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2 0 1 4 年
2 月 碩 士 學 位 論 文
수산 화인 회 석 및 제 삼인 산 칼슘 의 혼합 비 율에 따 른 골 이식 재 의 특성 비교
임 민 지
2014 年 2 月 碩士學位論文
論文
수산화인회석 및
제삼인산칼슘의 혼합 비율에 따른 골 이식재의 특성비교
朝鮮大學校 大學院
齒醫生命工學科
任 慜 智
수산화인회석 및
제삼인산칼슘의 혼합 비율에 따른 골 이식재의 특성비교
Comparative evaluation of synthetic bone grafting materials prepared by the different
mixing ratio of Hydroxyapatite and beta-tricalcium phosphate
2014年 2月 25日
朝鮮大學校 大學院
齒醫生命工學科
任 慜 智
이 論文을 理學碩士學位신청 論文으로 提出함.
2013年 10月
朝鮮大學校 大學院
齒醫生命工學科
任 慜 智
수산화인회석 및
제삼인산칼슘의 혼합 비율에 따른 골 이식재의 특성비교
指導敎授 金 秀 官
任慜智의 碩士學位論文을 認准함
委員長 朝鮮大學校 敎 授 김 도 경 印
委 員 朝鮮大學校 敎 授 김 수 관 印 委 員 朝鮮大學校 敎 授 김 재 성 印
2013年 11月
朝鮮大學校 大學院
목 차
List of Figure ⅱ
List of abbreviation ⅳ
ABSTRACT ⅴ
Ⅰ. 서 론 1
Ⅱ. 연구재료 및 방법 4
1. 이식재 제조 4
2. 용출액 준비 5
3. 생체적합성 및 친화성 실험 5
3.1. 세포주 배양 5
3.2. 세포 독성 실험 6
3.3. 세포 부착 실험 6
3.4. 통계 분석 7
4. 물리·화학적 특성 분석 7
4.1. 표면 및 기공 특성 분석 7
4.2. Ca/P 비율 분석 7
4.3. 결정상 분석 8
4.4. 화학적 성분 구조 분석 8
4.5. pH 측정 8
4.6. 용해도 분석 9
4.7. 젖음성 평가 9
Ⅲ. 결 과 10
Ⅳ. 고 찰 21
Ⅴ. 참고문헌 25
감사의 글 40
List of Figure
Figure 1. Schematic diagram to synthesize the spherical bone grafting materials with microporous structure at both its inner part and surface 4 Figure 2. Morphological analysis of spherical bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium
phosphate (β-TCP) 11
Figure 3. Cell cytotoxicity of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate
(β-TCP) 13
Figure 4. Comparison of cell attachment on the bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β-TCP) by DAPI staining and Cell Live & Dead assay 15 Figure 5. The electromicroscopic evaluation of particle size, surface roughness, and pore size on each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β -TCP) by scanning electron microscope (SEM) 17 Figure 6. The Ca/P composition of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β-TCP) by energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS) 20 Figure 7. The crystalline analysis of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β-TCP) by X-ray diffraction (XRD) 22 Figure 8. The structural analysis of chemical composition of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β-TCP) by Fourier Transform Infrared
(FT-IR) spectroscopy 24
Figure 9. The pH of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β -TCP) by both pH meter and pH test paper 26
Figure 10. The solubility of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β
-TCP) 28
Figure 11. The wettability of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate
(β-TCP) 30
List of abbreviation
GBR Guided bone regeneration BMP Bone morphogeneic protein HA Hydroxyapatite
TCP Tricalcium phosphate
MFDS Ministry of Food and Drug Safety
NiFDS National Institute of Food and Drug Safety Evaluation FBS Fetal Bovine Serum
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium HNOKs Human normal oral keratinocytes KCLB Korea cell line bank
MTT 3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide DMSO Dimethyl Sulfoxide
OD Optical density
DAPI 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DPBS Dulbecco's phosphate-buffered saline
SEM Scanning Electronic Microscopy
EDS Energy Dispersive X-ray Spectrometer XRD X-ray Diffractometer
FT-IR Fourier-transform infrared spectroscopy
ABSTRACT
Comparative evaluation of synthetic bone grafting materials prepared by the different mixing ratio of
Hydroxyapatite and beta-tricalcium phosphate
According to increasing aging-population by the economical growth and the advancement of medicine, patients with aging-related oral diseases and implant placement have being rapidly increased in recent years. Therefore, bone grafting therapy has become an integral part of dentistry. However, bone graft materials have played an important role in regenerative dentistry for many years.
Furthermore, patients are requiring to develop better bone graft materials that is considering a predictability, biological function, bio-compatability, biological safety, economical cost, and esthetics in the oral clinical fields.
Bone graft materials are classified as four divisions according to the its basic compounds : autogenous, allograft, alloplast, and xenograft. The ideal bone graft materials has always been autogenous bone, which is derived from the individual for whom the bone graft is intended. Even though autogenous bone can permit the excellent predictability and have osteogenesis, osteoinduction, and osteoconduction
Min-Ji Yim
Advisor: Prof. Su-Gwan Kim D.D.S., Ph.D.
Department of Bio Dental Engineering, Graduate School of Chosun University
with bio-compatability and biological safety, it need to harvest from the surgical patient from whom a second surgical wound site must be used. Although autologous bone graft have a major disadvantage, it offers the promise of high levels of success while avoiding the possibilities of antigenicity. Allografts are tissues taken from individuals of the same species as the hosts. A major advantage of allograft is that the materials can without the requirement of a secondary surgery to harvest the bone at other site. While, disadvantages are that the materials prepared from cadaver or donor have a cultural taboos, social ethics, and antigenicity. Xenografts are derived from other species. It is need to totally remove the their organic components to avoid the immunological reactions becomes nonexistent. Because the inorganic materials maintains the physiological dimension of the augmentation during the remodeling phases. Therefore, alloplastic bone graft materials guaranteed with biological safety have became noted. Alloplasts are synthetic bone graft materials which contribute to the repair of defective bone and to the enhancement of bone ingrowth. Today, with the use of synthetic bone graft materials composed of bioceramic tricalcium phosphate and hydroxyapatitie, it is possible to enhance the volume, width, and height of bone in deficient areas to regenerate the bone supporting implant replacement.
In this study, we aimed to compare the characteristics of synthetic bone graft materials according to various ratios (4:6, 5:5, 6:4) of hydroxyapatite (HA) and β- tricalcium phosphate (β-TCP). For this purpose, bone graft materials with different HA/β-TCP ratios (4:6, 5:5, 6:4) were investigated in terms of physicochemical properties and in vitro biocompatibility properties. These physicochemical properties were analyzed by scanning electron microscopy(SEM), energy dispersive X-ray spectrometer(EDS), X-ray Diffractometer(XRD), Fourier-transform infrared spectroscopy(FT-IR), pH measurement, water degradation, and wettability test.
At all the ratios of HA/β-TCP, porous spherical bone graft materials with a particle size of 0.5 to 1.0 mm and pH value of 8 to 9 could be fabricated.
Furthermore, the MG-63 osteoblasts-like cells actively adhered to the surface of bone graft materials while MG-63 cells and human normal oral keratinocyte (HNOK) did not have influence on the cell cytotoxicity of HNOKs. In particular, 4:6 HA/β-TCP bone graft materials (1.63), in the result of EDS, were more like a
dental enamel (1.62). On the other hand, the degradation of 6:4 HA/β-TCP bone graft materials was higher than that of other HA/β-TCP ratios (4:6, 5:5) during the 120 hours.
These data demonstrated that all of synthetic bone grafting materials prepared by the different mixing ratio of HA/β-TCP (4:6, 5:5, 6:4) have a physicochemical properties and biological safety resulted by the evaluation guide-line for synthetic bone grafting materials supplied from the Ministry of Food and Drug Safety, Republic of Korea. Particularly, synthetic bone grafting materials composed of 4:6 HA/β-TCP have more reasonable a physicochemical properties and biological safety more than others. Furthermore, biological evaluation of synthetic bone grafting materials in experiment animal model is required as our further study.
Ⅰ. 서 론
경제 성장과 의학의 발달로 인해 65 세 이상 노령 인구가 전체 인구의 7%를 넘어 선 고령화 사회에 진입하였고, 이에 따라 치과 영역에서는 노인성 구강질환 및 임플란 트 시술 환자가 급격히 증가하고 있는 실정이다. 골 소실 환자는 노령인구의 경우 감 염성 질환이나 외상 등으로 인해 유도되어지며, 최근에는 지속적인 플라크 (Plague)와 치석 (Dental calculus)의 축적으로 인해 염증 및 통증, 구취 등을 동반하며 골 소실을 유도하는 치주질환으로 인한 경우가 증가하고 있다. 특히 치주질환은 20 대 성인에서 부터 40 대 이상의 장·노년층에 이르기 까지 성인 발병률이 높은 질환으로 고혈압, 관 절염, 면역질환, 암 등의 합병증에도 직·간접적인 원인이 되고 있어 이에 따른 치료와 관리의 중요성이 부각되고 있다 [1-3].
치주질환을 비롯한 다양한 원인으로 유도되어지는 골 소실의 치료 및 시술 방법으 로는 소실된 치조골의 골 결손부를 치은 조직이 덮지 못 하도록 다양한 종류의 골 이 식재를 사용하여 시행되어지는 골 이식술(Bone grafting) 및 골유도 재생술(Guided bone regeneration, GBR) 등이 있다. 이는 골 이식재가 임플란트와 치주 조직 간의 결 합력을 향상시켜 골 재생 효과를 높여주고, 골 이식재로 메워진 골 결손부의 신생골 형성에 효과적이기 때문이다. 이러한 골 이식술이 기능적 뿐만 아니라 심미적 기능으 로 보편화됨에 따라 수술 및 시술에 앞서 골 결손부의 잔존 골량이 부족한 경우를 대 비한 다양한 종류의 골 이식재 중 장단점을 고려하여 자신에게 맞는 골 이식재를 선택 하는 것 또한 중요한 치료 요소로 꼽히고 있다 [4-6].
골 이식재의 종류로는 자가골(Autogenous bone), 동종골(Allograft bone), 이종골 (Xenograft bone), 합성골 이식재(Synthetic bone substitute, Alloplastic bone material)가 있으며, 이들은 기본적으로 감염 등의 면역반응을 일으키지 않고, 골 형성 과 이를 위한 재 혈관화를 촉진시켜 신생골을 형성하는 지지체로써의 역할을 하게 된 다. 일반적으로 골 이식재는 골 형성세포에 의해 직접적으로 신생골을 형성하는 골 형 성성(osteogenesis)과 이식재 내부로 혈관과 골조직의 공급을 원활하게 하여 이식재 흡 수와 신생골 침착으로 골을 형성하는 골 전도성(osteoconduction), 그리고 이식재 내부 에 있는 골 형성 단백질(bone morphogeneic protein, BMP) 등의 골 유도 물질을 통해 신생골을 형성시키는 골 유도성(osteoinduction)으로 나눠 평가하게 된다 [7-9].
자가 골 이식재(Autogenous bone graft material)는 본인의 뼈를 사용한 이식재로
골 형성성 및 유도성과 전도성을 모두 갖춘 가장 이상적인 조건의 예견성이 좋은 골 이식재로 잘 알려져 있다. 그러나 골 채득을 위한 부가적인 수술과 이로 인한 감염 등 의 합병증을 유발시킬 가능성이 있고, 채득량의 한계가 있는 점에서 이를 대체하기 위 한 골 이식재의 연구 개발이 지속적으로 이루어져 왔다 [7,10-12,16]. 동종 골 이식재 (Allogenic bone graft material)는 기증된 사체 (死體) 로부터 획득된 뼈를 사용한 이 식재로, 유전적으로 유사한 치유능력과 골 유도능을 기대해 볼 수 있으나 면역적인 거 부반응 및 질병에 대한 수평전염 가능성을 내포하고 있으며, 고가의 비용부담과 더불 어 사체 매매에 대한 윤리적 문제 또한 제기되고 있다 [7,13-18]. 이종 골 이식재 (Xenograft bone graft material) 는 소, 돼지 등의 동물 뼈를 사용하여 비교적 구입이 용이한 장점을 가지고 있으나, 광우병과 같은 동물 전염병에 대한 우려가 있으며, 소독 과정에서 유기질을 태우고 무기질만을 남기는 탈단백 과정으로 인해 골 재생 능력이 떨어지는 것으로 알려져 있다 [19-21]. 따라서 부가적인 수술 및 골 채득에 대한 제한 성과 생물학적 안전성을 확보한 경제적인 합성골 이식재(Synthetic bone grafting material) 는 현재 성공적으로 임상에 적용되고 있다. 합성골 이식재는 골을 구성하고 있는 유사물들을 인공적으로 합성하여 만들어진 골대체물로서, 골 재생을 위한 이상적 인 조건을 갖추기 위해 많은 연구와 좋은 결과의 제품들이 지속적으로 개발·보완되어 지고 있다 [22-24].
인체의 뼈와 치아의 대부분은 칼슘 (Ca)과 인 (P) 등의 무기물로 구성되어 있으며, 합성골 이식재는 이러한 인체의 성분과 구조가 유사한 생체재료를 사용하여 만들어진 다 [24-26]. 다양한 생체재료 중 일반적으로 합성골 이식재에 사용되고 있는 재료는 인 산칼슘(Calcium phosphate, Ca3(PO4)2) 계 생체재료가 있으며, 대표적으로 수산화인회 석(Hydroxyapatite, HA, Ca10(PO4)6(OH)2)과 제삼인산칼슘(Tricalcium phosphate, TCP, Ca3(PO4)2) 등 이에 해당한다. HA는 생체 뼈와 가장 유사한 화학적 구조를 나타내며 우수한 생체적합성 및 안정성을 나타내는 생체 이식용 세라믹으로 알려져 있는 반면, 체내 삽입 시 낮은 용해도로 신생골 형성하여 지지체로서의 기능을 하는데 오랜 시간 이 소요되며, 골 재생 속도를 지연시키는 단점을 가지고 있다 [27-32]. 반면 TCP는 고 온에서 안정상을 찾는 α-TCP와 저온에서 안정상을 찾는 β-TCP가 있으며, α-TCP의 경우 수분과 쉽게 반응하기 때문에 합성골 이식재의 재료로는 β-TCP가 주로 사용되 고 있다 [41]. β-TCP는 HA와 달리 체액과 여러 용액에서의 용해 및 흡수율이 뛰어나 며, 골 치환 속도가 빠르고, 생체분해성 또한 우수한 생체재료로 알려져 있다 [33-38].
그러나 체내 조직과 혈관이 채워지기도 전에 빠른 분해가 이루어져 생체 분해 속도에
대한 조절이 필요하다 [39]. 따라서 HA와 β-TCP의 장단점을 고려하여 현재 정형외과 와 치과영역에서는 생체적합성과 골 전도성을 유지하면서 생체 분해 속도조절이 가능 한 HA/β-TCP 복합체인 이상인산칼슘(Biphasic calcium phospate, BCP) 골 이식재에 주목하여 사용되고 있으며, 많은 연구가 수행되고 있다 [40].
HA/β-TCP를 혼합한 BCP는 HA를 단독으로 체내에 이식하였을 때에도 우수한 안 정성을 보이지만, β-TCP를 함께 사용함으로서 β-TCP의 높은 생체분해성으로 인해 체내의 환경과 반응하여 기공을 형성하고 신생골 형성을 향상시키며, β-TCP를 단독 으로 사용할 때 보다 더 효율적인 생체분해성을 지니는 것으로 알려져 있다 [42]. 이러 한 HA/β-TCP의 혼합 비율에 있어서 HA의 비율이 β-TCP보다 높을 때 신생골 형성 이 증가한다는 보고가 있으며, 더불어 골 이식재의 조건으로서 β-TCP의 생체분해성 과 기계적 강도를 보고하는 연구가 있기 때문에 일반적으로 HA/β-TCP 비율이 6:4 인 경우가 가장 많이 사용되고 있다. 그러나 가장 적합한 HA/β-TCP의 혼합비율에 대 한 제시는 여전히 명확하지 않은 상황이다 [42-43].
따라서 본 연구에서는 다양한 혼합 비율로 제작하여 사용되어지고 있는 HA/β -TCP 합성골 이식재 중 4:6, 5:5, 6:4 의 혼합 비율을 가진 합성골 이식재를 한국 식품 의약품 안전처(Ministry of Food and Drug Safety, MFDS)와 한국 식품의약품 안전평 가원(National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, NiFDS) 에서 제공한 의 료기기 평가가이드라인에 의거하여 생물학적, 물리·화학적 특성을 분석하여 골 이식 시 예견성이 좋고, 효율적이며 경제적인 합성골 이식재의 혼합 비율 및 각각의 특성을 평가하고자 하였다.
Ⅱ. 연구재료 및 방법
1. 이식재 제조
HA와 β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 비율로 혼합하여 Figure 1과 같은 합성 방법에 따라 1% Alginic acid (Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA) 수용액과 함께 24 시간 동안 교반 시킨 후, 각각의 슬러리를 제조하였다. 21 Gauge needle과 Syringe를 이용하여 슬러리를 액체 질소와 반응시켜 고체화 된 구형의 반응물을 획득하였다. 회수한 반응 물은 동결건조 과정을 거쳐, 100 ℃/hr에서 1,230 ℃까지 고온소결처리를 하여 다공성 을 가진 구형의 이식재를 제조하였다 [32]. 각각의 비율에 따른 합성골 이식재의 입자 크기는 0.5 ∼ 1.0 mm 로 구분하여 실험에 사용하였다 [33].
Figure 1. Schematic diagram to synthesize the spherical bone grafting materials with microporous structure at both its inner part and surface.
2. 용출액 준비
HA/β-TCP 합성골 이식재의 비율에 따른 생체적합성 및 안정성을 평가하기 위하여 본 연구에서는 MFDS의 “의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격 (식품 의약 품 안전처 고시 제2006-32호)” 제9장 ‘검체 준비 와 표준물질’에 의거하여 세포독성실 험 및 안정성 평가에 필요한 비율별 HA/β-TCP 합성골 이식재의 용출액을 획득하였 다.
용출에 사용할 4:6, 5:5, 6:4 비율의 HA/β-TCP 합성골 이식재는 고압멸균 처리 후, 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (PAA Laboratories, NJ, USA) 가 포함되지 않은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Welgene, Daegu, Republic of Korea) 배지에서 각각 0.1 g/mL 농도로 침전시키고, 37℃에서, 72 시간 씩 3 차 용출 을 시행하였다.
3. 생체 적합성 및 친화성 실험
3.1. 세포주 배양
생체적합성 평가를 위하여 MFDS의 “의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규 격 (식약처 고시 제 2006-32 호)” 제 2 장 ‘세포독성시험’에 의거하여 Human normal oral Keratinocytes (HNOKs) 구강 정상세포와 MG-63 인체 조골세포를 ScienCell Res earch Laboratories (Carlsbad, CA, USA)와 한국 세포주 은행 (KCLB, Korea cell line bank, Seoul, Republic of Korea)으로 부터 각각 분양받아 제시된 배양 조건에 따라 세 포배양을 실시한 후, 본 연구에 사용하였다. 각 세포들은 10% FBS과 1% Penicillin/st reptomycin이 함유된 DMEM, 배지와 37℃의 5 % CO2 배양기에서 배양하였으며, 2∼
3 일 간격으로 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
3.2. 세포 독성 실험 (MTT assay)
HA/β-TCP 합성골 이식재의 비율에 따른 세포독성 평가를 위하여 3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 시행하였다.
HNOK 구강정상세포 및 MG-63 사람 조골세포를 각각 96 well cell culture plate에 1
× 104 cells/well 의 농도로, 10% FBS와 1% Penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM 배지와 함께 분주하였다. 합성골 이식재의 혼합 비율에 따라 10% FBS가 포함되지 않 은 무혈청 배지에서 72 시간동안 3차에 걸쳐 용출시킨 반응물을 첨가한 후 24 시간 동 안 37℃, 5％ CO₂배양기에서 배양시켰다. 대조군으로는 이식재의 용출물을 첨가하지 않은 무혈청 배지에서 자란 각각의 세포를 사용하여 비교하였다. 각각의 실험군과 대 조군에 MTT 용액을 20 ㎕씩 처리하고, 5％ CO₂, 37 ℃ 조건에서 4 시간 동안 반응 시켰다. 배지를 제거하고 Dimethyl Sulfoxide (DMSO)를 200 ㎕씩 처리하여 MTT 용 액에 의해 형성된 crystal formazan을 용해시켜 ELISA Reader (EPOCA; Bioteck instruments inc, VT, USA)를 이용하여 흡광도 (Optical density, OD) 540 nm에서 측 정하였다. 세포의 생존율은 대조군의 흡광도에 대한 실험군의 흡광도를 백분율로 환산 하여 계산하였다.
3.3. 세포 부착 실험
HA/β-TCP 합성골 이식재의 비율에 따른 세포 친화성을 확인하기 위하여 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) stain과 LIVE/DEAD® Reduced Biohazard Cell Viability Kit (Invitrogen, NY, USA) 를 사용하여 제조회사로부터 제 공된 분석방법에 따라 세포부착실험을 각각 시행하였다. 배양된 MG-64 조골 세포를 각각 HA/β-TCP 혼합 비율에 따라 well당 25 mg의 이식재가 함유된 24 well plate에 5 × 105 개로 접종하여 37℃, 5％ CO₂조건 하에서 배양하였다.
DAPI stain을 이용한 실험에서는 배지를 완전히 제거하고 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)으로 2 회 세척한 후 4% Paraformaldehyde로 15 분 간 고정시켰다. 그 후 DPBS로 2 회 세척 하고 형광현미경 (Eclipse TE200; Nikon
Instruments, NY, USA)을 이용하여 세포의 부착을 관찰하였다.
Live & dead cell viability assay를 이용한 생존세포와 손상세포 관찰은 1X DPBS 로 세척한 후 빛을 차단한 상온에서 1X DPBS와 Green calcein (생존세포), Ethidium homodimer (손상세포)을 포함한 반응액을 첨가하고 30∼40 분 동안 반응하여 이식재 에 부착된 세포를 염색하였다. 4% Paraformaldehyde를 사용하여 염색된 세포를 고정 시키고 몇 차례 세척 및 용액 제거 후, 형광현미경을 이용하여 부착된 조골 세포의 생 존 정도를 관찰하였다.
3.4. 통계 분석
본 실험의 통계처리는 SPSS 10.0 Version 프로그램을 사용하여 평균과 표준오차를 구하고, 이들의 통계학적 유의성은 일원분산분석법(ANOVA)을 이용하여 사전 검정하 였으며, 사후 검정은 Tukey법을 사용하였다. (p<0.05)
4. 물리·화학적 특성 평가
4.1. 표면구조 분석
HA/β-TCP 합성골 이식재의 비율에 따른 표면구조의 형태학적 특성을 분석하기 위 하여 MFDS "치과용 골 이식재의 물리·화학적 특성 평가가이드라인"에 명시된 표면분 석방법에 따라 주사전자현미경 (Scanning Electronic Microscopy, SEM; JSM 840-A, JEOL co., Japan)을 사용하여 각각 100 배, 500 배, 1500 배, 5000 배의 배율로 관찰하 였다.
4.2. Ca/P 비율 분석
HA/β-TCP 합성골 이식재의 비율에 따른 칼슘과 인을 포함한 구성 성분의 정성과 정량 분석을 위하여 Energy Dispersive X-ray Spectometer (EDS, XS-160, Japan)를 사용하여 칼슘과 인의 성분비를 분석하였다.
4.3. 결정상 분석
HA/β-TCP 합성골 이식재의 비율에 따른 결정상의 변화를 분석하기 위하여 4:6, 5:5, 6:4 의 비율로 각각 혼합시킨 이식재와 대조군 이식재를 분말 형태로 분쇄한 후, X-선회절분석기 (X-ray Diffractometer, XRD; X'Pert PRO MRD, PANalytical co., Netherlands)를 사용하여 10° ∼ 60° 조건에서 측정하였다.
4.4. 화학적 성분 구조 분석
HA/β-TCP 합성골 이식재의 비율에 따른 화학적 성분 구조를 비교·분석하기 위하 여 적외선 분광 분석기 (Fourier-transform infrared spectroscopy, FT-IR; Nicolet 6700, Thermo Electron, USA)를 이용하여 분석을 시행하였다.
4.5. pH 측정
HA/β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 비율로 제작한 합성골 이식재의 pH 값을 측정하기 위하 여 MFDS “의료기기 생물학적 안전에 관한 공통기준규격-검체준비와 표준물질”에 제 시된 방법에 따라 고압 멸균 처리된 각각의 HA/β-TCP 합성골 이식재를 10% FBS가 포함된 DMEM과 FBS가 포함되지 않은 free DMEM 배지에 각각 0.1 g/mL 농도로 침전시킨 후, 37 ℃에서 용출하여 pH 측정기와 pH 시험지를 이용하여 측정하였다.
4.6. 용해도 분석
HA/β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 비율로 제작한 합성골 이식재의 용해도를 평가하기 위하 여 MFDS "치과용 골 이식재의 물리·화학적 특성 평가가이드라인" 에 따라 용해도 시 험을 시행하였다. 혼합 비율별로 제작한 합성골 이식재를 각각 10 g씩 용기에 담은 후, 용기의 무게와 이식재를 포함한 용기의 무게를 측정하였다. 100 mL 의 증류수로 이식재를 완전히 침지 시킨 후 교반배양기 (20 ℃, 120 rpm) 에서 120 시간 동안 교반 시켰다. 잔류물이 없는 여과지의 무게를 측정하고, 시료를 제거한 후 여과잔류물과 여 과지를 증류수로 세척하여 100 ℃에서 완전히 건조시켰다. 건조 후 여과 잔류물이 포 함된 여과지의 질량을 측정하고 시료의 무게와 여과 잔류물의 질량차이를 분석하였다.
4.7. 젖음성 평가
MFDS “치과용 골이식재의 물리·화학적 특성 평가가이드라인”에 명시된 젖음성 평 가 방법에 의거하여 HA/β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 비율로 제작한 골 이식재 0.5 g 에 증 류수 1 mL를 주입시킨 후 30 분간 방치하였다. 1 mL의 micropipette을 이용하여 한번 의 흡입으로 최대한의 증류수를 포집하고, 남은 용기 내에 있는 골 이식재와 남은 증 류수의 무게를 측정하였다. 골 이식재에 남아있는 증류수의 중량비율을 계산하여 이를 평균과 표준편차를 기록하여 평가하였다.
Ⅲ. 결 과
1. 이식재 제조 결과
실험에 사용한 HA/β-TCP 혼합비율에 따른 각각의 합성골 이식재는 골 이식재로서 보다 적합한 조건을 갖추기 위하여 인체의 해면골 (Trabecular bone) 구조와 유사한 다공성을 가진 구형의 골 이식재의 구조로 제조하였다 (Fig 2). 이는 높은 다공성과 함 께 구형을 형성하는 골 이식재의 구조가 이식재 입자간의 공간과 이식재 내의 기공을 형성함으로써 이식부의 원활한 골 생성 및 신생혈관 형성을 도우며, 임플란트 식립 시 에도 임플란트와 골 조직 간의 결합성을 가속화 시켜 골 재생을 촉진시키기 때문이다 [32]. 이러한 이유로 본 연구에서는 HA/β-TCP의 혼합비율만을 달리하여 모두 동일한 방법과 크기로 이식재를 제조하여 실험에 사용하였다.
Figure 2. Morphological analysis of spherical bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of hydroxyapatite (HA) and β -tricalcium phosphate (β-TCP). Slurries were prepared by defined mixing ratio of HA and β-TCP in 1% alginate solution at room temperature for 24 hrs, were drop wised into liquid nitrogen by syringe pump attached with 21 gauge needle to format the spherical shape with microporous at both its inner part and surface, and were performed the hot-sintering at 1,230℃ to synthesize bone grafting materials.
A, synthesized spherical bone grafting materials sized with 0.5 ∼ 1.0 ㎜. B, electomicrosopic morphology of synthesized spherical bone grafting material.
2. 세포 독성 실험 결과
MTT assay를 이용한 HA/β-TCP 혼합 비율에 따른 합성골 이식재의 세포 독성 및 생체적합성을 확인하기 위하여 HNOK 구강정상세포와 MG-63 인체 조골세포를 대상 으로 각각의 세포 생존율을 확인 한 결과, 모두 1 차 용출에 비해 2 차, 3 차 용출에서 더 높은 세포생존율을 보였다. 이는 고농도의 칼슘으로 인한 세포독성이 이식재로부터 유도되었으며, 용출과정을 통해 칼슘의 농도가 희석되어져 나타난 결과로 사료된다. 특 히 HA/β-TCP 혼합 비율이 4:6 일 때 HNOKs 정상세포와 MG-63 조골세포 모두에서 가장 높은 세포생존율을 나타내었다 (Fig 3).
Figure 3. Cell cytotoxicity of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β-TCP). Effluents of each bone grafting materials for measuring the cell cytotoxicity were prepared by following the guide lines provided by Ministry of Food and Drug Safety (MFDS), Republic of Korea. Briefly, 0.1 g of bone grafting material was immersed in 1 mL of serum-free DMEM media at 37℃ for 72 hrs to prepare the effluent for cell cytotoxicity assay. Cell cytotoxicity of bone grafting material was performed by MTT assay on the human normal oral keratinocytes (A) and MG-63 human osteoblast-like cells stimulated with their effluents for 24 hrs following the guide lines provided by Ministry of Food Drug Safety (MFDS), Republic of Korea. Cell cytotoxicities of each bone grafting materials were relatively represented by non-treated control. The data are reported as mean±SD of three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01 as determined by the Student’s t-test compared to the control.
3. 세포 부착 실험 결과
DAPI staining를 이용한 HA/β-TCP 혼합 비율에 따른 합성골 이식재의 세포 부착 및 세포친화성 분석하기 위하여 MG-63 세포를 이식재에 부착한 결과, HA/β-TCP 혼 합비율이 4:6, 5:5, 6:4 일 때 모두 높은 세포 부착성을 나타내었다 (Fig. 4). 또한 Live
& dead cell viability assay를 이용하여 HA/β-TCP 혼합 비율에 따른 합성골 이식재 의 부착된 조골세포의 세포생존율을 확인한 결과, 모두 98% 이상의 생존 세포 (Green calcein : Green color)를 나타내었으며, 사멸된 세포 (Ethidium homodimer : Red color)는 2% 이하로 확인되었으나, HA/β-TCP 혼합 비율이 6:4 일 때 가장 높은 세포 생존률을 나타내었다 (Fig 4).
Figure 4. Comparison of cell attachment on the bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β -tricalcium phosphate (β-TCP) by DAPI staining and Cell Live & Dead assay. A, assessment of cell attachment on the bone grafting materials by DAPI (A, left panel) and cell live and dead assay (B, right panel). 5 × 105 MG-63 cells were plated with each synthesized bone grafting materials at 24-well plates for 24 hrs. Attached MG-63 cells on the bone grafting materials were visualized by nucleus staining using DAPI under the inverted fluorescent microscope. However, cell live and dead assay was performed to determine the live and dead cells attached on each bone grafting materials. 5 × 105 MG-63 cells were plated with each synthesized bone grafting materials at 24-well plates for 24 hrs. Live cells (green color) stained by green calcein and dead cells (red color) stained by etidium homodimer were visualized and counted under the inverted fluorescent microscope.
B, live and dead cells attached on each bone grafting materials were counted and histogramed after cell live and dead assay.
4. 물리·화학적 특성 평가 4.1. 표면구조 관찰 결과
합성골 이식재의 구조에 있어서 입자크기 (Particle size), 결정화도 (Crystallinity), 미세공극 (Microporosity)과 거시공극 (Marcroporosity), 공극크기 (Pore size) 및 표면 거칠기 (Surface roughness)와 공극률 (Porosity) 등은 이식재를 식립하였을 때 생체활 성과 밀접한 관련이 있으며 [34-35], 주사전자현미경을 이용하여 HA/β-TCP 혼합 비 율에 따른 합성골 이식재의 표면을 관찰한 결과 배율에 따라 이러한 이식재의 입자크 기, 표면 거칠기, 공극크기 등의 형태학적 특성을 분석할 수 있었다 (Fig. 5).
저배율 (100 배)에서는 각 혼합비율에 따른 이식재의 입자크기와 형태를 관찰 할 수 있었으며, 본 연구에서는 이식재 제조 후 동일한 크기의 이식재를 사용하기 위하여 입 자크기를 구분하는 과정을 걸쳐 실험을 진행하였다. 그 결과 저배율 표면관찰을 통해 각 비율에 따른 합성골 이식재의 크기가 모두 0.5 - 1.0 mm로 균일한 크기인 것을 확 인할 수 있었으며, 더불어 완전한 구형구조를 이루고 있음 확인하였다.
500 배, 1500 배에서는 각 HA/β-TCP의 혼합비율에 따른 이식재의 표면 거칠기를 관찰할 수 있었으며 모두 균일한 거칠기 구조를 형성하고 있음을 확인하였다.
5000 배에서는 약 10 ㎛ 이하의 미세공극 및 100 ㎛ 이상의 거시공극과 공극간의 구 조를 모두 관찰할 수 있었으며, 특히 HA/β-TCP 4:6 비율인 합성골 이식재에서 약 130 ㎛ 의 가장 큰 거시공극의 형성을 확인하였다. 골 이식재에 있어서 이러한 거시공 극은 신생혈관의 내부성장과 골 형성을 위한 세포 부착의 골격 및 지지체로서의 역할 을 하며 [36], 더불어 공극 간의 상호연결이 골 성장과 골 전도를 일으키는 중요한 요 소가 된다 [37-39]. 이러한 결과를 토대로 HA/β-TCP 혼합 비율이 4:6 인 합성골 이 식재가 비교적 이상적인 합성골 이식재의 표면을 형성하고 있는 것으로 사료된다.
Figure 5. The electromicroscopic evaluation of particle size, surface roughness, and pore size on each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β -TCP) by scanning electron microscope (SEM). A, the electromicroscopic images to observe the size and shape of each bone grafting materials at magnified 100×. B & C, the electromicroscopic images to observe the surface roughness of each bone grafting materials at magnified 500× and 1,500×. D, the electromicroscopic images to observe the macroporosity and pore structure of each bone grafting materials at magnified 5,000×.
4.2. Ca/P 비율 분석 결과
EDS 분석을 이용한 HA/β-TCP 혼합 비율에 따른 합성골 이식재의 칼슘과 인의 원 소비율 (Ca/P)을 확인한 결과 (Fig. 6), HA/β-TCP 혼합 비율이 4:6 일 때 합성골 이 식재의 Ca/P 비율이 1.64로 일반적인 인체 경조직(에나멜 1.62, 뼈 1.65)의 Ca/P 비율 과 가장 유사하게 나타났다 [43]. 나머지 5:5 비율의 HA/β-TCP 합성골 이식재는 1.91, 6:4 비율의 HA/β-TCP 합성골 이식재는 1.79의 결과를 나타내었다. 모든 합성골 이식 재는 산소 (O), 칼슘(Ca), 인(P) 만이 존재하였다
Figure 6. The Ca/P composition of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β-TCP) by energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS). A, the Ca/P composition of each bone grafting materials by EDS. B, Histogram synthesized bone grafting materials based on the EDS results. The Ca/P ratio value 1.64 of synthesized bone grafting materials as defined mixing ratio of HA:β -TCP=4:6, have showed a similar Ca/P ratio of bone tissue isolated human body.
Furthermore, EDS data have been shown that all of synthesized bone grafting materials had composed of O, Ca, and P.
4.3. 결정상 분석 결과
HA/β-TCP 혼합 비율에 따른 각각의 합성골 이식재의 결정상 분석을 위한 XRD 분 석 결과에 따르면 HA/β-TCP의 4:6, 5:5, 6:4 혼합 비율에 따른 합성골 이식재 모두에 서 다른 미지의 2 차상은 나타나지 않았으며 HA 상과 β-TCP 상을 모두 동일하게 관 찰하였다. 특히 HA/β-TCP 비율이 4:6, 5:5, 6:4 비율로 변화됨에 따라 감소하는 β -TCP 상의 peak를 확인할 수 있었다 (Fig 7).
Figure 7. The crystalline analysis of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β -tricalcium phosphate (β-TCP) by X-ray diffraction (XRD). A, HA:β-TCP ratio = 4:6. B, HA:β-TCP ratio = 5:5. C, HA:β-TCP ratio = 6:4. XRD data have been shown that unexpected 2nd Peak did not observed in all of synthesized bone grafting materials as the defined mixing ratio of HA and β-TCP. Furthermore, peaks of β-TCP were decreased by increasing HA ratio.
4.4. 화학적 성분 구조 분석 결과
FT-IR을 통해 HA/β-TCP 혼합 비율에 따른 합성골 이식재의 화학적 성분 구조 분 석 결과, 4:6, 5:5, 6:4 비율로 혼합된 HA/β-TCP 합성골 이식재 모두에서 orthophosphate (566 cm-1, 603 cm-1, 940 ∼ 1120 cm-1, PO4)와 OH 흡수파장 (3573 cm-1, 631 cm-1, stretching, bending vibration)을 관찰하였다. 전체적으로 유사한 spectra를 형성하고 있으나 6:4 비율의 HA/β-TCP 합성골 이식재에서는 관찰할 수 없 었던 HPO4 흡수파장(880 cm-1)이 4:6 비율의 HA/β-TCP 합성골 이식재에서 형성하 고 있음을 볼 수 있었다. 극히 작은 부분의 파장 변화이기는 하지만 HA/β-TCP 혼합 비율이 4:6 비율에 가까울수록 점차 형성되어지는 HPO4 흡수파장은 HA/β-TCP 혼합 비율이 4:6 인 합성골 이식재가 비화학양론 (Nonstoichiometry) 조성의 HA이거나 낮 은 결정화도의 시료라는 것을 보여주는 결과가 되었다 (Fig 8).
Figure 8. The structural analysis of chemical composition of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β-TCP) by Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopy. A, HA:β-TCP=4:6. B, HA:β-TCP=5:5. C, HA:β-TCP=6:4.
FT-IR data have been shown that all of synthesized bone grafting materials as the defined mixing ratio of HA and β-TCP have a similar chemical composition.
4.5. pH 측정 결과
HA/β-TCP 혼합 비율에 따른 합성골 이식재의 pH 값을 측정한 결과, pH 시험지와 pH 측정기를 사용한 결과, 모두에서 pH 8.5 ∼ 9.0 의 인체에 적합한 pH 값의 색상과 수치를 나타내었다. 골 이식재 제조에 있어서 pH 값은 Ca/P 비율, 결정화도, 용해도 등을 결정하는 중요한 요소가 되며, 골 이식재로 제조 시 생체 내 환경과 유사한 pH 조건을 설정이 필요하다 (Fig 9).
Figure 9. The pH of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β -TCP) by both pH meter and pH test paper. A, the pH values of effluents of each bone grafting materials prepared by following the guide lines provided by Ministry of Food and Drug safety (MFDS), Republic of Korea, were measured by pH meter. B, the pH values of effluents of each bone grafting materials were visualized by pH test paper. All of synthesized bone grafting materials as the defined mixing ratio of HA β-TCP have been shown the pH value ranges of 8.5
∼ 9.0. These pH values of bone grafting materials were similar with the physiological optimized pH value of human body.
4.6. 용해도 분석 결과
일반적으로 β-TCP는 HA보다 높은 용해도와 흡수성을 가진 생체재료로 알려져 있 다. 이러한 특성으로 β-TCP는 HA와 혼합한 이식재로 많은 연구가 진행되어왔다 [40-42]. 그러나 용해도 분석 결과, 4:6 비율의 HA/β-TCP 합성골 이식재에서 β-TCP 비율이 가장 높음에도 불구하고 다른 HA/β-TCP 혼합 비율에 비해 상대적으로 가장 낮은 용해도의 결과가 나타났으며, 반면 6:4 비율의 HA/β-TCP 합성골 이식재에서는 4:6 비율의 HA/β-TCP 합성골 이식재에 비해 약 3 배 높은 용해도를 나타내었다. 이 를 통해 HA의 혼합 비율이 높아질수록 용해도가 증가하는 것을 확인하였으며, β -TCP의 혼합 비율이 낮아질수록 생체 이식 후의 안정적인 골 이식이 이루어질 수 있 음을 제시하는 결과를 확인하였다. 더불어 이식재에 있어서 가장 적합한 용해도의 정 도를 확인하기 위한 세부적인 실험이 필요한 것으로 사료된다 (Fig 10).
Figure 10. The solubility of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β -TCP). The solubility of bone grafting material was measured by the protocol provided by Ministry of Food and Drug Safety (MFDS), Republic of Korea.
Solubility of bone grafting material was increased by the increasing of HA composition. This data is suggesting that the β-TCP might be rapidly absorbed more than HA and regulates the absorbancy of bone grafting materials composed of HA and β-TCP. Furthermore, bone grafting materials synthesized as mixing ratio of HA:β-TCP=4:6 might have better stability more than other bone grafting materials in clinical bone graft.
4.7. 젖음성 평가 결과
일반적으로 Contact angle 측정법에 의해 평활한 면에 증류수 등을 점적하여 그 접 촉각을 측정하여 평가하는 방법으로 젖음성 평가가 이루어지지만 치과용 골 이식재와 같은 다공체의 시료의 경우 접촉각을 측정할 수 없기 때문에 물 담지성 시험으로 실험 을 진행하였다. 그 결과 HA/β-TCP 비율 6:4 일 때를 제외하고 모두 90% 내외 높은 젖음성을 나타내었으며 특히 HA/β-TCP 비율 5:5 일 때 가장 젖음성이 좋게 나타났 다. 치과용 골 이식재의 성능에 있어서 젖음성 평가는 직접적인 영향을 미치지는 않지 만 임상에서 이식재를 식립하였을 때 식립한 이식재가 환자의 혈액 등을 적정량 흡수 하여 골 결손부위에 유동적이지 않게 위치할 수 있는지를 일정 부분 확인해 볼 수 있 는 실험이 되었다.
Figure 11. The wettability of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of Hydroxyapatite (HA) and β-tricalcium phosphate (β-TCP). The wettability of bone grafting material was measured by the protocol provided by Ministry of Food and Drug Safety (MFDS), Republic of Korea. Briefly, 0.5 g of synthesized bone grafting material was immersed with 1 mL distilled water at room temperature for 30 min. After reaction, the remained volume of distilled water was measured by microbalance. A, the wettability of each bone grafting materials synthesized as the defined mixing ratio of HA and β-TCP. B, the histogram based on the result of wettability.
Ⅳ. 고 찰
Lu 등 [58]의 보고에 따르면 TCP의 생체분해성은 이식초기에 TCP의 용해 및 분해 에 의해 일어나며, 이후 후반기로 갈수록 파골세포 및 식세포 등에 의한 분해과정이 이루어진다고 보고 하였다. Wiltfang 등 [59]은 α-TCP와 β-TCP의 흡수양상을 비교한 연구에서 두 종류 모두 4 주까지 비슷한 양상을 보이다가 16 주차부터 70%, 40% 의 잔존량의 차이를 보였다. 이후 68∼86 주에서는 둘 다 10% 이하의 잔존량을 보였으며 이를 토대로 TCP 식립 후 최소 5∼6 개월 이후에 인공치아 및 임플란트 식립이 가능 할 것으로 보고, TCP의 완전한 흡수 및 골 대체 시기는 약 12∼18 개월 이후로 보고 되고 있다.
Nery, LeGeros, Schwartz 등 [60-62]의 보고에 따르면 HA와 β-TCP를 혼합한 BCP 는 혼합 비율을 조절하여 재료의 생체활성 및 흡수성을 조절할 수 있으며, 이러한 이 유로 현재 치과나 정형외과 영역에서 임상적으로 성공적으로 이용되고 있다. 그러나 생체 내에서 최적의 골 전도성을 나타내기 위한 혼합 비율에 대한 보고가 명확하지 않 으며, HA의 비율이 β-TCP보다 높은 때 신생골 형성이 증가한다는 보고가 있다. 그러 나 Merten 등 [60]의 보고에서는 HA와 TCP 혼합 비율이 25:75 일 때 pure한 TCP보 다 더 빠른 흡수를 나타내며, 단순한 화학적 분해 이외도 파골세포의 활성이 골개조시 기에 더욱더 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 이러한 이유로 본 연구에서는 대표 적인 인산칼슘계 생체재료인 HA와 β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 비율로 혼합한 합성골 이식 재를 제조하여 이들의 혼합비율에 따른 생물학적, 물리·화학적 특성을 비교 분석하였 다.
Kim 등 [57]의 보고에 따르면, in vivo 특성 평가는 동물에 대한 규제가 있으므로 in vitro 세포특성평가로 세포독성 및 부착실험 등을 언급하였으며, 더불어 뼈 형성에 관 여하는 세포로서 골모세포 (Osteoblast) 또는 유사골모세포(Osteoblast-like cell)를 사 용하는데 특히 골모세포는 인체 경조직에서 추출된 미분환단계의 골형성세포로 비교적 in vivo 상태의 세포 증식 및 분화과정과 유사하지만 정제가 필요하며, 추출부위나 세 포 상태에 따른 실험 오차가 심한 이유로 비교적 잘 알려진 상업적으로 시판되는 유사 골모세포를 사용한다고 보고 하였다. 따라서 이 연구에서는 골 이식재의 세포독성 및 부착실험에 있어서 MG-63 세포를 사용하여 HA/β-TCP 혼합 비율에 따른 합성골 이 식재의 생물학적 특성을 비교 분석하였다.
Ducheyne 등 [22]은 생체세라믹들이 용해, 침전, 이온변화, 침착, 화학주성, 세포 부착 및 증식, 세포 분화, 세포외기질 형성 등의 기전으로 골 조직의 주변 환경과 반응하여 뼈로 대체되어진다고 보고하고 있다. 특히 Famery 등과 TenHuisen 등 [34-35]의 보고 에 따르면 골 이식술에 사용되어지는 골 이식재의 입자크기 (Particle size), 결정화도 (Crystallinity), 미세공극 (Microporosity)과 거시공극 (Marcroporosity), 공극크기 (Pore size) 및 표면 거칠기 (Surface roughness)와 공극률 (Porosity) 등은 생체활성과 밀접한 관련이 있음을 보고하고 있다. 결정화도는 무정형의 상이 아닌 결정격자 내에 개재된 인산칼슘염의 비율로 정의되며 단백질 흡착 및 세포부착, 생체재료의 용해에 중요한 역할을 한다 [47]. 미세공극은 제조과정에서 소결 온도와 기간에 의해 형성되는 10 ㎛ 이하의 공극구조를 의미하며 세포와 체액간의 침투 및 부착에 중요한 역할을 한 다[48]. 거기공극은 100 ㎛ 이상의 공극구조를 의미하며 휘발성 물질의 개재에 의해 형 성된다. 신생혈관의 내부성장 및 지지체로서의 역할을 담당하여 골전도를 유도 한다 [49]. 이에 따라 본 연구에서는 다공성을 가진 구형의 이식재 구조를 형성하도록 제조 하였으며, SEM을 비롯한 XRD, FT-IR 등의 분석으로 합성골 이식재의 HA/β-TCP 혼합 비율에 따른 물리·화학적 특성 및 구조를 분석하였다.
Ca-P 생체물질의 분해는 입자크기, 기공크기, 표면적 및 결정 크기와 구조 등에 따라 물리적인 영향을 받으며, pH, Ca/P 비율과 소결시의 압력과 온도, 이온의 구조에 따라 화학적인 영향을 받는다[60]. 또한 용해도는 골 결정 크기와 관계가 있으며, 아주 작은 양의 크기 변화도 용해도에 민감한 영향을 주게 된다. Ca/P 비율 EH는 Carbonate와 PO₄의 성분비에 따라 생체재료의 반응성에 영향을 준다.
Lu 등 [61]의 동물실험에 의하면 24 주 후 55%의 용해가 일어나고, HA는 5%만 흡 수된다고 하였다. TCP는 HA보다 산성에서 12.3 배, 염기에서 22.3 배 빨리 흡수된다 고 보고되었다. 또한 이러한 흡수에 영향을 미치는 요소는 Ca/P 비율이며, HA의 Ca/P 비율은 1.7, TCP의 Ca/P 비율은 1.67이라고 하였다. 본 연구에서는 HA와 β -TCP의 혼합 비율에 따른 Ca/P 비율과 용해도 및 젖음성 평가를 시행하여 비교 분석 하였다.
1. HA와 β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 의 비율로 혼합하여 제조한 합성골 이식재는 이식재 로부터 용출된 고농도의 칼슘이 용출과정에 의해 희석되어짐에 따라 HNOK 정상세포 와 MG-63 조골세포 모두에서 높은 세포안정성 및 부착성을 나타내었다. 특히, HA/β -TCP 비율이 4:6인 합성골 이식재에서 가장 적합한 생물학적 조건을 제공하는 것으로
나타났다.
2. HA와 β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 의 비율로 혼합하여 제조한 합성골 이식재는 모두 0.5∼1.mm 의 동일한 입자크기의 다공성을 가진 구형의 이식재 구조를 형성하고 있으 며, 모두 균일한 거칠기 구조와 더불어 적합한 공극크기 및 구조를 형성하고 있었다.
특히, HA/β-TCP 비율이 4:6인 합성골 이식재에서 골 전도성과 관련된 약 130 ㎛의 거시공극을 확인하였다.
3. 이식재 흡수에 있어서 밀접한 관련이 있는 Ca/P 비율은 HA/β-TCP 혼합 비율이 4:6 인 합성골 이식재가 1.64 으로 인체의 뼈 및 치아와 가장 유사한 비율로 확인하였 다.
4. HA와 β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 의 비율로 혼합하여 제조한 합성골 이식재의 결정상 분석결과에서 전체적으로 유사한 XRD 패턴을 보였으며 미지상의 피크 또한 나타나지 않았다. 다만, β-TCP의 배합 비율에 따른 패턴 변화만을 보였다.
5. HA와 β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 의 비율로 혼합하여 제조한 합성골 이식재는 전체적 으로 유사한 스펙트럼으로 화학적 성분 구조의 유사성을 보였다. HA/β-TCP 혼합 비 율이 4:6 인 합성골 이식재에서 극히 작은 부분의 변화이지만 HPO4 흡수파장 (880 cm-1) 이 나타났으며, 이는 HA/β-TCP 혼합비율이 4:6일 때 합성골 이식재가 비화학 양론적 조성의 HA를 포함하고 있음을 의미하거나 결정화도가 낮은 β-TCP 비율에 의 한 결과라고 사료된다.
6. HA와 β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 의 비율로 혼합하여 제조한 합성골 이식재의 용출액 으로 확인한 pH 수치는 모두 인체에 적합한 pH 8.5 ∼ 9.0 인 것으로 확인하였다.
7. HA/β-TCP를 4:6, 5:5, 6:4 비율로 혼합한 합성골 이식재의 용해도 시험 결과에서 는 HA/β-TCP 혼합 비율이 6:4 인 합성골 이식재에서 가장 높은 용해도를 보였다. 이 와 더불어 젖음성 평가에서도 전체적으로 높은 젖음성을 가지고 있음을 확인하였다.
이상의 결과들을 고려했을 때 모든 실험군에서 골이식재로 사용하기 위한 적절한 물
리, 화학적 특성을 나타냄을 확인할 수 있었으며, 특히 HA/β-TCP가 4:6 비율로 혼합 한 합성골 이식재에서 보다 골 형성세포의 성장에 적합한 생물학적 환경을 제공함을 확인할 수 있었다. 본 연구에서의 시험관적 평가는 비교적 단기간의 제한적 평가로 좀 더 진전된 평가가 필요할 것으로 사료되며, 특정한 표면구조 및 연결성을 가진 macropore가 부여된 HA/β-TCP의 생체 내 골 재생 과정에서의 생물학적 효과를 확인 하기 위해서 향후 동물 실험 등을 통한 신생골 형성을 포함한 골재생양상의 평가가 요 구되어진다.
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감사의 글
감사해요. 깨닫지 못했었는데, 내가 얼마나 소중한 존재라는 걸.
태초부터 지금까지 하나님의 사랑은 항상 날 향하고 있었다는 걸.
고마워요. 그 사랑을 가르쳐 준 당신께, 주께서 허락하신 당신께 그리스도의 사랑으로 더욱 섬기며 이젠 나도 세상에 전하리라.
당신은 사랑 받기 위해 그리고 그 사랑 전하기 위해 주께서 택하시고 이 땅에 심으셨네. 또 하나의 열매를 바라시며..
지극히 작은 저를 섬겨주시고, 제자로 받아주신 김 수관 지도교수님.. 2년이 넘는 시간동안 믿어주셔서, 또 사랑으로 아껴주셔서 정말로 감사합니다. 그리고, 사랑하는 이 숙영 교수님 과 표현할 수 없을 정도로 감사한 김 재성 교수님, 日新又日新 하겠습니다. 세 분의 지도와 가르침이 있었기 때문에 모두 가능했습니다. 교수님들께 감사한 마음들.. 모두 오래오래 가 슴속 깊이 기억하며 살겠습니다. 그리고 받은 만큼 나누는 제자가 되겠습니다.
그리고 그 외에 제가 얼마나 소중한 존재 인지를 깨닫게 해주신 모든 분께 감사합니다.
많은 어려움 속에서도 민지, 민주! 두 딸 잘 키워주신 사랑하는 우리 아버지 임 종빈씨와 어머니 박 성애씨께 감사합니다. 아빠, 엄마의 선한 성품 덕분에 두 딸이 복을 많이 받고 있어요. 앞으로도 마음의 기쁨이 되는 딸이 되겠습니다.
임 석빈 큰아버지, 김 귀순 큰어머니, 민희, 선희, 진희 언니들, 형부들, 귀한 동역자 효희, 임 기빈 작은아버지, 감사한 정원숙 작은어머니, 다운이, 승혁, 승호, 임 현빈 작은아버지, 홍대옥 작은어머니, 아름, 신영이, 해자고모, 해심이 고모 식구들, 연자이모, 미정이 이모 모 두 감사합니다.
제 인생의 가장 좋은 목자가 되어주신 광산교회 윤홍성 목사님, 조점님 사모님, 이창우 목사님, 김태일 부목사님, 이재은 부목사님, 진민성 부목사님, 청년의 때를 헛되이 보내지 않도록 기도해 주신 류상원 집사님, 윤양숙 집사님, 그 사랑을 깨닫고.. 이제는 그 사랑을 함께 전할 수 있도록 눈물의 씨앗을 뿌려준 은지언니, 윤경언니, 영진이오빠, 이종관 전도사님, 안나언니, 선지언니, 송 이언니 그리고 광산교회 청년부 모든 지체들과 고마운 친구 승범이, 주님이 주신 귀한 나의 아 이들 (잔디, 민아, 지원, 수현, 은진, 은, 현승, 영민, 조근, 선미, 예은, 서상)에게도 사랑하고 감사 한 마음을 전합니다.
그리고 대학생활에서부터 대학원 진학까지 좋은 부모님으로, 스승으로 가르치고 돌봐주신 광주 여대 대체의학과 정철윤 교수님, 박정숙 교수님, 전지현 교수님, 강경수 교수님과 쥬리, 선애, 희 준, 지혜를 비롯한 08학번 동기들과 선후배님들, 지훈이언니, 승희언니, 알파.. 함께해주신 시간 들이 있었기 때문에 지금의 시간이 있음을 잘 알고 있습니다. 때문에 감사하다는 말씀을 꼭 전 해드리고 싶었습니다. 감사합니다.
그리고 지금의 시간을 함께해주고 계신! 매일 매일 크고 작은 일들로 저를 성장시켜주시는 사 랑하는 “조대 치대 김수관 교수님 실험실” 식구들 ! We are the future를 외쳐주신 왕선배 진승찬 선생님, 하나뿐인 맞선배 박정강 선생님과 사랑스러운 예쁜 맞후배 우리 오다혜, 실험실 의 든든한 막내 강경록 선생님, 2년동안 가장 큰 힘이 되어준 우리 박미라, 반오십년에 만난 단 짝 김복희, 앞으로 더 잘 해주고 싶은 우리 인아, 또 하나의 가족이 되어서 정말 기쁘고 앞으 로도 서로 애정을 쏟으며 하나가 되길 바랍니다. 실험 잘 가르쳐주시고 도와주셔서 감사합니다.
늘 따뜻하게 잘 해주신 김도경 교수님과 5층 실험실 선생님들, 머리에서 말끝까지 진심 멋지신 김춘성 교수님과 문성민 박사님, 무안 팸 박보람 선생님, 보고 싶은 박진주 선생님, 실험짝꿍 박 상연 선생님, 김경수 선생님, 이가영 선생님, 김은경 선생님, 황유희 선생님, 임형순 선생님, 그 동안 실험실을 통해 만났던 장은숙 선생님, 박상혁 선생님, 정이라, 홍정은, 김성희 선생님, 큰 현정 (장현정), 작은현정 (심현정), 유인정, 여전히 수고중인 이예찬.. 되돌아보니, 좋은 일이든 나 쁜 일이든 피가 되고 살이 되었습니다. 크고 작은 도움과 영향주셨고, 많이 배웠습니다. 감사합 니다.
사람의 계획보다 앞서 일하시고 역사하시는 주님, 모든 일을 합력하여 선을 이루시는 주님, 앞 으로도 날마다 결단하며 살겠습니다. 제 신을 벗고, 주님의 손과 발이 되어 작은 예수로 섬기는 자가 되겠습니다. 감사합니다.
