−
40
−전기화학을 이용한 실리콘 표면상으로 기능성 물질의 공간 선택적 고정화 연구
박수현
·아칠성
†·김규원*
인천대학교화학과·†한국전자통신연구원
(2008
년11
월21
일접수: 2008
년12
월29
일채택)
Spatially Selective Immobilization of Functional Materials onto Silicon Surfaces Using Electrochemical Method
Soohyoun Park, Chil Seong Ah
†, and Kyuwon Kim*
Department of chemistry, University of Incheon, Incheon 402-749, Korea
†
Electronics and Telecommunications Research Institute, Daejeon 305-700, Korea (Received November 21, 2008 : December 29, 2008)
초 록
실리콘표면을전기화학적으로활성화하여활성화된표면에만선택적으로단백질이나나노입자 등의기능성물질을고정화하는 방법을개발하였다
.
이를위해Carboxymethylbenzendiazonium
(CMBD)
양이온을전기화학적환원반응을통해고정하여실리콘표면을활성화하는방식을선택하였다
.
그리고 활성화된표면에서만기능성물질이고정된것을확인함을통하여CMBD
양 이온의사용이선택적고정화에매우효과적임을보였다.
나아가이방법을응용하여실리콘나 노소자에탑재된실리콘나노선어레이중선택된나노선의표면만을활성화하고금나노입자를 선택적으로 고정하는 연구를 수행하였다.
Abstract :
We present a method for spatially selective immobilization of functional materials, such as proteins and nanoparticles, onto pre-activated silicon surfaces by electrochemical reac- tion. Carboxymethylbenzendiazonium (CMBD) cations, being adsorbable on silicon surfaces through electrochemically reductive deposition, is used as an anchor molecule to prepare the pre-activated silicon surfaces. It is demonstrated that the use of BD reaction is very efficient for the selective immobilization because the functional materials are immobilized exclusively onto the pre-adsorbed CMBD region. The method is applied to immobilize gold nanoparticles on the selected nanowire of the nanowire array.
Keywords :
Electrochemistry, Benzenediazonium cation, Spatially selective immobilization, Silicon nanowires.
1. 서 론
반도체 산업의중심에 있는 실리콘의 응용에대한 다양한접근이이루어지고있다
.
그중에서도바이오칩의기판으로의응용은정보기술과바이오기술의융합의한 축을담당하게될정도로그중요성이증가하고있다
.
특히생체물질의감지를위해전계효과
(Field effect transistor)
의원리를이용하는실리콘나노선어레이가탑재된바이오칩은표지가따로필요없고실시간으로고 감도의검출이가능하므로이를이용한고성능의진단용
*E-mail: [email protected]
바이오칩 개발에많은 관심이집중되고있다
.
1)모든종류의바이오칩의제작에있어
DNA
나단백질같은생체물질의고정화기술은핵심기술중하나이다
.
여러가지고정화기술중에서전기화학적으로표면을 활성화시켜생체물질을고정하는방법은원하는물질을 필요한위치에공간선택적으로고정시킬수있기때문 에활발한연구가진행되고있다
.
2-6)또한다중감지가 필요한경우값비싼 어레이로봇이 없이도간단히 바 이오칩을 만들수있어그사용범위가 확대되고있다.
이방법을사용하면고정화단계에서전기적인신호를 선택적으로가하여다양한분자를직병렬적으로고정 시킬수있을뿐만아니라생체분자의감지를전기적인 측정을통해구현가능한장점또한존재한다
.
이를위해개발되어야할필수적인기술이원하는전극상에매개 물질을고정하거나또는반응시켜표면을활성화하는 것이다
.
활성화된표면을만들기위한전기화학적개질 방법으로 가장 널리 이용되어온 것으로는 전기중합(electropolymeri-zation)
이있다.
7)하지만박막을균일한조성으로만드는데한계가있다
.
자기조립(self-assembly)
과정을거쳐전기화학활성을가지는단분자막
(monolayers)
을제조하는방식은균일한조성과정량적인반응조절 이 가능한 장점을가지고 있어 고정화방법으로 널리 사용되고있다
.
2-4)특히전기화학활성을가지는물질에금전극표면상에강하게결합하는싸이올
(-SH)
을도입하여자기조립박막을형성하는접근또한많이이용되고 있다
.
최근에는탄소나실리콘표면상에benzendiazonium
(BD)
양이온의전기화학적인반응을이용하여선택적으로활성화시키는연구결과들이발표되고있다
.
8-10)이경 우생체분자가달라붙을수있는활성화작용기(R)
를가진
BD
양이온의용액에전극을노출시키고환원전압을 인가하면질소분자가떨어져나가면서전극상에페닐고리가달라붙게된다
. (Fig. 1)
실리콘은반도체이며전도성이있어전극으로사용가 능함에도불구하고
,
산화되어전도성을잃어버리기쉬운 실리콘표면의특성때문에표면을전극으로사용하는 것은한계가있다.
하지만실리콘의자연적인산화정도만 수반되면서전기화학적으로는환원반응을이용하는작 업에는전도도의손해를최소화할수있어전극으로의 사용에있어문제가없게된다.
11)본연구에서는실리콘표면을전기화학적으로활성화 하여활성화된표면에만선택적으로생체물질이나나노 입자등의기능성물질을고정화하는방법을개발하고자 한다
.
이를위해카르복실산이연결된BD
물질을전기 화학적환원반응을통해고정하여실리콘표면을활성화 하는방식을선택하였다.
그리고활성화된표면에서만기능성물질이고정된것을확인함을통하여
BD
양이온를 사용한 고정화의 방법이선택적 활성화를 위한 효과 적인방법임을증명하고자한다.
이것은두가지경우로나누어진행된다
.
첫째실리콘웨이퍼를두구역으로나누어생체물질인효소단백질을공간선택적으로고정화 한다
.
둘째 실리콘나노소자에 탑재된실리콘나노선 어레이중선택된나노선의표면만을활성화하고금나 노입자를선택적으로고정한다. BD
양이온의전기화학반 응을이용한실리콘나노선어레이상으로의선택적고 정화에관한연구는아직보고된적이없다.
5)2. 실 험
2.1.
실험 재료4-carboxymethylaniline (CMAn) bromobenzenedia- zonium (BrBD) salt, ammonium fluoride,
금나노입자콜로이드
(10nm)
는시그마-
알드리치, biotin-(PEO)
4-amine
Fig. 1. Structure of benzenediazonium cation (BD) and the electrochemical reaction of BD on silicon surfaces.
은
Pierce, Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated streptavidin (SA)
은Endogen
에서구입하였다.
다른시약은특별한언급이없으면시그마
-
알드리치에서구입 하여 사용하였다.
사용한 실리콘 웨이퍼로는 저항이<0.005 ohm.cm
인N-type Si(100) (prime
급)
을 사 용하였으며 폴리싱이이루진면만 전극부분으로활용 하였다.
전극으로사용전에40% NH
4F
수용액에서20
분 이상 에칭시켜실리콘산화막을제거하였다.
2.2 . 4 - carboxymethylaniline
로부터4- carboxyme- thylbenzenediazonium ( CMBD )
양이온의 합성보고된문헌을참고하여
CMBD
를합성하였다.
합성후정제는따로하지않았으며혼합물의상태로전기화학 실험에사용하였다
.
혼합물의제조한뒤사용하고남은용액은영하
20
oC
냉동실에보관하였으며1
주일이상 지난 것은사용하지않았다.
2.3.
실리콘표면및나노소자를사용한전기화학실험모든 전기화학실험은
Ivium
사의compactstat
을사 용하여 수행하였다.
작업전극으로는실리콘 표면을기준전극은
Cypress
사의Ag/AgCl
를 보조전극으로는백금선을사용하였다
.
소자상의나노선을작업전극으로사용할 경우
polydimethylsiloxane (PDMS)
재질의 전기화학셀을제작하여소자기판상에눌러고정시켜 전해질용액이새지않게하였다.
실리콘나노선이탑재된소자는 이미 보고된 문헌대로 제작되었다
.
12) 약1.1
×1.1cm
크기의silicon-on-insulator (SOI)
기판상에 다양한 길이와폭을 가지는33
개의 실리콘 나노선이top-down
공정을통해탑재되어있다.
이것은한국전자통신연구원으로부터제공되었다
.
사용전에4% NH
4F
수용액에서
10
초에서1
분정도에칭시켜 실리콘산 화막을제거하였다. 33
개의나노선중에서특정한몇개의 번호만골라그번호에해당되는나노와이어에연결된 금재질의패드에작업전극에대한금속프루브를눌러 접촉시켜전기화학적인신호를가하였다.
2.4
전기화학적으로CMBD
가고정된실리콘표면의반응
CMBD
가고정된실리콘표면은Fig. 2
와같이카르복실 작용기가 용액 쪽으로 드러나 있다.
이 작용기를N- hydroxysuccinimde (NHS)
와1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)
의 혼합용 액을사용하여NHS
의ester
를생성시켜이표면이용액 중의일차아민과빠른반응이가능하도록한다.
선택 적으로표면반응이진행된것을확인하기위하여효소가 만드는침전반응을관찰하였다.
이방법은이미발표된 논문의방법을그대로이용하였다.
4)10 mM
의biotin-
(PEO)
4-amine
의phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2)
용액과 반응시켜 바이오틴이 고정된 표면을생성 후
HRP-SA (100mM PBS solution)
을연속적으로고정시킨 다.
그리고4-Chloronaphtol (4-CN)
을메탄올에 녹이고PBS
용액과섞어준뒤미량의H
2O
2촉매를더한용액에HRP
가고정된실리콘표면을노출시키면4-CN
이반응하여용액에녹지않는침전을만들게되어표면의색깔을 변화시킨다
.
실리콘나노와이어에CMBD
를반응시킨후 마찬가지로EDC/NHS
용액을사용하여 활성화한후 일차아민인aminohexanethiol
를반응시킨후싸이올말단이드러난 와이어표면을 생성시킨다
.
여기에10 nm
금 나노입자를30
분동안반응시키면CMBD
를반응시킨다.
3. 결과 및 고찰
3.1. Benzenediazonium
이온의준비나노소자상의실리콘나노와이어어레이를전극으로 사용함에앞서실리콘웨이퍼를일정한크기로잘라서 전극으로사용하여선택적활성화반응을연구하고이 결과를나노소자를이용하는데반영하고자하였다
.
실 리콘의산화막은나노전자소자센서의감도를감소시 키므로전기화학반응시환원반응에의한앵커물질의 고정화가일어나게하는것이유리하다.
따라서본연 구에서는앵커물질로전기화학적환원에의해반응을 일으키는benzenediazonium (BD)
이온을선택하였고실리콘전극에서환원반응을시켜
Fig. 1
과같은메커니즘으로실리콘표면에고정하게된다
.
다양한작용기 중에서carboxyl
작용기를가지는BD
이온을고정시킨 뒤 추가의 표면 반응을진행하여 생체분자나 나노입 자를선택적으로고정시키는과정을구현하고자하였다.
또한
carboxyl
작용기의 반응성을 검정하기 위해Fig. 2. Structure of bromobenzenediazonium (BrBD) (a),
the preparation of 4-carboxymethylbenzenediazonium
(CMBD) from 4-carboxymethlaniline (b), the process for
etching of silicon oxide followed by electrodeposition of
BD.
Bromobenzenediazonium (BrBD)
을 사용하였다.
carboxyl
작용기가도입된BD
는상업적으로판매되지않으므로직접합성하였다
. Fig. 2
의(a)
와(b)
에서BrBD
와
carboxymethylbenzenedia-zonium (CMBD)
의구조 및CMBD
의 합성 과정을보여준다. Benzene
고리의아민기를아조늄이온으로변형시키는유기화학반응을거 쳐준비하였으며다로분리하지않고혼합물의형태로사 용하였고 고정화 반응 직전에 합성하여 사용하였다
.
정제되지 않은혼합용액을 사용하여
carboxyl
작용기를가지는
BD
고정화연구는이미보고된예가있다.
13)3.2.
전기화학반응을이용한BD
의실리콘표면으로의고정화 연구
실리콘웨이퍼를적당한크기로자르고
Fig. 2
의(c)
와 같은 과정으로 세척 후 전기화학 반응의 작업전극을 사용하였다.
먼저진한황산과30%
과산화수소(3 : 1)
용액에서
1
분간씻어준뒤40% NH
4F
수용액에서20
분간담가산화막을제거하였다
.
과량의3
차증류수로씻어준 뒤미리준비한BD
의전해질용액에노출시켜전기화학 반응을 수행하였다. Fig. 3
은 순환전압전류법(cyclic voltammetry,
이하CV)
으로 수행한 전기화학 반응의결과를도시한것이다
. BrBD
의CV (Fig 2
의(a))
에서는−
0.4 ~
−0.7 V
근처에서 전류 봉우리가 관찰되었으며두번째순환에서는그봉우리가사라지는것이관찰 되었다
.
이것은 이미보고된BD
이온에대한CV
형 태와일치하며,
첫번째순환에서실리콘표면상에BD
의 박막이생성되고,
두번째순환에서는이미생성된 박막으로인해전기화학반응이방해받은것에기인한다고 해석된다
.
이런 형태의CV
관찰은 첫번째 순환만으 로도실리콘표면고르게박막이형성될수있다는것을 짐작하게 한다. Fig 3
의(b)
는CMBD
의 혼합용액에대한
CV
를 보이고있다. BrBD
와 비교하면봉우리의위치가 약간이동하였으나 전체적인거동은 유사함을
알수있다
. CMBD
혼합용액에대한CV
결과도이미보고된유사한실험결과들과일치한다
.
13)Diazonium
을가지고 있지 않은
4-carboxymethylaniline (CMAn)
에 대해같은조건에서전기화학반응을시켜보면Fig. 3
의(c)
와 같이 봉우리가 −0.9 V
근처의 음전위 방향으로크게이동하며두번째순환에서도비슷한 형태를 가 지고있다
.
따라서관찰된봉우리들은표면에고정되기 위해수반되는전기화학반응은아닌것으로생각된다. CMBD
의고정화반응의해생성된박막이Fe(CN)
63−이온에대한실리콘전극표면으로의전자전달반응을 방해하는현상을관찰하였다
. Fig. 4
에서볼수있듯이Fig. 3. Cyclic voltammetry for the electrodeposition reaction of BrBD (a), CMBD (b), and 4-carboxymethlaniline (c).
Solid line: first cycle, dashed line: second cycle. Scan rates are all 50 mV/sec.
CMBD
혼합용액으로전기화학반응을보낸실리콘 표 면에대한Fe(CN)
64− 이온의반응은 박막에의한 전자 전달에 대한 반응속도론적 에너지 장벽 때문에전류봉우리가관찰되지 않았으나
CMBD
가없는NaNO
2와HCl
혼합용액만을전해질로 사용하여 반응시킨표면 에서는Fe(CN)
63−의 환원 봉우리가 −0.7 V
근처에서 관찰되었다.
이결과또한CMBD
의박막형성을 뒷받침하고 있다
.
다만CMBD
없이반응시킨표면에서도전류 봉우리가 예상한위치보다 음의 전위에서 관찰 되었으며이것은박막이없는실리콘표면이라할지라도
Fe(CN)
63−이온의 환원반응에 대한 과전위가 크기 때문에생기는현상이라고 생각된다
.
이현상은이미보고된 유사한 물질의 박막에 대한 것과 일관성 있는 결과이다
.
14)3.3. CMBD
가고정된실리콘표면의반응및기능성물질의 고정
실리콘표면 전극을선택적으로 활성화하기위하여 실리콘 웨이퍼 조각의 일부분만을
CMBD
를 포함한 혼합용액에담가전기화학반응을시키거나O-ring
으로 전극을한정시켜전기화학반응을진행하였다. CMBD
의고정으로활성화된부분에만선택적으로기능성물질을 고정시키기 위해
carboxyl
작용기에추가적인 반응을 시켰고기능성물질로는생체물질인 과산화효소나금 나노입자를사용하였다.
과산화효소를선택한것은과산화효소의촉매반응을이용하여고정화여부를쉽게 판단할수있을뿐아니라 이효소를표지로한바이 오센서 연구가활발하게 진행되기 때문이다
.
15) 금나노입자 또한촉매나표지로 많이활용되는유용한물 질이다
.
16)HRP
를직접사용하는대신보다용이한고정화연구를위해 단백질인
SA
가 연결된 형태인HRP-SA
를사용하였다
. SA
이란단백질은avidin
처럼biotin
이란리간드물질과매우강하게비가역적으로결합한다고알려져 있다
.
이결합성질을이용하면Fig. 5
의(a)
와같이표면에 고정된carboxyl
작용기에biotin
을 고정하는 반응을통해
HRP-SA
를고정시킬수있다.
먼저전기화학적으로표면을일부분만
CMBD
와반응시켜부분적으로carboxyl
작용기가고정된 상태의 실리콘 기판을 준비한다
.
이 기판전체를EDC/NHS 2:1
혼합용액에담그면CMBD
와반응한곳만
NHS ester
를생성된다.
세척후이기판전 체를다시biotin-(PEO)
4-amine (10mM)
의PBS (pH 7.4)
용액에노출시켜아마이드결합을통해
biotin
이드러난표면을만들었다
.
표면에비특이적인단백질의흡착을방지하기위하여
Bovine serum albumin (BSA)
가혼합된PBS
용액에서10
분간노출시켰다.
세척후HRP-SA
의PBST (PBS
+0.05% Tween)
용액과기판전체를접Fig. 5. (a) Chemical reaction process for immobilizing HRP-conjugated streptavidin (HRP-SA) onto CMBD-deposited silicon surfaces. (b) A pattern image obtained from HRP-catalyzed precipitation reaction following spatially selective immobilization of HRP-SA. Scale bar = 500 nm.
Fig. 4. Cyclic voltammograms of an aqueous solution with
1 mM Fe(CN)
63-and 0.1 M KCl on a H-Si surface (solid
line) and CMBD deposited Si surface (dashied line) as
working electrodes. Scan rates are all 50 mV/sec.
촉시켜표면
biotin
과반응시켰다.
반응후의표면에서HRP
의효소반응을일으키기위하여이후HRP
의기질인4-Chloronaphtol, 1 mM
를녹인5 mL
의메탄올과PBS
의혼합용액에
HRP-SA
가고정된기판표면을노출시킨상태에서 수 μ
L
의 과산화수소를 가하여 효소의 촉매반응을일으키게하였다
. HRP
가고정된곳에는수용액에녹지 않는촉매반응의생성물 침전이쌓이게 되어색 깔이 짙게 변하고 이것은 눈이나 현미경으로 식별이 가능하다
. Fig. 5
의(b)
에서는전기화학적으로CMBD
를 반응시킨아래부분과 그렇지 않은위부분의경계를HRP
의효소반응후광학현미경의반사모드로관찰한영상을보이고있다
.
그경계를두고색깔의대비가매우뚜렷하게 나타나 있으며 이것은
CMBD
가 반응한 부분에만높은선택성으로생체물질을고정시킬수있음을 말해주는결과라 할 수있다
.
다만높은 대비결과가biotin
고정에 있어선택성이큼을의미하지는않는다.
이유는
SA
가고정되는최대양은표면biotin
양이가장높은 밀도일때와비교하여
10%
정도일때라는 사실때문이다
.
17)이번에는
SOI
기판상에제작된실리콘나노와이어어레이를이용하여선택적으로나노입자를고정시키는 연구를수행하였다
.
앞서 실리콘웨이퍼를 잘라 작업전극기판으로사용한경우와달리나노와이어가탑재된
소자상에서는
10nm
크기의금나노입자의선택적고정현상을 관찰하였다
. (Fig. 6
참고)
하나의 소자 당총33
개의와이어중에서인접하지않은두세개의번호를임의로선택하여전기화학반응을진행시킨후그번호와 인접한와이어와 고정된 나노입자의 양을
SEM
이미지를 통해 비교하는식으로 진행하였다
.
면적이 크고 두터운 실리콘 전극에 비해 실리콘 와이어는 저항이 커지므로전기화학적반응의조건이달라질수있으므로 세척또는반응시간등의 조절에있어보다 조심스런 접근이 필요하다.
세척과정에서는4% NH
4F
용액을 제조하여소자전체를담가10
초에서1
분까지다양한 시간동안자연적으로생성된SiO
2를제거하였다.
다양한길이와폭을가지는실리콘나노와이어어레이가탑재된
칩상에서전기화학반응을 수행하기위해
PDMS
재질의전기화학셀을제작하였다
.
이셀을실리콘나노 와이어 칩상에 밀착시켜용액이새어나가지못하게 하였다.
각 나노와이어를 작업 전극으로사용하기 위 하여핀형태의프루브를나노와이어에연결된금박막 패드에눌러접촉시키고일정전위기(potentiostat)
에연결하였다
.
표면에 고정시킬CMBD
용액을 피펫을사용하여
PDMS
셀내에삽입하고Fig. 6
의(c)
와같이 기준전극과작업전극을연결한뒤일정전위기를이용하여CV
를수행하였다. CMBD
의고정화반응후소자를세척한뒤
Fig. 6
의(b)
와같이EDC/NHS
혼합용액을사용하여
NHS ester
형태로활성화시키고mercaptohexylamine (HS(CH
2)
6NH
2)
을반응시켜아마이드결합을통해나노 와이어표면에싸이올작용기를노출되게하고그위에 금나노입자를고정되게하였다.
이런일련의과정을거친후얻은금나노입자의선택적고정화를주사전자현미경
(SEM)
을사용하여관찰하였으며그결과를Fig. 7
에나 타내었다.
실제소자상에서는인접한나노와이어사이의간격이
200
μm
이나나노와이어간의비교를용이하게 하기위하여 겹쳐 제시하였다.
전기화학 반응으로Fig. 6. (a) Electrodeposition scheme to immobilize CMBD on silicon nanowire surfaces. (b) Chemical reaction process to
immobilize gold nanoparticles (NP). (c) Electrochemical cell set up for silicon nano-device.
CMBD
를선택적으로반응시킨아래 부분의나노와이어에만주로 금나노입자가고정된것을 볼수있다
. CMBD
를전기화학반응시키는시간및이후화학반응 시간등을조절하면보다선택성이높은고정화가가능할 것으로예상된다.
또한 전기화학반응이 진행된 나노와이어가까이의
SiO
2표면상에도나노입자가많이발견 되었다.
이것은나노와이어표면상에자연스럽게생성 되었을SiO
2의에칭과정에서와이어주변의SiO
2박막이 일부벗겨져나간것에기인한다고생각된다.
그부분에는와이어에걸어준전류의누설이생길수있고그결과
CMBD
의흡착이가능하게된다.
이결과로볼때전류의누설이있는경우라하더라도
500nm
정도까지는영향을받지않기때문에보다밀집된어레이의제작이가능할 것으로본다
.
4. 결 론
CMBD
양이온의전기화학적고정반응을통해 효소단백질과금나노입자등의기능성물질을실리콘전극
표면상에공간선택적으로고정시키는방법을개발하였
다
. CMBD
를반응시킨영역에만작용기물질이지배적으로고정됨을확인하여우리의방법이높은선택성의 고정화에효율적임을증명하였다
.
이방법은다중의물 질을서로다른실리콘나노와이어에고정하여다중의 기능을 가지는센서 소자의 제작에 유용하게 사용될 것으로기대된다.
감사의 글
이논문은인천대학교
2007
년도자체연구비지원에 의하여연구되었음.
참고문헌
1. G. Zheng, F. Patolsky, Y. Cui, W. U. Wang, and C. M.
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