임상증상은 식욕 불량， 무감각， 빈호홉

,

4O .8 i: O.83

38.6-40 .1

III

행버a디on;DIC)올 일으키는 RHD냄에 있어서 많 은 량의 혈소판 소모로 이러한 현상이 일어나는 것으로 사료된다'.

III

1%

blue

본 실험은 전자현미경 ISH를 주목적으로 실시 하면서， 동일표본상에서 resi앤로 포매된 절편에 서 광학현미경 ISH를 병행하여 시행하였다. 현미 경적 ISH는 세포 미세구조의 보존뿐만 아니라

훌

’

쌓

* .

Fig. 3. Gold partic1 es signal on electron

in situ hybridization of

æ l1s

ernbec뼈ed

in

and

probeS. (a) Negative control of

h홈빼c

æll. (b)

gold

The destruction of the ræmbrane results in

se{m"a tion of inner and outer

Rough endoplasmic reti cu1 um in (b)

showed

1ber e are many viral RNA gold

in the juxtanu c1 ear cytoplasm

in

vicinity of rough

of sudden

and clusters of virus like

are

in the cytoplasm C , cytoplasm

endoplasmic

M, mitochondria; N , nucleus;

rærnbrane;

(a)

control of

(b) An (natural

12.crox

hybridization의 신호를 높이기 위해서는 핵산의 보존과 hybridization의 접근능이 가장 중요하다 고 생각된다. 이러한 목적을 달성하기 위해서는 일반적으로 고정방법， 포때방법， 전처리，

hybrid-

iza'디on에서의 처리 방법이나 과정이 영향을 주는 주요항목들이다.

일반적으로 광학현미경 ISH는 뼈affm sec디ons 하여

avidin-biotin peroxidase

위한 uniαyl 표본의

thick

antibiotin

ISH

는 개선된 연구가 필요함을 느꼈다. 광학 현미경

으로 조직 내에서 분자생물학적 증명을 위해서는 우선 세포의 보폰이 잘되어야 한다. 그러나 낮은 농도의 glutaraI뼈lyde 고정과 함께 uniαyl 표본 은 세포 구조의 변형으로 인하여 판독하는데 어 려움이 따랐다. 본 실험을 통하여 확인하였던 바

Troxler

잘 보존하는 고정제나 포매제의 사용 없이는 증 명하기가 어렵다는 것올 확인할 수 있었다.

RHDV에 감염된 간 조직에서 uniαyl로 후 포 매한 block올

thin

RNA의 변성， hybri바zation，

probe

조직의 고정에 사용되는 고정액은 전자현미경 관찰을 위한 첫 단계이므로 대단히 중요하고 전 자현미경 ISH의 장점인 세포내 소기관의 형태를 관찰할 수 있는가 하는 점을 결정하게 된다.

RNA

Binder

ISH

를 하기 위한 조직에서는 양성 결과를 얻을 수 없기 때문에 사용하지 않는다고 한다.21 본 실험 에서는

o ^, æo ^/Ó

본 실험에서는 보통

3 ’

5’

biotin-cyanæ- thyl

Uniαγl은 새로운 aαyl resin으로 광학 및 전자

현미경 검색을 위하여 최근에 개발된 포매제이다.

이 resin은 친수성이 높고 균질성의 구조를 지니 고 있어， 특히 전자현미경 관찰에 좋은 결과를 얻 을 수 있다고 한다 22 본 연구에서도 좋은 결과를 얻을 수 있었고 배경염색의 정도가 낮았으며，

block의 경도도 높아 초박절편 제작이 용이하였 다.

본 연구에서는 열변성이나 hybridization의 시 간 조절로 hybri버za'디on능이 증강되는 지를 알아 보기 위하여 온도를

37t , 45

C ,

!:xrc

1 6, 19 ,:Ð,Z3

hybridization

hybridization

Hyb뼈zation이 완성된 후 probe의 신호를 증 명하는 방법으로 DNA나

RNA

훨씬 높다고 하였다.낌 본 실험에서도 antibiotin의

사용으로 현저히 개선된 감도와 비특이 신호를 줄일 수 있었다. 황금 표지의 손실을 최소화하기 위해서는

1%

3%

uranyl

37t

에서 7분， 1뼈 hydro잉&어11 3분간 염색하였다 18

황금 과립 관찰시 주변 조직과의 감별이 용이하 였으며， 10，αP배 배율에서도 과립을 인지할 수 있었다. 여분의 αube를 제거한 후 배경 염색을 줄이기 위하여 정상 염소 혈청을 사용하여 배경 염색이 나타나지 않았다.

ISH

또한 virion과 크기와 형태가 비슷

rus like

pnticles(VI묘)을 볼 수 있어 RHDV의 검출올 더욱 명확하게 할 수 있었다.

V.

본 연구의 목적으로 따표〕 병인체를 증명하기 위하여 앵동 보관된

RHDV

1.

antibiotin

gold

의 크기와 배율의 한계로 인하여 양성반응을 확 인하기가 어려웠지만"

RHDV

2.

virus like

viral RNA

3.

ehyde로의 고정，

arrnmnium

a1 dehyde

block

block

양호한 미세구조 보존과 RNA를 유지하였다.

H-

ybridization

hybridization,

본 연구 논문은 1900년도 광주보건대학 학술연 구비 지원에 의하여 수행되었음올 밝협니다.

참고문헌

1. Liu , Sj.; Xue , H.P. , B , Q. , Qian , N , H.A. A new viral

in rabbits(in chinese) C1lÚ m Husb Vet Med 16 ,

2.

1987.

3. Gregg,D.A House,C. Necrotic hepatitis of rabbits on

a parvovirus , Vet Rec 125 ,

4. Fuller H.E. Chasey D.; Lucas M.H.;

Gibbens j.C. Rabbit

in the united

Vet Rec 133 , 611 ,

1앉웠.

5. ^An, S.H

Song,j.D.;

Kwon, Y. B.; jung,j. S;

on picornavirus h aem> rrhagic

narre) in rabbits.

pro ^{:e- rties of the causative VÎIUs. Res

3) :ffi-61 , 1 ffi8.

6. X u, W. Y.

in r- abbits: a review. Rev sci Te ch. clf lnt

마'iz10， 않)3-4æ，

199 1.

7.

Weiland,F.

Die infektiose

krankheit

kaninchen-eine durch

verur-

sachte

Tieraerztl. Ums ch. 44,

284-잃4， 1쨌.

8. Xu Z.]. , Chen W.X. Vet Res corrunun 13 , 2ffi-212 ,

g

,

1931.

robes and

A-gold

J Ce ll Biol 102 , 1646-1653 ,

17.

^]. L Application of a microtechnique

m

investtigations. ]. I mm- unol æ , 3'æ, 1 æ2.

1α

Ca o 5.z., Liu 5.G., Gan MH et al. A

Troxler M ,

L , Egger D.,

on

In situ hybridization for light

narre) in rabbits. Oú nese electron microscopy: a

of the

JαJTTrJl

q Veteri rr:uy Medicine 1 2( 4) , 9-11 ,

for

of viral RNA

1~.

using

DNA

RNA prubes. J

1 1. Wei ].5., Yu N.5., Yang Y.F. et al.

Me tJvds :1), 1-14,

gation on a

disease in 19. La wrenæ ].B. , 5inger RH

an- rabbit in Yunnam

Oú nese

a1 ysis of in situ hybridization

for Veterimry Sci ence

Tednology 8 ,

of actin gene

2)- 24,

Nucleic Acid Res 13,

12. Ruvæn-Clouet N.,

D., Andre-Fo- 20.

D.L , Frawart L ,

P.Y. Ult-

뼈ine

G., Ganiere ].P.

of mRNA

of the human

for rabbit for the EGF

in human breast æll

h짧mrr뼈gic 배웠se 끼ruS.

Res Virol 146 ,

line BT20 by in situ hybridization. J

33-41 ,

39( 1),

100 1.

13.

M ,

W., Heinz-jurgen T. 2 1. Wachtler F., Mosgoller W., Schwarzacher H Rabbit hermrrhagic

.G. Electron

in situ hybridiza- cloIÚng and

sequencing of a tion and

and ca1icivirusgenoræ. Virology 184 ,

of rRNA in human lymphocyte 100 1.

Exp. Ce ll Res 187, 346-348, 1900.

14. John HA ,

ML ,

K W. RNA- 22. Sca1 a c., Cenacc hi G.,

c.,

at

leve l. Natt.u-e G.,

P.,

G.c. A new

1009. resin

a useful tool for histology, 15. Ga1 1 ].G., Pardue ML Fonnation

cletec-

and

tion of RNA - DNA hybrid Irn lecules in investigations. J

40 ,

cytol<핑ica1 pr함g떠ons.

Proc Natl Amd 1 ’ 700-1004 , 1002.

Scil USAJ 63 ,

G.5., Warnke R

of end- 16. Binder M ,

5., Ro th ].,

M , Gehring W.]. In situ

at the electron

level: l oca1i zation of

tran앙따s

on ultrathin ^Sff: tions of

using biotinylated p-

ogenous

in tissues and relevance to biotin-avidin

sy-

S뼈E.

J

2), 11ffi-l3ìt,

100 1.