Line Probe Assay를 이 용한 Rifampicin 내 성 결핵균의 신속한 검출

(1)

임상병리검사과학회지 : 제 28권 제 1 호

1996.

Line Probe Assay를 이 용한 Rifampicin 내 성 결핵균의 신속한 검출

서울의과학연구소 · 서울임상병리검사센터 (SCL) 검은하·주은미·박영석·이규범

Rapid Detection of Rifampicin - Resistant Mycobacterium tuberculosis Using Line Probe Assay

Kim

,

Eun-Ha.

,

Joo

,

Eun-M

i.,

Park

,

Young-Su

k.,

Lee

,

Kyu-Pum

Se

oul Medical Scienæ Institute . Seoul Clinical Laboratories( SCL)

Control of tuberculosis are compromised by the increased frequency of multidrug - re- sistant strains of Mycobacterium tuberculosis(M. tuberculosis). Rifampicin is a key compo nent of therapeutic regimens. Resistance to rifampicin results from the substitution of a limited number of highly conserved amino acids encoded by rpo

β

the gene for the ß- subunit of the RNA polymerase. In present study , nested - PCR coupled line probe assay methods were used for rapid detection of rifampicin resistant strain in PCR positive samples with M. tuberculosis. In a total of 10 nested - PCR M. tuberculosis positive sam- ples

,

including 8 sputums

,

1 pleural fluid and 1 urine

,

three rifampicin resistant strains (30%) were detected. Among these, one mutation was found in Sl locus of rpo ß ^gene, and other two mutations were observed in coinfection state of S2/R5 loci and S4/R4a loci , respectively. This study shows that nested - PCR coupled line probe assay is a rela- tively simple , fast and practical tool for the detection rifampicin resistant M. tuberculosis strains in the routine clinical laboratory wor

^k.

Key words : Mycobacterium tubercu/osís. rifampicin resistant

, p이 ymerase

chain reaction

,

line probe assay

1 .

서 론

결핵은 1985년까지는 감소하는 추세였으나，

1991 년 이후 단일 결핵균에 의한 감염이 아닌 다약제 내성을 가진 균주가 출현하고， 후천성

면역 결핍증과 결핵의 동시 감염 등 선진국뿐 만 아니라 개발도상국에서도 크게 증가하고 있 다 8， 22) 최근， 감염증 분야에서 획기적인 진단 방법으로 널리 사용되고 있는 최신 분자생물학 적 기법인 중합효소연쇄반응 (PCR) 을 이용한

(2)

R4a

R2 R5

S2 ₅₄

SI S3 S5

511 513 516 518 _앓2 526 531 앓3

C AGC CAG CIG AGC ser Gln 낼앤 Ser 핸~ G멘 phe 빼t ~헬 TTC ATG GAC CAG Gln ~얀 핸!l Asn Pro Leu AAC CCG CTG TgG GGG TTG ACC 훌r GIy Leu Thr Q띤 땐 MG CGC CGA CTG Lys Arg Arg Leu 1윌 활 GCG. CIG GGG C 깨a 낼J，! GIy

Pro Leu V머 (de’) Leu Tyr Trp Pro

A~ Leu

Fig. 1. Wild - type nucleotide and aminoacid sequence of the relevant part of the rpo β

gene.

The positions involved in rifampicin - resistance inducing mutations are underlined. The oligonucleotide probes on the LiP A strips are indicated by horizontal bar.

결핵균 검출에 대한 보고가 다양한 방면에서 활발하게 이루어 지고 있다1. 2) 이 방법은 검체 에 포함된 결핵균 특정 DNA를 수백만 배 이 상 증폭시키는 것으로， 기존에 결핵균 검출을 위해 이용되어 왔던 여러 가지 방법보다 예민 도， 특이도가 월등히 높은 검출 방법이다. 또한 기본적으로 4---8주가 소요되는 결핵균 배양과 정을 거치지 않고 검체로부터 직접 균의 존재 유무를 검출 할 수 있는 신속한 임상실험실 진 단 기법으로서， 본 연구소에서도 이미 그 유용 성에 대해 보고한 바가 있다6.7) 이러한

PCR

반응을 이용하여 결핵균의 빠른 검출이 가능하 게 되었으나， 다약제 내성 검사는 아직까지 배 양법에 의존하고 있는 실정이다 9.14) 다약제 내 성균주의 대표적인 균주인

rifampicin

_{내성 결} 핵 균주는， 결핵균 치료를 위해 사용하는 중요 한 조기치료 항결핵제인

isoniazid

_{내성을 동반} 하므로， 임상에서

rifampicin

_{내성 결핵균을 조} 기에 정확히 검출하는 것은 매우 중요하나lOl9) ， 최근까지 임상검체에서 직접

rifampicin

_내성 결핵균을 검출한 보고는 많지 않다. 본 연구에

서는

2

차 중합효소 연쇄반응 (2차 PCR) 과

re- verse dot - blot

원 리 를 이 용한

line probe assay

방법을 동시에 사용하여

rifampicin

_{내성 결핵균} 을 간단하고 신속하게 검출하여 그 결과를 얻 었기에 보고하는 바이다.

II.

_{실험재료 및 방법}

1.

실험 재료

임상 검체로는 결핵으로 의심되는 환자로서 본 기관에 의뢰된 검체 중 양성으로 판명된 10예(객담 8예， 늑막액 1 예， 소변 1예)를 대상 으로 실시하였다. 시약으로 agarose는 미국 FMC사의 제품을 사용하였으며， 제한효소， 전기 영 동

marker ,

Taq polymerase는 미 국

Promega

사의 제 품을 사용하였다.

PCR

primer 는

rifam- plcm

내성 결핵균주에 특이한

RN A polymerase

subunit(

rpo 껴) 유전자 부위에서 선택하였다

(Fig. 1

)20).

Line probe assay

kit는

INNO

LiP A rifampicin TB kit

(I

nnogenetics Co. Bel-

gium) 를 사용하였다.

(3)

2.

^{실험 방법}

1) 검체로부터 결핵균 DNA의 추출

결핵균

DNA

추출에는 일반적으로 사용되고 있는

proteinase K/phenol

방법 을 이 용하였 으 며， 검체의 종류에 따라 전처리 과정을 달리 하였다. 객담은 점성이 높기 때문에

4N NaOH

와 동량의 검체를 혼합하여 점도를 저하시킨 뒤

3

,

800

rpm으로 원심분리 후 상충액을 제거 하였고， 늑막액과 소변은

4N NaOH

처리를 하 지 않고 바로

3

,

800

rpm에서 원심분리 후 상충 액을 제거한 뒤， 각 침전물을 세포 용해 완충 액

(50 mM Tris-HCl

,

pH 7.5

,

1 mM EDTA

,

1 % Triton X -100) 200

띠와 섞은 다음

pro- teinase

K를 최 종 농도가

400

땅Iml이 되 도록 혼합하여 37⁰C 에서 1 시간 이상 방치하였다. 이 어

phenol/ chlorof

orm을 동량을 넣고

1

분간 섞 은 후

12

,

000

rpm에서

10

분간 원심분리를 하고 상충액 을 취 해 다시 chloroform을 넣 고 같은 방 법으로 원심분리를 하였다. 원심분리 후 상충액 을 취 하여

0.2 M sodium

acetate와 2배 부피 의

100%

에탄올을 넣어 섞은 다음 -20⁰C 에서 1 시 간 이상 방치하였다. 다음으로

18

,

000

rpm에서 20분간 원심분리 후 침전물을

70%

에탄올로 세척하고 원심분리를 한 후 침전물을 건조하였 다. 건조된 침전물을

TE

완충액 (Tris

EDTA

,

pH

7.6) 에 재용해시키고 그 중 일부를 PCR에 사용하였다.

2)

1 차 및 2차 중합 효소 연 해 반응

PCR

반응의 최종액은 50 여로 하였으며， 반응액 은

50 mM KCl , 10 mM Tris - HC

^l(

pH 8.3) , 2.2 mM MgCl

2

, 200 mM

dNTP와

1

U

Taq polymer-

ase를 사용하였다.

Primer

농도는 l 차 PCR에 서

10 pmol

, 2차 PCR에 서 는

25

pmol을 사용하 였다.

PCR

반응은 1 차 PCR에서 95⁰C 에서

1

분， 50⁰C 에서 1 분 30초， 72⁰C 에서 2 분으로

30

회 실시하였다. 그리고 2차 PCR은 95⁰C 에서

1

분， 50⁰C 에서 1 분 30초， 72⁰C 에서 2분동안

30

회 를 자 동

thermal cycler( GeneAmp PCR sys-

tem 480

,

Perkin Elmer Cetus

Inc.) 를 이 용하여 증폭하였다.

3) Agarose gel

전 기 영 동 및

DNA

band의 분석

PCR

반응의 확인 을 위 하여 증폭된

DNA 10

띠에

2

띠의

loading buffer( 0.25 % bromo phenol blue , 0.25% xylene cyanol FF , 15%

Ficoll

400) 를 넣은 다음，

100

volt에서 30분 동 안

2 % agarose gel

전기 영동을 실시하였다.

그 후

ethidium

bromide로 염색하여 1 차

PCR

에서는

395 bp

, 2차 PCR에서는

257 bp

크기의

DNA

band를

uv

상에서 확인하였다.

4) Line Probe Assay

증폭된

PCR

산물

10

여를

denaturation

용액 10 띠에 담가 20⁰C 에서

5

분간 방치한 후 미리 가열한

hybridization

용액을

1 ml

넣고 혼합하 였다. 다음으로

LiPA

strip을 넣고 62⁰C 에서

30

분간 방치시킨 다음， 미리 가열한

stringent

세척 용액

1

ml로 1 분간 2회 세척하였다. 그 후

stringent

세척 용액을

1 ml

넣은 뒤 62⁰C 에 서 10 분간 방치 한 후，

1

ml의

rmse

용액 으로 2회 strip을 세척하고

1

ml의

conjugate

용액을 넣은 후， 25⁰C 에서 30분간 방치하였다. 이것을

1 ml rinse

용액 으로 2회

, 1 ml substrate

완충 용액으로

1

회 세척한 뒤

1 ml substrate

완충 용액 을 가한 다음

20

⁰

C --25

⁰

C

온도로 30분간 방치하였다. 마지막으로 멸균한 증류수로 씻어 주고 나서

20 0

C -- 25 Oc

온도로 5 분간 방치한 후 결과를 판독하였다.

III.

실험성적

10예의 임상 검체에서 직접 DNA를 추출 한 후

INNO LiPA rifampicin TB

kit에 포함된

1

차

primer(OP1

,

OP2)

쌍으로 1 차 PCR을 한 다음， 2차

PCR primer

(l

P1

,

IP2)

쌍으로 2 차 PCR을 실행한 결과

2 % agarose gel

상에서

10

검체 모두

257

bp 의 결핵균 특이

DNA

(4)

M 1 2 :3

Fig. 2. Amplified DNA products of first PCR and second PCR in rpo

β

region of M tuberculosis.

M : Molecular standard marker(PhiX174/Hae

m)

Lane 1 : Amplified product of rpo

^β

gene by first

PCR(395bp)

Lane 2 : Amplified product of rpo

β

gene by sec- ond PCR (25 7bp)

Lane 3 : Negative control

Fig. 3. The strains of rifampicin-resistant

M.

tu- berculosis detected by line probe assay system.

Lane 1 : Rifampicin

^r

strain : Sl mutation

Lane 2: Rifampicin

^r

strain: S4/R4a coinfection mutat

lO

n

Lane 3: Rifampicin

^r

strain: S2/R5 double muta-

tlOn

Lane 4-10 : Rifampicin

^s

strains

가 확인 된 2차 PCR의 증폭 산물로

reverse dot

hybridization을 실 시 한 결 과， 3예

(30%)

에 서

rpo

β 유전자에 돌연변이가 일어난 것을 확 인하였다 (Fig.3). 이들 중 한 예는

Sl

위치에 서 돌연변이가 일어났음을 알 수 있었고， 또 한 예에서는

S4/R4a

위치에서 이중 돌연변이 가 검출되었는데 이것은

codon

526 에서 아미 노산

histidine

(His) 이 tyrosine(Tyr) 으로 바뀐 경우이다. 나머지 세 번째 예에서는

codon 531

에서 아미 노산

serine ( Ser

)이

leucine

(Leu) 으로

바뀌어

S2/R5

위치에서 이중 돌연변이가 일어

났음을 알 수 있었다. 본 실험 결과， 2차 PCR과

reverse dot

방법 을 이 용한

line probe

assay를 사용하여 임상 검체로부터 신속하고 정확하게

rifampicin

내성 결핵균을 검출할 수 있었으며，

나아가 이 방법은 향후 임상 검사실에서

rifampi- cm

내성 결핵균의 신속한 진단 방법으로 유용하 게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

N. 고 찰

활동성 폐결핵을 가진 환자로부터 다약제 내 성을 가진 결핵균의 증명은 매우 중요한 임상 적 의의를 지닌다 26) 지금까지는 배양에 의한 약제 감수성 검사l2， l4) ， 또는 방사선 측정 배양 방법 ^l3)

,

혹은

Bactec 460

기 기 를 이 용한 감수 성 검사 방법 l8， 23) ， 결핵균에 대한 특이 항체를 사용하여 결핵균 항원의 양을 측정하는 효소면 역 법 등 17) 을 사용하였다. 이 러 한 방법 들은 검 사 기간이 길다는 단점외에도 고가의 장비와 시약， 결핵균 이외의 오염균에 의한 비특이적 인 반응을 나타낼 수 있는 등 다소 문제점이 있다. 또한 검체의 전처리에 사용되는 화학 물 질에 의한 항원의 변성될 가능성이 있으며， 균 수가 적은 뇌척수액과 같은 임상 검체의 경우 분리가 어렵다는 점들이 지적 되고 있다. 한편 항결핵제를 사용하여 결핵균을 배양했을 때 균 의 성장 정도를 rRNA의 양으로 추정할 수 있 는 방법이 보고되고 있는데， 이는 배양 후

3--

(5)

5 일 내에 결과 판정이 가능하나， 동위원소의 짧은 반감기 문제와 고가의 장비가 필요하고

M.

tuberculosis와

M.

bovis를 구별하기 힘들며，

결핵균주가 ml당

6

X

10

⁷이상이 되어야 검출 이 가능하다는 단점이 ^있다15) 본 실험에서는

DNA

수준에서

rifampicin

내성 결핵균을 검출 하기 위하여 임상 검체로부터 직접

line probe

assay 를 실시하였다. 이 방법의 원리 는

rifam- picin

내 성 기 전 의 원 인 인

RN A polymerase subunit(

rpo

ß)

유전자 부위에서 선택된

2

쌍의 pnmer를 이용하여 2차 PCR을 실시하고 증폭 된 산물을

nitrocellulose membrane

strip에 고 정 시 킨

10

개 의

oligonucleotide

set에 교 잡

(hyb

ridization) 하여 그 변이를 검출하는 것이다.

Inno LiP A

strip에는 결핵균의 rpo 껴 유전자의 정상적인 염기서열을 갖는

81-85

probe와， 빈 번한 돌연변이가 일어나는 부분의 염기서열을

갖는

R2-R5

probe가 미리 고정되어 있으므

로， 이 부분의 돌연변이의 검출이 가능하다

(Fig.

1).

Rifampicin의 작용은 rpo ß 유전자에 의해 암 호화 되 는

RN A

polymerase의 껴-subunit 부 근에서 조절되는데， 이

RN A polymerase ß-

subunit

내에서 돌연변이 (아미 노산의 변화)가

일어나면

rifampicin

내성이 생기게 된다 11 ， 16， 21 ⁾ 즉 ， rpo ß유전자의

72

염기 배열내에서 돌연변 이가 일어나는 경우 rifampicin에 대한 민감성 이 상실되어 내성 균주가 된다 24) Rifampicin은

lipophilic

ansamycin으로서 소수성 인 세 포벽 을 잘 침투하기 때문에 결핵균에 대해 매우 높은 항균 효과를 나타내므로 조기 치료 항결핵제로 서 사용되는데，

rifampicin

내성인 결핵균주들 이 대부분 rpo β 유전자의 돌연 변이를 가지고 있고，

rifampicin

내성을 보이는 균주와 다약제 내성을 보이는 결핵균주의 유전적 변이가 거의 일치하므로 ， rpo ß유전자의 돌연변이 가

rifampi cm

내성의 표지자로서 충분한 의의가 있음이 입 증되 었 다 24， 25) 또한

rifampicin

내 성 을 가진 결핵균은 대부분 다른 주요 조기 치료 항결핵 제인

isoniazid

내성을 동반하므로 다약제 내성

의 표지로써 그 임상적 의의가 크다 27) 본 실 험 에 서 사용한

line probe

assay는 기 존 방법 에 비하여， 방사성 동위원소의 사용이 없고， 빠른 시간 내에

DNA

수준에서

rifampicin

내성 결 핵균의 검출이 가능하였다. 본 실험에서 고려 해 볼 수 있는 점은， 결핵균

PCR

검사를 위해 본 연구소에 의뢰된 임상 검체 중 무작위로 10예의 검체를 선택하여 실험을 실시한 결과

3

예 (30%) 에서

rifampicin

내성 결핵균으로 나타 나， 일반적으로 예상되는 것 보다 많은

rifam- p

lCm 내성 결핵 균주가 존재함을 알 수 있었 다. 따라서 향후 결핵의 진단에서 결핵균

PCR

검사가 양성인 검체의 경우

rifampicin

내성 결 핵균 검사를 동시에 실시한다면， 시간을 절약 할 수 있고 결핵의 진단 및 치료와 예후 추정 에 있어서 많은 도움이 될 수 있을 것이다.

v.

결 론

Rifampicin

내성 결핵균을 검출하기 위하여，

10예의 임상 검체로부터 직접

PCR

증폭 산물 을 얻은 후

reverse dot - blot

원리를 이용한

line probe

assay를 실시한 결과， rpo 껴 유전자 의

81

위치，

84/R4a

그리고

82/R5

지역에서 돌연변이가 일어난

3

예의 내성 균주를 검출할 수 있었다. 본 실혐의 결과로 볼 때， 2차

PCR

을 이 용한

line probe

assay는 임 상 검 체 로부터 직접

rifampicin

내성 균주의 존재를 검출하기 위한 신속하고 간편하며， 정확한 방법임을 알 수 있었으며， 향후 임상에서 활용성이 클 것으 로 사료된다.

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