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[신기술 소개] 인공 미생물 바이오센서를 이용하여 신기능 락탐전환 효소 발견

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Academic year: 2021

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신기술 소개

NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 37, No. 2, 2019 … 193 대량 유전체 자원(예: 메타게놈 DNA등)을 탐색

하여 유용한 효소 및 대사경로를 발굴하는 것은 바 이오산업의 오랜 관심사이다. 최근에는 미생물이 주 변 환경에 따라 단백질 발현을 조절하는 것처럼, 신 규 효소에 의하여 특정 지표물질이 세포 안에 나타 나면 이에 따라 형광단백질 발현이 증가하도록 하 는 새로운 효소탐색 기술이 발전하고 있다. 특히 한 국생명공학연구원은 페놀, 이소프렌, 셀로비오스 등

지표물질이 발생하는 미생물세포에서만 형광이 발 생되도록 바이오센서를 개발하여(GESS: genetically- encoded enzyme screening system), 단일세포 단위 의 초고속 생물분석 기술을 개발한 바 있다(ACS synthetic biology. 2014, 2016, 2018. Scientific reports 2018 등). 이 기술을 사용하면 한 번에 수백만 개의 대량 유전체 자원들을 분석하여 유용 효소 활성을 효과적으로 획득할 수 있다.

인공 미생물 바이오센서를 이용하여 신기능 락탐전환 효소 발견

(A synthetic microbial biosensor for high throughput screening of lactam biocatalysts)

Nature Communications. 2018 Nov 29;9(1):5053. doi: 10.1038/s41467-018-07488-0.

이승구, 염수진(한국생명공학연구원 합성생물학전문연구단)

그림 1. 카프로락탐 감지 유전자회로 (CL-GESS) 개발 전략의 도식도.

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신기술 소개

194 … NICE, 제37권 제2호, 2019

그림 2. CL-GESS를 이용하여 얻어진 3HBD에서 고리화활성의 검증.

본 Nature Communications 논문은 플라스틱, 포장 재료, 카펫 등에서 광범위하게 사용되는 나일론 모 노머(카프로락탐)를 감지하는 미생물 바이오센서를 개발하고, 이를 이용하여 새로운 효소기능을 발견한 내용이다. 기존에 카프로락탐을 합성하는 화학공정 에서는 벤젠 등 다양한 유해물질들이 많이 배출되어 이를 친환경 기술로 대체하려는 노력이 오랫동안 이 어졌다. 특히 바이오기술로 6-aminocaproic acid(6- ACA)를 생산하여 카프로락탐으로 전환하면 바이오 매스를 이용하는 친환경 공정개발이 가능할 것으로 기대되고 있으나, 실제로 이 고리화 반응(cyclization) 을 진행하는 효소작용에 대해서는 알려진 바가 많지 않았다.

본 연구에서는 먼저 카프로락탐을 민감하게 감지 할 수 있는 전자인자 개발을 시도하였고 이를 도입 하여 CL-GESS 바이오센서 회로를 구축하였다. 즉 새로운 효소활성에 의하여 락탐계열의 물질이 세포 에 생겨나면 미생물 전사인자 NitR이 해당 프로모터 부위에 결합하여 강한 형광을 내도록 하는 것이다.

이 유전자회로의 정밀한 구동을 위해서는 DNA부품 들이 최적의 민감도 및 선택성을 갖도록 정밀하게

조립될 필요가 있었다. 이 과정은 그림 1에 나타낸 것처럼 각각의 부품들을 표준화된 방식으로 조합하 여 수백 가지 경우의 수가 발생하도록 하고 FACS 분 석을 통하여 최적조합을 선택하는 방식으로 진행되 었다. 즉 프로모터들, RBS의 다양한 배열을 테스트 하였고, nitA promoter 길이를 최적화하였고, sfGFP 를 최종 리포터로 선정하였다. 특히 NitR단백질의 117번 위치가 페닐알라닌으로 치환되면 표적에 대한 선택성이 10배 이상 증가하는 것을 발견하였다. 이 CL-GESS 유전자회로는 카프로락탐뿐만 아니라 다 양한 락탐, 락톤계 화합물에 대해서도 매우 민감한 반응을 나타내었다.

이어서 서해 갯벌 퇴적물에서 분리한 메타게놈 라이브러리를 구축하고, 여기에 위 바이오센서 유 전자회로를 도입하고 6-ACA를 기질로 첨가하였다.

이 세포들은 초당 3,000번의 형광분석이 가능한 유세 포분석기(FACSaria, BD)를 이용하여 분석하였으며 높은 형광을 내는 세포들을 우선 회수하였다. 여기 에 실재 원하는 효소가 들어 있는지를 확인하기 위 하여 이 세포들에서 얻어진 31kb 크기의 DNA의 서 열분석을 수행하였다. 그 안에는 25개의 ORF(open

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신기술 소개

NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 37, No. 2, 2019 … 195 reading frame)가 들어 있었는데 이중 11개를 클로닝

하여 다시 FACS로 분석하였다. 그 결과 Citrobacter freundii 유래의 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (CF3HBD)가 6-ACA를 첨가하였을 때 강한 형광 이 확인되었다. 이 효소를 대장균에서 대량 발현하 고, 고순도 정제하여 6-ACA와 완충용액 내에서 반 응하고, 이를 LC-MS, NMR, IR 분석한 결과 해당 CF3HBD는 어떠한 조효소도 없이 6-ACA를 카프로 락탐으로 전환할 수 있음을 확인하였다(그림 2).

이 CF3HBD는 탈수소효소의 일종으로 본 연구의 카프로락탐 합성을 명확히 설명하기 어려웠다. 이에 X-ray 구조결정을 시도하여 실제작용에 대한 작용 기전을 밝히고자 하였다. 즉 구조구명, 모델링, 가상 리간드 결합 등을 수행하였으며, 정확한 활성부위 를 유추하고 주요잔기에 대한 돌연변이 실험을 진행 하였다. 그 결과 두 가지 효소활성이 나타나는 위치 는 많은 잔기들이 공유되어 있고 활성부위의 일부에 서만 차이가 관찰되었다. 즉 이 효소는 유전자 서열

정보 상으로는 3-hydroxybutyrate dehydrogenase(3- HBD)로 알려진 효소이면서도 전혀 상이한 신규 효 소활성을 동시에 같은 활성부위에 보유하는 것으로 확인되었다.

이 결과는 유전자 정보 분석만으로 유추해서는 자연계에 실재하는 많은 새로운 효소활성들이 간과 될 수도 있음을 의미하는 것이다. 본 연구에서는 활 성 위치에 다양한 유전자변이를 추가로 도입하여 새 로운 효소활성(cyclic amide-forming transamidase)을 3배까지 증가시키는 동안 3-HBD활성이 거의 사라 져서 두 효소기능을 분리하여 개량하는 것도 가능 함을 증명하였다. 이는 새로운 효소활성이 독립적으 로 개량 또는 진화될 수 있음을 보여주는 것이다. 이 러한 연구결과를 토대로 한국생명공학연구원에서는 초민감도 유전자회로 기술을 이용한 새로운 바이오 촉매의 발굴, 플라스틱 분해효소 개발, 메탄산화/전 환효소의 개발에 대한 후속 연구를 진행 중이다.

수치

그림 1. 카프로락탐 감지 유전자회로 (CL-GESS)  개발 전략의 도식도.

참조

관련 문서

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