서론
인간을 비롯한 다양한 종에 대한 유전자 시퀀싱 프 로젝트의 진행과 함께 막대한 양의 신규 유전자 정보 가 빠른 속도로 축적되고 있으며 해독된 유전자서열 에 입력된 단백질들의 활성과 상호 작용에 대한 이해 는 향후 의약 및 바이오 산업의 발전의 핵심요소로 인 식되고 있다. 한편, 유전자로부터 해당 단백질을 발현 하기 위한 수단으로 현재까지 일반적으로 사용되어오 고 있는 미생물 및 세포배양공정은 유전자 클로닝, 세 포주의 확립, 배양 및 파쇄공정 등 많은 시간과 노동 력을 요구하므로 높은 쓰루풋의 단백질 생산에 있어 근원적인 한계를 지니고 있으며 그 결과 빠른 속도로 증가하고 있는 유전정보에 비하여 단백질 구조 및 기 능에 대한 정보의 축적은 상대적으로 매우 더디게 진 행되어가고 있는 실정이다. 유전정보와
단백질 정보간의 이러한 괴리는 GenBank에 등록되는 유전자 서열 정 보와 PDB 등에 입력되는 단백질 정보 의 증가속도 차이로부터 단적으로 파악 될 수 있다.
정제된 단백질의 획득 자체뿐만 아니 라, 기존의 세포 배양공정은 세포막이라 는 물리적인 공간이라는 닫힌 계에서의
생합성 반응을 이용한다는 측면에서 다양한 물리적, 생화학적 특성을 가진 각종 단백질들의 성질에 따른 합성조건을 제공하지 못한다는 한계를 가지고 있다.
예를 들어 소수성 아미노산의 존재 등으로 인해 내포 체를 생성하는 단백질들의 활성발현을 위해서는 낮은 배양온도의 적용, 배지조성의 변화 등과 같은 제한적 이고 간접적인 시도만이 가능하게 된다.
한편, 살아있는 세포를 이용하는 대신 세포로부터 분리된 단백질 합성 기구들과 단백질 합성기질의 생 화학적인 반응을 통하여 DNA 상의 단백질을 발현하 는 무세포 발현 기술은 배양을 통한 단백질 생산공정 에 요구되는 대부분의 단계를 생략하고 짧은 시간 내 에 유전자 상에 입력된 염기서열 정보를 단백질의 형 태로 번역할 수 있다는 장점을 가지고 있어 유전정보
김 동 명
충남대학교 정밀응용화학과 분자생물공학연구실, [email protected]
그림 1. 무세포 단백질 발현 시스템 개요도.
와 단백질정보량 간의 간극을 채울 유망한 기술로 주 목 받고 있다. 또한, 일반적인 생화학 반응과 동일하게 열린계에서 단백질 발현 반응을 수행하게 되므로 화 학적인 폴딩 보조인자의 첨가, 반응액의 산화환원전 위의 조절, 염농도의 조절 등 다양한 수단을 통하여 활성 단백질의 발현을 위한 최적 조건을 제공할 수 있 다는 장점을 가지고 있어 단백질 구조 결정, 활성 분 석, 단백질 상호 작용의 이해, 신규 단백질의 탐색 및 변형 등 프로테오믹스 제반 분야에 요구되는 단백질 분자의 수요를 충족시킬 수 있는 차세대 단백질 발현 기술로서 그 가능성을 평가받고 있다. 단백질 합성을 위해 요구되는 리보조옴, 번역인자 등의 단백질 생합 성 기구는 유전자 재조합 생산을 통해 각각 준비한 후 재구성 할 수도 있으나 준비과정의 복잡성과 비용 등 의 문제로 인해 현재는 세포파쇄 후 고속원심분리과 정을 통해 세포벽 성분 등의 불용성 성분을 제거한 세 포 파쇄액이 무세포 단백질 합성 반응을 위해 통상적 으로 사용되고 있다. 세포 파쇄액을 얻기 위한 세포로 서는 대장균, 밀배아, 토끼망상적혈구 등이 발현되는 단백질의 특성에 맞추어 사용되고 있으며 세포 확보 의 용이성과 세포 파쇄액 성능의 재현성 등의 이유로
인해 대장균 세포 유래의 파쇄액이 널리 이용되어지 고 있다.
무세포 단백질 합성 반응기의 종류
Nirenberg 등에 의해 제시된 최초의 무세포 단백질 발현 시스템은 모든 반응 기질들과 파쇄액을 동시에 반응기에 혼합하여 반응시키는 회분식 반응 시스템으 로, 짧은 반응지속 시간(수 십분 이내)에 기인한 낮은 생산성으로 인해 충분한 양의 단백질을 생산할 수 없 다는 문제점을 가지고 있었다. 그러나 Spirin 등은 한 외여과막으로 구성된 반응기(연속식 무세포 단백질 합성 시스템)로의 연속적인 반응물질의 공급을 통해 무세포 단백질 발현 시간을 수십 시간까지 연장할 수 있음을 입증하였고(Science, 1988, 242:1162), 이어 Kim과 Choi는 고압펌프를 사용한 피드용액의 이송대 신 투석막을 사용한 확산에 의해 반응기질 및 부산물 의 교환을 한 연속교환식 반응기를 고안하였다 (Biotechnol Prog, 1996, 12:645). 또한 Endo 등은 이 상(two-phase)반응 시스템을 고안하여 별도의 투과 막 없이 피드용액과 반응액간의 물질교환을 통해 연 속확산식 단백질 합성 반응을 진행시킬 수 있음을 보 고하기도 하였다(J. Biotechnol, 2008, 133:453). 이러한 시스템들은 모두 반응 물질의 연속적인 공급과 무기인산 등 단 백질 합성 저해물질들의 연속적인 제거를 통해 단백질 합성시간을 지속시키는 원리 에 바탕을 두고 있다. 이와 같은 연속식 혹은 연속확산식 반응장치의 운전을 통한 장시간 무세포 단백질 발현의 성공은 일 반적인 통념과 달리 세포로부터 분리된 리보조옴과 기타 번역인자들이 인위적인 환경하에서도 높은 안정성을 지니며 단백 질 합성을 위한 저분자 기질이 충분히 공 급되고, 합성과정에서 발생하는 저분자 부산물이 효과적으로 제거될 경우 세포 배양과 대등한 수준의 반응기간 동안 지
그림 2. 무세포 단백질 발현 반응기의 종류 ((A) 회분식 반응기, (B) 연속
식 반응기, (C) 연속확산식 반응기, (D) 2상 (two-phase) 반응기).
속적으로 전사 및 번역반응을 수행할 수 있음을 보여 준다.
특히, 투석막을 사용한 연속교환식 반응장치는 Roche사에 의해 상용화되어 RTS system이란 제품 명으로 공급된 바 있다. 이 시스템은 [그림 3]에서 보 이는 바와 같이 양면에 투석막이 수직으로 장착된 반 응기에서 단백질 발현 반응을 수행함으로써 합성반응 도중 반응액이 주변의 피딩용액으로부터 효율적으로 반응기질을 공급받고 저분자 반응 부산물은 피딩용액 으로 확산, 희석되게 함으로써 약 20시간에 이르는 장 시간 동안의 단백질 합성반응을 가능하게 하였다.
고효율 회분식 무세포 단백질 발현 시스템의 개발 연속식 혹은 연속교환식 반응기 등의 개발에 의한 생산성 향상에도 불구하고 이들은 단백질 발현을 위 한 별도의 장치를 요구되며
다량의 기질 용액이 사용된 다는 점에서 다종 단백질의 다중 발현 시스템으로 응용되 기에는 기술적, 경제적 한계 를 가지고 있으며 무세포 발 현을 통한 고속, 병렬의 단백 질 생산을 위해서는 이러한 연속식 혹은 연속확산식 반응 기에서의 반응과 대등한 단백 질 합성량을 구현할 수 있는 회분식 반응 기술의 개발이
요구되어진다. 한편, Kim과 Swartz는 기존의 회분식 무세포 단백질 합성 반 응에서의 짧은 반응시간은 고에너지 인 산결합을 가진 에너지원(phosphoenol pyruvate (PEP), creatine phosphate (CP) 등)이 세포 파쇄액 내에 존재하는 인산분해효소 활성에 의해 빠르게 분해 됨에 따라 반응액 내에서의 ATP의 고 갈을 유발하게 되고 또한, 에너지원이나 ATP로부터 유리된 마그네슘 이온이 단백질 합성 반 응과 무관하게 반응액내에 축적되어 단백질 합성의 각 단계에 필수 조효소로 작용하는 마그네슘 이온을 침전시키기 때문임을 보였다(Biotechnol Bioeng, 1999, 66:180). 이러한 문제점은 기존의 에너지원 대 신 포도당 및 여타 해당과정의 중간물질들을 ATP 재 생을 위한 대체 에너지원으로 사용함으로써 크게 개 선될 수 있음이 여러 연구결과에 의해 입증되어 왔다.
예를 들어, 해당과정의 첫번째 중간체인 glucose-6- phosphate(G-6-P)를 에너지원으로 사용함으로써 기 존의 무세포 발현 시스템에 일반적인 에너지원으로 사용되고 있는 phosphenolpyruvate에 비하여 현저히 향상된 ATP 공급을 유도할 수 있었고 이를 통한 단 백질의 생산수율 역시 향상되었음이 보고되었다 (Kim and Swartz, 2001, 74:309). 기존 대부분의 무
그림 4. 무세포 단백질 합성에 요구되는 ATP의 연속적 재생방법.
그림 3. Roche RTS system의 작동원리 및 반응장치.
세포 발현 시스템의 경우, ATP 재생을 위한 에너지 원으로서 일반적으로 PEP를 사용하며 이 경우, pyruvate kinase에 의해 매개되는 substrate-level phosphorylation 반응에 의해 한 분자의 PEP는 한 분자의 ATP를 재생하며 pyruvate로 전환되게 된다.
반면 G-6-P는 해당과정을 통해 피루브산으로 전환 되는 동안 한 분자의 ATP를 소모하고 네 분자를 생 성하게 되므로 이론적으로 총 3 분자의 ATP를 재생 함으로써 기존 시스템에 비하여 훨씬 효율적으로 무 세포 단백질 합성을 위한 ATP를 공급할 수 있게 된 다. 나아가 Calhoun과 Swartz는 도당을 무세포 단백 질 발현을 위한 에너지원으로 직접 사용할 수 있는 방법을 보고하기도 하였다(Biotechnol Bioeng, 2005, 90:606). 더욱이 최근의 연구결과에 따르면 대장균 세포질로부터 제조된 세포 파쇄액은 산소의 존재시 산화적 인산화반응(oxidative phosphorylation)을 수행 하는 것으로 여겨지며 포도당 및 해당중간물질의 사용 을 통해 더 이상 ATP의 공급이 무세포 단백질 합성의 주요 제약요소로 작용하지 않게 되었다. 이와 같이 단 백질 합성에 요구되는 ATP의 효율적인 재생방법의 개 발을 통해 단백질 생산성은 현저히 증가되어 왔고, 추 가적인 반응조건의 최적화를 통해 현재 회분식의 무세 포 단백질 발현 반응에서도 반응액 1mL 당 수 mg에 달하는 높은 수준의 단백질 합성이 가능한 방법들이 소 개되고 있다.
무세포 단백질 합성의 경제성
무세포 단백질 발현 기술은 세포막 등의 물리적 장 벽이 존재하지 않는 상태에서의 단백질 발현을 통해 기존 세포배양 공정의 한계를 극복할 수 있다는 매력 적인 장점에도 불구하고, 낮은 생산성과 높은 비용이 라는 문제점으로 인하여 오랫동안 현실적인 단백질 생산 수단으로 받아들여지지 못하여 왔다. 그러나, 위 에 언급된 바와 같은 새로운 형태의 에너지 재생 기술 의 도입을 통해 그 생산성이 획기적으로 개선됨으로 써 본격적인 단백질 고속 합성 수단으로 재고되어 지
고 있다. 또한, 기존의 무세포 단백질 생산 시스템에 요구되는 반응물질의 총 비용 중 약 80%가량이 PEP, CP 등과 같은 에너지 원이 차지하고 있었다는 점에서, 이들에 비해 크게 낮은 가격으로 이용될 수 있는 포도 당 및 그 유사체를 이용하는 ATP 재생 방법은 단백 질 생산성의 향상과 함께 무세포 단백질 발현의 경제 성도 크게 개선하는 효과를 가져오게 되었다. 예를 들 어, CP를 에너지원으로 사용하는 경우에 비해 포도당 을 사용함으로써 약 70% 가량의 비용을 절감할 수 있 다. 여기에 더하여 최근에는 기존의 방법에서 에너지 원 다음으로 많은 비용이 요구되었던 세포 파쇄액의 제조공정을 단순화함으로써 추가적으로 단백질 합성 비용을 낮출 수 있고, mRNA합성에 요구되는 NTP 를 NMP로 대체함으로써 단백질 1mg합성에 요구되 는 시약비용을 약 $0.4 수준까지 낮출 수 있음이 보 고되었다[그림 5].
무세포 단백질 발현 시스템의 응용 구조 및 기능단백질체학
최근까지도 무세포 단백질 발현 기술은 소수 단백질 의 소량 생산을 위한 도구로써 그 사용이 제한되어 왔 으나, 앞서 언급된 바와 같이 ATP재생방법의 개선 및 반응조건의 최적화를 통한 생산성 향상과 반응공정의 자동화를 통해 구조 단백질체학 또는 기능 단백질체학 을 위해 요구되는 다종 단백질의 공급수단으로 그 응 용범위가 확장되어 가고 있다. 특히, 세포의 생존과 무 관하게 단백질을 생산할 수 있고 그 반응조건을 자유 롭게 조작할 수 있는 무세포 단백질 합성 시스템의 장 점으로 인해 독성 단백질, 막 단백질, 단백질 복합체 등과 같이 기존 세포배양공정을 통해 발현 및 분석이 어려웠던 단백질 분자들을 손쉽게 확보할 수 있게 됨 으로써 의학적, 산업적 가치가 큰 이들 단백질들의 구 조 및 기능에 대한 이해를 가속화할 수 있게 되었다.
또한 열린 시스템이라는 무세포 단백질의 특성은 세포 내에서의 단백질 합성과 달리, 발현되는 단백질 의 특성에 따라 적절한 구조와 활성을 갖출 수 있도록
하는 최적조건의 제공을 가능하게 하여 준다. 일례로 최근 동경대학의 Yokoyama 교수 연구팀에서는 무세 포 단백질 합성 시스템에 다양한 종류의 계면활성제
혼합 용액을 첨가함으로써 단백질의 합성과 지질 이 중막의 형성을 동시에 수행할 수 있도록 시도하여 스 테로이드계 계면활성제(cholic acid, digitonin)와 지 질 혼합액(york lecithin)을 첨가하였을 때 지질 이중 막 상에 다수 막 관통형 막 단백질을 활성형 상태로 대량 합성할 수 있는 방법을 개발하였다(Shimono et al, Protein Sci, 2009, 18:2160). 이러한 기술은 다수 의 막 단백질에 적용이 가능하며, 간편하게 고순도의 막 단백질 시료를 얻을 수 있는 것은 물론 세포막 환경 하 의 정확한 구조와 기능을 가지고 있는 활성형 시료를 얻 을 수 있다는 등의 이점을 가지고 있다. 또한, selenomethionine이나 동위원소 표지된 아미노산을 단백질 구조 내로 손쉽게 도입되게 함으로써 X선 회 절이나 NMR을 이용한 단백질 구조분석 과정에서 가 장 많은 시간이 요구되는 단백질 시료의 준비 단계를 획기적으로 단순화시킬 수 있다.
초고속 단백질 발현 및 분석
무세포 단백질 발현 시스템이 가지고 있는 가장 큰 장점 중의 하나는 유전자의 클로닝 과정 및 세포배양 공정을 생략하고 유전정보를 직접 단백질로 번역할 수 있다는 것이다. 그러나, 기존의 통상적인 무세포 단백질 발현 시스템에서는 단백질 발현을 위한 주형 으로 플라스미에 클로닝된 유전자들이 주로 사용되어 왔기 때문에 주형 유전자의 확보를 위한 세포배양이 필요하게 되어 무세포 발현 기술을 다종 단백질의 병 렬생산에 적용하기가 어려웠다. 주형 유전자의 확보 는 PCR기술을 이용하여 빠르게 이루어질 수 있으나 현재의 무세포 단백질 발현 시스템은 별도로 정제된 단백질 발현 인자 대신 세포 파쇄액을 사용하므로 파 쇄액 내에 존재하는 DNA 분해효소에 의해 PCR 산 물과 같은 선형 유전자가 빠르게 분해되고 결과적으 로 플라스미드에 입력된 유전자에 비해 그 발현량이 현저히 감소하는 문제를 가지고 있다. 그러나, Ahn 등은 최근 선형 DNA의 3’-말단에 T7 terminator 서 열을 도입시켜서 exonuclease에 대한 mRNA의 안정
그림 5. 1mg 단백질(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)
생산을 위해 요구되는 기질 비용의 비교. 세포 파 쇄액의 제조 공정 (S30 vs S12)과 NTP 및 tRNA사 용 여부에 따른 시약급 (Sigma-Aldrich 및 Roche Applied Science 가격 기준)의 기질 비용을 비교하 였음. System 1 [240mM HEPES, 60mM glucose, 1.2mM ATP, 0.85mM each of GTP, CTP and UTP, and 0.17mg/mL of E.coli total tRNA mixture];
System 2 [240mM HEPES, 60mM glucose, 1.2mM
AMP, 0.85mM each of GMP, CTP and UMP, and
0.17mg/mL of E.coli total tRNA mixture]; System 3
[240mM HEPES, 60mM glucose, 1.2mM AMP and
0.85mM each of GMP, CMP and UMP, and no
additional tRNA].
성을 향상시키고 또한 endonuclease인 RNase E의 활성을 제거한 세포 파쇄액을 이용함으로써 선형 유 전자로부터 전사된 mRNA의 안정성을 크게 증가시 킬 수 있고, 이를 통해서 플라스미드를 사용한 경우와 대등한 수준까지 단백질의 생산성을 높일 수 있음을 보고함으로써 PCR기법을 통한 유전자의 고속 변형/
증폭과 무세포 단백질 발현시스템을 통한 유전자 고 속/병렬 반응의 특성이 성공적으로 결합될 수 있음을 입증하였다(Ahn et al, Biochem Biophy Res Commun, 2005, 338:1346). PCR반응 및 무세포 단 백질 발현 반응은 일반적인 액체이송장치 등에 의해 자동화되어 주어진 유전자 서열들로부터 해당 단백질 들을 빠르게 생산할 수 있는 시스템이 구축될 수 있 다. Yokoyama 교수 연구팀은 최근 [그림 6]에 보이 는 바와 같은 연속확산식 무세포 발현 및 정제과정을 자동화한 시스템을 개발하였고 이를 통해 14시간 이 내에 96종의 정제된 단백질을 수 mg 단위로 생산할 수 있었다고 보고한 바 있다(Aoki et al, Protein Exp Purif, 2009, 68:128).
한편, 무세포 단백질 발현 반응을 SPR chip과 같이 단백질 분석이 가능한 표면 위에서 행함으로써 발현 되는 단백질을 실시간으로 모니터링 할 수 있는 기술 이 보고되기도 하였으며(Lee et al, Anal Biochem, 2007, 366:270) 이 같은 기술의 응용을 통하여, 발현
되는 단백질의 별도 정제 및 분석과정 없이 단백질의 발현과 분석을 동시에 행할 수 있는 플랫폼을 구축할 수 있을 것으로 기대되어 진다.
단백질공학
방향적 진화(directed evolution)기술은 효소 및 여 타 단백질 분자의 기능 향상을 위한 매우 강력한 도구 로서 이용되어 왔다. 방향적 진화기술의 핵심은 유전 자와 단백질 간의 물리적인 결합을 통해 반복되는 증
그림 6. 자동화된 연속확산식 무세포 단백질 발현 시스템 (사진출처: Prot Exp Purif, 68:128).
그림 7. 리보조옴 디스플레이기술을 이용한 단백질 분자의 방향적 진화.
그림 8. water-in-oil emulsion 내에서의 무세포 단백질 발현
및 스크리닝.
폭 및 선별과정을 가능하게 함으로써 목적하는 조건 에 최적화된 단백질과 그 유전자를 선발하는 것이 라고 할 수 있다. 이러한 측면에서 무세포 단백질 발현 시스템을 적용한 방향적 진화기술은 낮은 비 용과 시간 내에서 보다 넓은 활성 범위의 최적 단백 질을 고속으로 선발할 수 있는 중요한 기반을 제공 한다. 이 중 가장 잘 확립되어 널리 사용되고 있는 기술이 리보조옴 디스플레이 기술로서 이는 [그림 7]에 나타낸 바와 같이 종결 코돈이 삭제된 mRNA 를 단백빌 합성의 주형으로 사용함으로써 mRNA- 리보조옴-단백질이 복합체를 형성하게 함으로써 요 구되는 조건에 따른 단백질의 회수를 통해 해당 단 백질을 입력하는 유전자 서열을 파악할 수 있게 하 여 준다. 이 같은 과정의 반복을 통하여 기존의 세 포기반 방향적 진화기술이 가지고 있는 단점인 형 질변환 과정에서의 유전적 다양성의 손실을 최소화 할 수 있게 된다.
또한 유전자형과 발현형의 결합은 [그림 8]에 나타 낸 바와 같이 water-in-oil 형태의 물리적 공간 내에 서 무세포 단백질 발현 반응을 수행함으로써 이루어 질 수도 있다. 즉, 각 emulsion에 한 분자의 DNA분자 가 포함되도록 유전자 라이브러리를 희석한 후 이들 로부터 단백질을 발현하고 발현된 단백질들을 FACS 를 이용하여 고속 선별함으로써 특정 리간드에 결합 성질이 아닌 효소 활성 등의 단백질 특성에 따른 방향 적 진화를 가능하게 할 수 있다.
맺음말
무세포 단백질 발현 기술은 세포가 가지고 있는 복 잡한 대사과정으로부터 단백질 합성 반응 만을 분리 하여 여타의 세포 활성과 독립적으로 단백질을 생합 성 할 수 있다는 측면에서 기존의 세포 기반 단백질 발현 공정으로는 어려운 수준의 합성 속도 및 확장성 을 제공한다. 열린 계에서의 단백질 합성이라는 특성 으로 인해 무세포 단백질 발현 시스템은 포스트게놈 연구에 요구되는 다양한 단백질들의 확보 수단으로서 뿐만 아니라 단백질 합성이라는 생물학적 반응을 여 타의 생물학적, 화학적 반응과 연계함으로써 비천연 단백질의 합성 및 스크리닝, 센서소재의 개발, 신규 의 약 활성 물질의 탐색 등과 같은 다양한 분야의 기반 기술로 활용될 것으로 기대된다. 그러나, 현재의 무세 포 단백질 합성 기술은 세포 내에서 진행되는 단백질 합성 과정 중 아미노산의 중합이라는 일차적인 부분 만을 재현할 수 있다는 단점을 가지고 있다. 예를 들 어, 발현된 단백질의 glycosylation등과 같은 번역 후 수식 과정을 효율적으로 수행할 수 있는 무세포 발현 시스템은 아직 개발되어 있지 않으며 막 단백질의 생 산 역시 그 효율성과 경제성 부분에서 개선의 여지가 많이 남아있는 상태라고 할 수 있다. 향후의 무세포 단백질 발현 시스템에 대한 연구는 생산성의 향상, 반 응장치의 소형화, 병렬화 및 자동화와 함께 이차적인 단백질 수식 기능이 추가된 시스템의 개발 등에 초점 이 맞추어져야 할 것으로 보인다.
