중간엽 줄기세포를 이용한 세포와 유전자치료
한국과학기술정보연구원 전 문 연 구 위 원 강 계 원 (kwkang@reseat.re.kr)
1. 서론
○ 골수 안에는 다른 종류의 조직줄기세포가 있다. 이는 성체줄기세포로 조 혈줄기세포(hematopoietic stem cells)와 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells, MSCs 혹은 간엽계 줄기세포)이다. MSCs는 골수 안에 적은 집단의 세포로 조혈의 구성정요소가 아닌 다른 여러 가지 세포계보, 즉 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육과 간질세포(stromal cells)로 분화할 수 있는 세포이다.
○ 최근에 MSCs가 조혈에 관여하고 면역반응을 조절할 수 있다는 연구도 있고 MSCs를 쉽게 분리해서 in vitro에서 증식이 가능해 세포치료의 재원으로 기대하고 있다. MSCs로 in vivo에서 치료하면 손상된 조직/
기관, 염증, 암 부위에 이 세포가 모인다는 것이다. 그래서 MSCs를 재 생치료, 이식편 대 숙주질환(GVHD), 크론병(Crohn disease)과 함께 항 암제를 표적에 전달하는 암의 유전자치료의 플랫폼으로 이용 가능하리 라 본다.
○ MSCs의 특성 중에는 공동자극적인 분자의 발현이 없어서 면역원성이 아주 적거나 없다는 점이다. 그래서 MSCs를 공급하는데 HLA가 맞지 않아도 세포치료가 가능하다. 건강한 한사람의 MSCs를 기증받아 증식 시키면 많은 환자를 치료할 수 있다
○ 그러나 심한급성의 GVHD에 다른 사람의 줄기세포 MSCs를 이식해서 병을 억제하며 재생치료에 적용은 되고 있으면서도 근본적인 분자기전 이나 생물학적인 영향에 대해서는 모르고 있다. MSCs의 분화, 면역억 제, 조혈을 부양하는 중요한 분자들을 찾아내는 것은 MSCs를 임상에 이용해 효과를 높이고 널리 활용하는데 필수적이다.
2. 중간엽 줄기세포의 분화에 관계하는 유전자를 Microarray 로 분석
○ MSCs의 분화를 조절하는 유전자에 대해서는 잘 모르고 있으며 이러한 유전자를 고처리 분석으로 찾아내는 것도 일차적인 MSCs는 여러 가지 이질적인 세포집단을 내포하고 있기 때문이다. 이러한 문제를 극복하기 위해 이 논문의 저자들은 C3H 마우스 배세포에 얻은 10T1/2 세포에 5-azacytidine를 처리해서 지방세포, 골세포, 연골세포로 분화시켰다.
○ 10T1/2에서 이러한 세포의 분화과정을 이미 두 개의 서브라인 (sub-lines)으로 정하고 A54는 전지방세포라인(preadipocyte cell line) 과 M1601은 근모세포라인(myoblast)으로 명명해 놓았다. 적절한 배양 조건에서 A54와 M1601은 지방세포와 근관세포(myotubes)로 최종적인 분화를 한다.
○ 한편 10T1/2세포의 모세포(parental 10T1/2 cells)는 이러한 배양조건에 서 분화를 하지 않고 남아 있다. 그래서 10T1/2는 MSCs의 모델로 이 용하고 A54와 M1601은 중간엽 전구체로서 정해진 세포로 이용이 가능 하다.
○ 10T1/2 모세포는 105 개의 상향된 유전자를 가지고 있으며 여기에는 Activin, Dlk, Nov, Grb10, p15과 기능적으로 잘 모르는 분자들을 코드 하는 것들이다. Dlk, Nov는 Notch의 신호경로에 가담해 지방세포와 골세포로 분화하는 것을 억제하는 것으로 알고 있다.
○ 지방전구세포, A54는 201개의 유전자를 가지고 있으며 지방세포 분화 에 가담하는 C/EBPa, C/EBPd, PPAR-g, PAI-I, Frizzled-1 유전자를 고 트 한다. 근모세포 M1601은 137개 유전자에 MyoD, MLC1F, α-skeletal actin, myosin의 heavy와 light chain을 코드하고 또 심근으로 분화하 는 a-cardiac actin, troponin C, troponin T2를 코드 한다.
3. Nitric oxide (NO)는 T세포 증식을 MSCs에 의해서 억제한다
○ 골수 이식 후 스테로이드 저항이 심한 GVHD 환자에 MSCs를 혈관 주 사로 병태가 호전되는 경우가 보고된 바 있다. 그리고 유럽에서도 III-IV기의 중증급성 GVHD에 MSC-치료가 약 70%는 효력을 보았다.
MSCs가 T-세포를 증식을 억제한 분자기전은 복잡하고 논란이 있으나 MSCs가 Transforming Growth Factor-b(TGF-b), Hepatocyte Growth Factor(HGF), Indoleamine 2,3-DiOxygenase(IDO), ProstaGlandin E2 (PGE2) 인자를 중재해서 T 세포를 억제한다고 보고하고 있다.
○ 여기서는 일산화질소(Nitric Oxide, NO)가 T세포 증식을 억제하는 것 으로 알고 있어, 동물의 MSCs를 이용해 MSCs가 NO를 생성하고 그 NO가 T-세포를 억제하는지를 조사했다. MSCs를 활성화 된 T 세포와 공동배양하게 되면 MSCs 세포의 양에 비례해서 NO가 생성되는 것을 발견했다. NO를 유도할 수 있는 합성효소(iNOS)는 MSCs에서 검출되 지만 T 세포에서는 검출되지 않았다.
○ 결론적으로 MSCs가 생성하는 NO는 T-세포의 증식을 억제하며 Stat5 phosphorylation의 억제를 통해 그 일부가 이루어진다. MSCs와 활성화 T 세포를 같이 배양하면 배지에서 NO가 검출되고, NOS의 특이적인 억제제 L-NAME이 T 세포의 증식과 Stat5 phosphorylation을 회복시킨 다. 그리고 iNOS/mice에서 얻은 MSCs는 T 세포의 증식을 억제하는 능력이 감소되어 있다.
4. MSCs에 의해 Interferon-g와 NF-kB가 일산화질소 생성을 중재한다
○ 사람의 MSCs는 Th1의 분화를 억제하고 Th2의 분화는 증가시킨다. 그 래서 마우스의 골수에서 유래한 MSCs와 10T1/2가 Th1과 Th2에 같은 역할을 하는지를 조사했다. NO의 생성과 T-세포의 증식에는 역 상관관 계 있으며 Th1이 있는 상태에서는 MSCs가 NO의 생성을 유도하지만 Th2에서는 NO의 생성이 미량에 지나지 않았다.
○ 특히 일차적인 MSCs와 A54 지방전구세포는 Th1 조건에서 NO의 생성 은 높으며 T 세포에 강한 억제가 유도됐다. 이 결과는 NO가 Th1의 증
anti-IFN-g 항체가 NO 생성을 억제하고 IL-4의 억제역할은 확실하지 않아 MSCs에 의해 IFN-g가 NO생성 조절에 중요한 역할을 제시했다.
5. Retroviral 벡터를 생성하는 MSCs로 암 추적과 유전자치료
○ MSCs는 암부위에 모이는 경향이 있어 항암제를 높은 농도로 전달하는 플랫폼으로 사용할 수 있다. 이러한 표적치료는 부작용을 줄일 수 있어 retroviral로 HSVtk를 코드 하는 유전변이 MSCs를 개발해 체계적인 자 살 암유전자 치료를 시도했다. 벡터를 생성하는 MSCs(VP-MSCs)를 털 없는 마우스에 주입해서 조사했다.
○ 실험의 결과는 VP-MSCs를 주사한 마우스가 주입하지 않은 것에 암 성 장이 현저하게 억제되는 것을 확인하고 있어 VP-MSCs의 치료효과에 대해서는 더 연구가 필요하다.
6. Adeno-바이러스의 integration machinery를 이용해 사람의 MSCs에 특정한 부위에 치료유전자의 삽입
○ 조혈줄기세포, 배아줄기세포와 MSCs는 자체 복재와 여러 가지 세포라 인으로 분화가 가능하기 때문에 유전자치료와 재생의학에 관심이 있는 대상이다. 이러한 줄기세포에 유전자를 도입하기 위해서는 위험을 최소 화해야 하는데 동물바이러스 중에 Adeno-Associated Virus(AAV)만이 사람 염색체(AAVS1 (19q13.4)) 특정부위에 통합할 수 있다.
○ 미오신과 결합하는 서브유닛(MBS85)과 AAVS1 site가 일부 일치하고 유전자전이 플라스미드와 AAVS1을 통합해서 PCR로 확인하였다.
MBS85 게놈의 대등인자 와해에 대한 결과는 더 평가가 필요하지만 AAVS1-특정의 통합은 AAV를 이용해 줄기세포로 유전자 치료적용 가 능성을 시사한다.
출처 : Keiya Ozawa et. al., "Cell and gene therapy using mesenchymal stem cells (MSCs)", Journal of Autoimmunity, 30, 2008, pp.121-127
◁전문가 제언▷
○ 중간엽 줄기세포 혹은 간엽계 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells, MSC)는 섬유모세포의 모양을 가지고 있으며 실험관에서는 무한정 증 식이 가능하며 혈액줄기세포와 달리 지방, 골세포, 연골세포와 같은 중요한 세포계열로 분화할 수 있다. 그리나 MSC의 발생, 기원, 해부학 적 위치, 세포생물학적인 특성에 대해서 잘 알지 못하고 있다.
○ MSC는 재생의학에 세포의 공급원으로 중요한 세포이며 일부에서는 이 미 임상에 이용하고 있으며 활용가능성은 점점 더 커지고 있다. MSCs 는 여러 가지 질병에 대한 유전자치료와 세포치료의 플랫폼으로 기대 를 모으고 있다. 조혈줄기세포 이식(transplantation)했을 때 MSCs는 줄 기세포가 모여 여러 형태의 혈액조성에 도움이 되는 것으로 본다. 그리 고 MSCs는 중증의 이식편대 숙주병(GVHD)에 대한 치료에서 면역기 능을 환화시키는 것으로도 알고 있다.
○ 이 논문의 저자들은 이러한 면역억제에 대해서 T-세포의 증식을 MSC 가 생성하는 일산화질소(NO)로 중재하고 있다는 사실을 발견했다. 그 리고 종양을 가진 털 없는 마우스에 식별할 수 있는 MSCs를 주입한 결과 이 주입한 MSCs가 종양부위로 모이는 것을 확인했다. 이러한 사 실은 악성종양을 표적한 항암분자를 MSCs로 전달할 수 있는 가능성을 시사한다.
○ MSCs는 또 특정한 유전자를 전이하는 매체로 이용해 유전자치료에도 이 용할 수 있으며 특히 장기간의 전이된 유전자의 발현이 필요할 때는 위험 을 최소화할 수 있어야 하는데 동물바이러스 중에 Adeno-Associated Virus(AAV)가 사람 염색체 특정부위(19q13.4, AAVS1)에 통합할 수 있다.
○ 인체에는 조혈줄기세포, 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포 등 분화와 증 식을 담당하는 다양한 세포가 있어 발달과 재생을 조화롭게 수행하고 있다. 최근 이러한 세포의 기원이나 기능에 대한 기초적인 연구가 대단 한 진전을 보이고 있어 이를 임상에 적용하는데도 기대를 갖게 한다.
