참죽나무 열매의 항산화 및 Elastase, Collagenase, Hyaluronidase, α-Glucosidase 저해 효과
임수빈1․김명욱2․이은호1․김예진1․조은비1․박경일3․강인규4․조영제1
1경북대학교 식품공학부, 2경북해양바이오산업연구원
3영남대학교 원예학과, 4경북대학교 원예과학과
Anti-Oxidant and Inhibitory Activities on Elastase, Collagenase, Hyaluronidase, and α-Glucosidase of Cedrela sinensis Fruits
Su-Bin Lim1, Myung-Uk Kim2, Eun-Ho Lee1, Ye-Jin Kim1, Eun-Bi Cho1, Kyeung-Il Park3, In-Kyu Kang4, and Young-Je Cho1
1School of Food Science & Biotechnology and
4Department of Horticultural Science, Kyungpook National University
2Gyeongbuk Institute for Marine Bio-Industry
3Department of Horticulture and Life Science, Yeungnam University
ABSTRACT This study examined the anti-oxidation and inhibitory activities of extracts from Cedrela sinensis fruits on elastase, collagenase, hyaluronidase, and α-glucosidase. The total phenolics content (TPC) of C. sinensis fruits was 56.54 mg/g in the hot water extracts and 104.94 mg/g in the 50% ethanol extracts, which was the highest. The TPC in the freeze-dried powder of the hot water extracts and the 50% ethanol extracts were 390.73 and 491.47 mg/g, respectively. The 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activities of the C. sinensis fruits water extract powder (CSWP) and C. sinensis fruits ethanol extract powder (CSEP) were 72.17 and 71.38% at a 200 µg/mL concentration, respectively. The 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical cation decoloriza- tion of CSWP and CSEP were 99.11 and 99.16%, respectively, at 200 µg/mL. The anti-oxidant protection factors (PF) of CSWP and CSEP were 1.75 and 1.91 PF, respectively, at 200 µg/mL. The thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) of CSWP and CSEP were 38.72% and 56.95%, respectively, at 200 µg/mL. The DPPH and ABTS of CSWP and CSEP were higher than those of butylated hydroxytoluene (BHT), but PF and TBARS were lower than those of BHT. The elastase inhibitory activity of CSWP was not observed but the inhibitory activity of CSEP was 85.28%
at 200 µg/mL. The collagenase inhibitory activity of CSWP and CSEP were 29.38% and 56.66%, respectively, at 200 µg/mL. Therefore, CSP was considered to be a potential source of cosmetic products for the wrinkle-improving function. The hyaluronidase (HAase) inhibitory activity of CSWP and CSEP as the biological activity for functional food were 87.80% and 88.51%, respectively, at 200 µg/mL. The α-glucosidase inhibitory activity of CSWP and CSEP were 92.17% and 99.06%, respectively, at 200 µg/mL. CSWP and CSEP were similar or more effective than EGCG as a positive control. The CSP showed excellent of anti-oxidant, anti-wrinkle, and anti-inflammation activities and helped decrease the blood sugar content through the glucosidase inhibition activity. These results show that extracts from C. sinensis can be used as a functional resource with anti-oxidant, anti-wrinkle, anti-inflammation, and anti-diabetes activities.
Key words: anti-oxidant, Cedrela sinensis fruits, enzyme inhibition, freeze-dried powder
Received 18 July 2018; Accepted 8 October 2018
Corresponding author: Young-Je Cho, School of Food Science &
Biotechnology/Food & Bio-Industry Research Institute, Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-53-950-7755
서 론
인간의 생체는 자외선, 화학물질, 미생물 침입 등의 외부 요인뿐만 아니라 세포의 호흡, 면역반응, 스트레스 등의 내
부적 요인에 의하여 reactive oxygen species(ROS)와 re- active nitrogen species(RNS)가 생성되어 산화적 스트레 스를 받게 된다. 여기서 생성된 ROS와 RNS는 대표적으로 superoxide(O2-), nitric oxide(NO･), nitrogen dioxide (NO2･), hydroxyl(HO･), peroxyl(ROO･), hydroperoxyl (ROOH) 라디칼 등이 존재하며, 이들은 강한 반응성을 통하 여 세포막의 인지질, 단백질 등과 같은 거대분자를 공격한다 (1). 체내에는 이러한 산화적 스트레스로부터 신체를 보호하 고 항상성을 유지하기 위한 방어기작이 발생되지만, 과잉
생산된 ROS와 RNS 등의 산화반응으로 인해 항산화제를 만 들기 위한 전구물질이 결핍 또는 노화되어 이들의 항상성이 깨지게 되면 성인병과 피부질환 등의 다양한 질병에 노출될 위험성이 증가한다(2). 인간은 항상성을 맞추기 위하여 항산 화제를 추가로 섭취하고 있는데, 합성 항산화제의 안전성에 대한 논란이 지속해서 제기되고 있어 안전한 천연 항산화제 의 개발을 위한 연구가 지속해서 요구되고 있다(3).
피부의 진피층을 포함한 일부 조직, 장기, 동맥 등은 elas- tin, collagen, hyaluronic acid 등의 extracellular matrix (ECM) 단백질로 채워져 있으며, ECM 단백질들 간의 가교 결합에 의하여 신축성과 내･외부의 압력에 대한 내구력을 가진다. 특히 피부의 진피층은 elastin과 collagen의 가교결 합을 통하여 피부의 탄력을 유지하고 주름을 예방하는 역할 을 한다. 하지만 산화적 스트레스, UV-B와 같은 강한 자외 선에 노출되어 ROS가 과잉 생성되거나 화학물질 및 미생물 에 노출될 경우 섬유아세포가 노화되고 제 기능을 하지 못하 게 된다. 이로 인해 ECM 단백질의 합성이 저하되고 이를 분 해하기 위한 신호전달 물질과 elastase 및 collagenase 등의 효소분비가 촉진되어 주름이 생성된다(4). 또한 피부 mela- nocyte는 UV의 자극에 의해 melanin을 생성하여 각질 형 성 세포인 keratinocyte로 전달하는데, 이는 근본적으로는 피부를 보호하기 위한 메커니즘이지만, 노화로 인하여 피부 의 재생 기간인 turn over의 주기가 늦어지고 melanin의 축적량이 증가하면 색소 침착, 기미 등의 현상이 나타난다 (5). 이러한 피부색소 침착의 원인물질인 melanin 생성에 관여하는 효소들은 tyrosinase, tyrosinase-related pro- tein 1(TRP-1)과 TRP-2 등이 있다. 따라서 melanin 생성 의 초기 속도를 조절하는 tyrosinase 활성을 억제할 수 있는 천연물 소재의 미백물질에 대한 연구가 지속되고 있다(6).
과거에는 존재하지 않았던 화학물질과 변이된 미생물의 침 입 등 과도한 산화적 스트레스로 인한 만성 염증, 식습관의 변화로 인한 통풍, 비만, 당뇨 등의 성인병이 가장 많이 발견 되며, 각종 암으로 이어질 수 있는 만성 질환도 존재한다.
이러한 만성 질환은 약물을 이용하여 치료할 수 있으나, 최 근에는 medicine food homology(MFH)에 대한 연구보고 (7)가 많이 이루어지고 있다. MFH란 약물과 식품의 근원이 같다고 말하는 동양의 약식동원과 같은 의미를 지니고 있으 며, 식품을 통하여 질병을 예방하고 약물의 효과를 높이며 부작용을 줄이는 것이 주목적이다.
참죽나무(Cedrela sinensis)는 멀구슬나무과의 낙엽활 엽교목으로 중국이 원산지이며, 국내에서는 중부이남 해발 500 m 이하의 마을과 산책로 등에 주로 생육하는 나무이다.
예로부터 민간에서는 참죽나무에 독성이 없고 종기와 위장 질환을 억제해주는 효과가 있다고 알려져 약용식물로 많이 사용해왔으며, 새순과 작은 잎은 사찰에서 주로 소비되던 식재료이다. 줄기와 뿌리는 수렴제로 사용하며 열매는 차로 복용한다고 알려져 있다. 또한 열매인 과실은 삭과로 9월에 성숙하며 도란상 원형을 띤다고 알려져 있다(8). 참죽나무에
는 칼슘과 인, 철과 같은 무기질이 다량 함유되어 있으며 비 타민 A, C 그리고 나이아신이 포함되어 있다. 특히 참죽나무 새순 100 g에는 칼슘 946 mg이 함유되어 있어 고칼슘 식품 으로서의 연구보고가 있다(9). 참죽나무의 부위별 연구에서 는 참죽나무잎의 항염증 및 진통 효과(10), 참죽나무잎 추출 물의 flavonoids 성분 분석 및 생리활성 효과(11), 참죽나무 새순의 항산화 효과(12) 등 새순과 잎 그리고 줄기에 대한 다양한 연구보고가 되어있으나, 참죽나무 열매에 대한 연구 보고는 전무한 실정이다.
따라서 본 연구에서는 국내에 자생하는 참죽나무 열매 추 출물을 이용하여 항산화 효과 및 elastase, collagenase, hyaluronidase, α-glucosidase 저해 효과를 측정하여 이를 고부가가치 기능성 소재로서 활용하기 위한 기초자료로 제 시하고자 하였다.
재료 및 방법
실험 재료
본 실험에 사용한 참죽나무 열매는 충청북도 옥천군 S농 원에서 재배되어 건조 후 포장된 것을 구매하여 사용하였다.
시료는 RT-08 고속분쇄(Rong Tsong Precision Tech- nology, Taichung, Taiwan)를 이용하여 25,000 rpm으로 60초간 분쇄한 후 40 mesh의 분말로 제조한 다음 4°C에서 저온저장하며 사용하였다.
참죽나무 열매 추출물 제조
시료 추출은 식품으로 활용이 가능한 열수와 에탄올을 추 출 용매로 사용하여 추출하였다. 열수 추출의 경우 분말 시료 1 g을 증류수 200 mL에 침지시켜 증류수가 100 mL가 될 때까지 가열한 후 냉각하고 24시간 동안 상온교반 추출하였 다. 에탄올 추출은 에탄올을 0~100% 농도별로 제조해 분말 시료 1 g에 에탄올 용액 100 mL를 추출용매로 가하여 24시 간 동안 상온에서 교반 추출하였다. 추출액은 Whatman No.
1 filter paper(Whatman, Maidstone, UK)로 여과한 후 rotary vacuum evaporator(Eyela NE, Tokyo, Japan)를 이용하여 45°C에서 감압 농축하였다. 농축한 추출물은 동결 건조기(FD8518, Ilshin Biobase, Dongducheon, Korea)를 이용하여 분말화하였으며 -18°C 냉동고에서 보관하며 시 료로 사용하였다.
총 페놀 함량 측정
총 페놀 함량의 정량은 Folin-Denis 방법(13)에 준하여 측정하였으며, 시료 동결건조물 1 g에 증류수 100 mL를 첨 가해 시료액을 제조하여 사용하였다. 시료액 1 mL에 에탄올 1 mL와 증류수 5 mL, 1 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고 Na2CO3 1 mL를 가한 후 암실에서 1시간 반응시켰다. 반응시간 종료 후 잘 섞어준 다음 UV- visible spectrophotometer Optizen 2120 UV(Mecasys,
Daejeon, Korea)를 이용하여 725 nm에서 1시간 이내에 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 이용하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 TPC의 양을 mg GAE/g으 로 환산하였다.
항산화 효과 측정
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼에 대한 소거 활성은 Blois(14)의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구 는 시료의 동결건조 분말을 50, 100, 150, 200 µg/mL의 농도로 조절하여 각 시료 1 mL에 60 μM DPPH 3 mL를 넣고 vortex 한 후 실온에서 15분 동안 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 시료 용액의 반응구와 대조구의 흡광도 차이로 계산하여 나 타내었다. 2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sul- fonic acid)(ABTS) radical cation decolorization의 측정 은 Pellegrini 등(15)의 방법에 준하여 측정하였다. 7 mM ABTS 5 mL와 140 mM K2S2O8 88 µL를 섞어 암실에서 14~16시간 반응시켜 라디칼을 형성시킨 후 이 용액 1 mL 와 에탄올 88 mL를 혼합한 것을 ABTS solution으로 사용 하였다. 반응구는 ABTS solution 4 mL를 50, 100, 150, 200 µg/mL 농도의 시료 용액 200 µL와 혼합하여 30초간 진탕한 후 1분 30초간 실온에서 방치한 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 시료 용액 의 반응구와 대조구의 흡광도 차이로 계산하여 나타내었다.
Anti-oxidant protection factor(PF)는 Andarwulan과 Shetty(16)의 방법에 준하여 측정하였다. 즉 30 mg의 β- carotene을 50 mL의 chloroform에 녹인 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣고 40°C water bath에서 chloro- form을 완전히 증류시킨 후, 20 µL linoleic acid, 184 µL Tween 40과 50 mL의 0.1% H2O2를 가하여 emulsion을 만들었다. 반응구는 5 mL의 emulsion을 50, 100, 150, 200 µg/mL 농도의 시료 용액 100 µL에 혼합하여 잘 섞어준 후 암실에서 50°C로 30분간 반응시켜 냉각시킨 다음, 470 nm 에서 흡광도를 측정하였다. PF값은 반응구의 흡광도 대비 대조구의 흡광도 값으로 계산하였다. Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)는 Buege와 Aust(17)의 방 법에 준하여 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을 만들어 사용하였으며, 반응구는 emul- sion 0.8 mL와 50, 100, 150, 200 µg/mL 농도의 시료 0.2 mL를 섞은 후 50°C water bath에서 12시간 반응시켰다.
반응 후 반응액에 TBA reagent 시약 4 mL를 넣고 15분간 중탕한 다음 10분간 냉각시킨 후 2,000 rpm으로 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 10분간 방치한 다음 상등액 을 취하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. TBARS 값은 시료 용액의 반응구와 대조구의 흡광도 차이로 계산하여 나 타내었다.
Elastase 저해 효과 측정
Elastase 저해 효과 측정은 Lee 등(18)의 방법에 준하여 측정하였다. 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide 를 사용하여 37°C에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-ni- troanilide의 생성량을 445 nm에서 측정하였다. 즉 반응구 는 50, 100, 150, 200 µg/mL 농도의 시료를 0.1 mL씩 시험 관에 취하고, 50 mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 por- cine pancreas elastase(2.5 U/mL) 용액 0.1 mL를 가한 후 50 mM의 기질 0.5 mL를 첨가하여 20분간 반응시켜 측 정하였다. Elastase 저해 효과는 시료 용액의 첨가 반응구와 무첨가 대조구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
Collagenase 저해 효과 측정
Collagenase 저해 효과 측정은 Wünsch와 Heidrich(19) 의 방법에 준하여 측정하였다. 즉 반응구는 0.1 M tris-HCl buffer(pH 7.5)에 4 mM CaCl2를 첨가하여 4-phenylazo- benzyloxy carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(0.3 mg/
mL)를 녹인 기질액 0.25 mL 및 시료 0.1 mL를 넣고 대조구 에는 시료 대신 증류수 0.1 mL를 첨가하고 collagenase (0.2 mg/mL) 0.15 mL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 0.5 mL를 넣어 반응을 정지시킨 다음 ethyl acetate 2 mL를 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측 정하였다. Collagenase 저해 효과는 시료 용액의 반응구와 대조구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
Hyaluronidase(HAase) 저해 효과 측정
HAase 저해 효과는 Dorfman과 Ott(20)의 방법에 준하여 측정하였다. 즉 반응구는 50, 100, 150, 200 µg/mL 농도의 시료 0.5 mL에 2 mM sodium phosphate buffer(pH 6.9)에 녹인 HAase(100 U/mL) 0.5 mL를 혼합하여 38°C에서 5분 간 반응시키고 0.3 M phosphate buffer(pH 5.3)에 녹인 기질(4 mg/mL) 0.5 mL를 넣어 다시 38°C에서 45분간 반응 시킨 후, 0.24 M acetate buffer(pH 3.75)에 녹인 알부민 용액 5 mL를 첨가한 다음 5분간 방치하고 600 nm에서 투과 도를 측정하였다. HAase 저해 효과는 시료 용액의 반응구 와 대조구의 투과도 차이로 계산하여 나타내었다.
α-Glucosidase 저해 효과 측정
α-Glucosidase 저해 효과 측정은 Tibbot과 Skadsen(21) 의 방법에 준하여 측정하였다. 50 mM sodium succinate buffer(pH 6.8)에 p-nitrophenol-α-D-glucopyranoside (PNPG)를 용해시켜 1 mg/mL 농도로 기질을 만들고, 기질 2 mL와 효소액 0.1 mL를 혼합하여 반응구에는 시료 0.1 mL, 대조구에는 증류수 0.1 mL를 넣어 37°C에서 30분간 반응시킨 후 반응종료시약 5% Na2CO3를 첨가하였다. 이때 생성된 p-nitrophenol을 흡광도 470 nm에서 측정한 후 표 준곡선에 대입하여 양을 환산하였다. 저해율(%)은 대조구 의 p-nitrophenol 생성량 대비 반응구의 p-nitrophenol 생
0 20 40 60 80 100 120
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Concentration of ethanol (%)
Contents of phenolics (mg/g) .
b
a c d ef e g e f
d b
A
0 100 200 300 400 500
CSWP CSEP
Contents of phenolics (mg/g) .
a
b
B
Fig. 1. The optimal extraction condition (A) and contents of phenolics (B) in extracts and CSWP, CSEP from Cedrela sinensis fruits. CSWP, freeze-dried powder of water extract from C. sinensis fruits; CSEP, freeze-dried powder of ethanol extract from C. sinensis fruits. Mean±standard deviation (n=3). Means with different letters (a-g) are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
성량으로 계산하였다.
통계처리
모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였고 자료의 통계처리 는 IBM SPSS statistics ver. 22 for windows(IBM Corp., Armonk, New York, NY, USA)를 이용하여 평균±표준편 차로 표시하였고, 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 실시하여 시료 간의 유의차를 P<0.05 수준으 로 비교 분석하였다.
결과 및 고찰
참죽나무 열매 추출물의 최적 추출 조건과 동결건조 수율 식물체 내에는 수많은 phytochemical이 존재한다. 약간 의 1차 대사산물을 제외하면 대다수의 phytochemical은 2 차 대사산물로 이루어져 있다. Phytochemical 중에서도 특 히 phenolic compounds와 flavonoids류의 연구가 가장 많 이 진행되어 왔으며, 이는 phenolic compounds와 flavo- noids류가 대부분의 식물체에 존재하고 추출과 정량이 간편 하며 다양한 생리활성 효과를 가진 물질이 많기 때문이다 (22). 하지만 너무 많은 종류의 phenolic compounds가 존재 하며, 같은 물질이라고 하더라도 식물체의 생육 환경과 부위 에 따라 유도체의 종류가 다양하게 존재한다. 또한 phenolic compounds들 간의 비율과 서로 간의 상호작용 등에 의하여 추출되는 수율과 종류가 달라지기 때문에 적절한 추출방법 을 찾는 것이 중요하다. 참죽나무 열매 추출물의 최적 추출 조건을 찾기 위하여 열수와 10~100% 농도의 에탄올을 이 용하여 추출한 결과, Fig. 1A에서와 같이 열수 추출물은 56.54 mg/g으로 에탄올 추출물보다 낮은 TPC 추출 함량을 나타내었으며, 에탄올 추출물의 경우 50% 에탄올 추출물이 104.94 mg/g으로 TPC 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 참죽나무 열매 추출물 1 g/100 mL의 동결건조물 양은 열수 추출물에서는 0.18 g, 에탄올 추출물에서는 0.19
g의 건조물을 얻을 수 있었다. 따라서 건조물 무게를 1 g으 로 조절하여 동결건조물의 TPC 함량을 측정한 결과 Fig.
1B에서와 같이 열수 추출물과 50% 에탄올 추출물에서 각각 390.73 mg/g과 491.47 mg/g의 TPC 함량을 나타내었다.
위의 결과를 토대로 추후의 실험은 열수 추출물의 동결건조 물(C. sinensis water extract powder, CSWP)과 50% 에 탄올 추출물의 동결건조물(C. sinensis ethanol extract powder, CSEP)을 실험 재료로 사용하였다.
참죽나무 열매 동결건조물의 항산화 효과
DPPH는 구조 내부에 질소를 가진 보라색 라디칼로 에탄 올 혹은 메탄올에 용해된 상태에서 비교적 안정적인 상태를 유지한다. DPPH는 안정적이기 때문에 일반적으로는 색의 변화가 없으나, 환원력을 가진 물질과 반응하여 특유의 보라 색을 잃으며 연갈색 내지 갈색을 나타낸다. 참죽나무 열매 동결건조물(C. sinensis powder; CSP)의 농도를 50~200 µg/mL로 첨가하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 Fig. 2A에서와 같이 CSWP와 CSEP 50~200 µg/mL의 농 도에서 각각 66.45~72.17%와 66.67~71.38%의 라디칼 소거 활성을 나타내었으며, positive control로 사용한 bu- tylated hydroxytoluene(BHT)의 14.71~44.93%보다 높 은 라디칼 소거 활성을 나타내었다. Kang 등(23)이 매리골 드 메탄올 추출물이 500, 1,000 µg/mL의 농도에서 각각 36.5, 63.7%의 라디칼 소거 활성을 나타낸다고 보고한 것과 비교하였을 때 참죽나무 열매 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 더 우수하다고 판단되었다. ABTS는 강한 산화제인 potassium persulfate의 존재 하에 양이온 라디칼로 변화하 여 특유의 청록색을 나타내며, 항산화제와 반응하여 라디칼 이 소거되면서 그 특유의 청록색을 잃고 무색으로 탈색된다.
따라서 용액의 탈색을 통하여 라디칼 소거 능력을 빠르게 측 정할 수 있는 방법이다(24). CSP의 농도를 50~200 µg/mL 로 첨가하여 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 Fig.
2B에서와 같이 CSWP와 CSEP가 각각 62.12~99.11%,
0 20 40 60 80 100
50 100 150 200
Solid content (μg/mL)
DPPH (%) .
CSWP CSEP BHT
a
A
D γ c
C b β
B a
A
α α
0
20 40 60 80 100
50 100 150 200
Solid content (μg/mL)
ABTS radical decolorization (%) . CSWP
CSEP BHT
a
γ D γ c
C c
B β b
A α
B
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
50 100 150 200
Solid content (μg/mL)
Antioxidant protection factor (PF) . CSWP CSEP BHT
C
a
D b β C β a B
α a A
α
0
20 40 60 80 100
50 100 150 200
Solid content (μg/mL)
TBARs (%) .
CSWP CSEP BHT
a
B
β c B
β c B
α b A
α
D
Fig. 2. DPPH (A), ABTS (B), PF (C), and TBARS (D) by freeze-dried powder from C. sinensis fruits. CSWP, freeze-dried powder of water extract from C. sinensis fruits; CSEP, freeze-dried powder of ethanol extract from C. sinensis fruits. Mean±standard deviation (n=3). Means with different letters (a-c, α-γ, A-D) are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
61.68~99.16%의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내었으 며, BHT보다 높은 라디칼 소거 활성을 나타내었다. Kim 등(25)이 쇠비름의 물 추출물이 250~1,000 µg/mL의 농도 에서 21.07~75.53%, 에탄올 추출물이 동일한 농도에서 23.11~67.03%의 라디칼 소거 활성을 나타낸다고 보고한 결과와 비교하였을 때 CSP의 ABTS 라디칼 소거 활성이 더 높은 결과를 나타내어 천연항산화제로서의 활용 가능성 이 더 높다고 판단되었다. PF는 β-carotene의 특성을 이용 한 항산화 효과 측정 방법으로, 지방산의 산패로부터 생성된 물질이 β-carotene을 산화시켜 특유의 색을 감소시키는 것 을 측정하여 지방산의 초기 산패 여부를 확인할 수 있다 (26). CSP의 PF를 측정한 결과 Fig. 2C에서와 같이 CSWP 와 CSEP 50~200 µg/mL의 농도에서 각각 1.11~1.75와 1.13~1.91 PF를 나타내어 합성항산화제인 BHT의 2.03~
2.20 PF에 필적하는 PF값을 나타내었다. Lee 등(27)이 층 꽃나무 열수 추출물과 에탄올 추출물이 각각 200 µg/mL의 농도에서 1.56, 1.67 PF를 나타낸다고 보고한 결과와 비교 하였을 때, CSP의 지방산 산패에 대한 항산화 효과가 더 우수하다고 판단되었다. 지방의 산패는 산소, 자외선을 포함 한 광선, 열 등에 의하여 자동으로 시작되며 금속이온과 산 화효소 그리고 산화제에 의하여 그 속도가 급격하게 증가한 다고 알려져 있다(28). TBARS는 malondialdehyde(MDA) 와 thiobarbituric acid(TBA)가 결합하는 성질을 이용하여
지방산의 과산화 정도를 측정할 수 있는 방법으로, MDA와 TBA가 결합된 상태에서 열을 가할 경우 특유의 붉은색 혹 은 주황색을 나타낸다. TBARS는 지방산 과산화에 대한 항 산화 효과 측정 외에도 지방이 많은 육류와 어류의 품질 평 가를 위한 실험으로도 이용한다(29). CSP의 TBARS를 측 정한 결과 Fig. 2D에서와 같이 CSWP와 CSEP는 50~200 µg/mL의 농도에서 각각 1.19~38.72%와 28.21~56.95%
의 TBARS를 나타내었다. 따라서 상기의 DPPH, ABTS, PF 및 TBARS의 측정 결과에서와 같이 참죽나무 열매 추출 동 결건조물은 농도에 따라 비교적 우수한 항산화 효과를 나타 내어 천연항산화물질로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.
Elastase 저해 효과
Elastin은 세포와 세포 사이, 조직과 조직 사이에 존재하 는 ECM 단백질 중의 하나로 장기와 혈관 등의 탄력성을 담당하며 최근에는 피부의 elastin이 주목받고 있다. 피부의 elastin은 진피층에 존재하며 다른 ECM 단백질들과 가교결 합을 형성하고 있기 때문에 elastin의 분해는 주름의 생성과 아주 밀접한 관계가 있으며, elastin을 분해하는 효소들 중 하나인 elastase는 elastin을 포함하여 collagen과 다른 ECM 단백질을 비특이적으로 분해하는 효소이며 주름을 생 성하는 직접적인 원인 중 하나로 지목되고 있다(30). CSP의 elastase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 3A에서와 같이
0 20 40 60 80 100
50 100 150 200
Solid content (μg/mL)
Elastase inhibitory rate (%) . CSWP CSEP Ursolic acid
α A
β
B
γ
C
γ
D
A
0
20 40 60 80 100
50 100 150 200
Solid content (μg/mL)
Collagenase inhibitory rate (%) . CSWP CSEP EGCG
a
C
δ d BC γ
c B β
b A
α
B
Fig. 3. Elastase (A) and collagenase (B) inhibitory activities of freeze-dried powder from C. sinensis fruits. CSWP, freeze-dried powder of water extract from C. sinensis fruits; CSEP, freeze-dried powder of ethanol extract from C. sinensis fruits. Mean±standard deviation (n=3). Means with different letters (a-d, α-δ, A-D) are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
CSWP는 elastase에 대한 저해 효과를 나타내지 못했으며 CSEP의 경우 50~200 µg/mL의 농도에서 35.28~85.28%
의 저해 효과를 나타내었다. CSWP와 CSEP의 효능 차이는 추출용매에 의한 phenolic compounds의 profile 차이로 예 상되었다. 또한 화장품의 첨가물로 사용된 물질로 positive control로 사용한 ursolic acid의 28.82~55.98%보다 더 우 수한 저해 효과를 나타내어 화장품 원료로서의 활용 가능성 이 높다고 판단되었다. Kim 등(31)은 괭이밥의 물 추출물과 70% 에탄올 추출물이 100~1,000 µg/mL의 농도에서 각각 6.46~48.00%, 4.33~41.75%의 elastase 저해 효과를 나 타낸다고 보고한 결과와 비교하였을 때, CSEP가 더 뛰어난 효과를 나타냄을 확인하였다.
Collagenase 저해 효과
피부의 진피층에는 collagen, elastin, hyaluronic acid, fibronectin 등 다양한 ECM 단백질이 존재한다. 그중에서 도 collagen은 ECM 전체의 90%를 차지하며 피부의 강도와 형태를 유지하는 역할을 담당한다. Collagen은 elastin을 포 함한 다양한 ECM 단백질과 가교결합을 형성하고 있기 때문 에 collagen이 분해되면 상호 간의 가교결합이 끊어지고 진 피층의 부피가 줄어들어 그 부분에 주름이 발생하며, elas- tin 또한 제 기능을 잃어 피부의 탄력성이 감소한다. 다른 ECM 단백질들에 비하여 많은 부피를 차지하고 있기 때문에 collagenase에 의한 collagen의 분해와 손실은 피부의 주름 생성에 가장 큰 영향을 미친다고 할 수 있다(32). 따라서 주름생성을 억제하기 위해서는 적절한 수준의 collagenase 의 저해가 필요하다고 판단된다. CSP의 collagenase 저해 효과를 측정한 결과는 Fig. 3B에서와 같이 CSWP와 CSEP 가 50~200 µg/mL의 농도에서 각각 4.55~29.38%와 19.24
~56.66%의 저해 효과를 나타내었다. 물 추출 동결건조물보 다 에탄올 추출 동결건조물에서 더 높은 저해 효과를 나타내 었다. 참죽나무 열매의 동결건조물이 epigallocatechin gal- late(EGCG)보다는 다소 낮은 효과를 나타내었으나, 단일물 질이 아닌 혼합물임을 감안했을 때 우수한 효과를 가진다고
판단되었다. Jang 등(33)은 아카시아 꽃 열수 추출물과 메탄 올 추출물이 1,000~3,000 µg/mL의 농도에서 각각 60.89~
70.67%, 58.02~66.06%의 collagenase 저해 효과를 나타 내어 CSP와 비슷한 효과를 나타내었으나 CSP의 농도가 더 낮은 것을 감안하여 유사한 농도로 조절하였을 때 참죽나무 열매의 저해 효과가 좀 더 우수할 것으로 판단된다.
Hyaluronidase(HAase) 저해 효과
Hyaluronic acid(HA)는 N-acetyl glucosamine과 glu- curonic acid가 β-1,4 결합을 이루고 있는 뮤코 다당으로 피부의 진피층과 상처 부위, 염증 부위에 다량 존재한다. HA 는 일반적으로 진피층에서 피부의 수분 조절에 관여하며 ECM과 함께 피부의 구조를 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, HA가 과량 존재할 경우 급성 염증의 원인이 될 수 있으며 hyaluronidase(HAase)에 의하여 분해된 저분 자의 HA 또한 염증의 원인이 될 수 있다. 또한 HAase는 염증 부위에서 활성이 급격하게 증가하고 급성 부종을 일으 키는 등 염증에 직접 관여한다(34). 따라서 HAase의 활성 억제를 통하여 염증을 억제하고 예방하는 효과를 얻을 수 있다. CSP의 HAase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 4A에서 와 같이 CSWP와 CSEP는 50~200 µg/mL의 농도에서 각각 32.26~87.80%와 31.34~88.51%의 매우 높은 HAase 저 해 효과를 나타내었다. 50~150 µg/mL의 농도에서는 CSWP 와 CSEP 모두 positive control로 사용된 tannic acid와 유 사한 저해 효과를 나타내어 염증억제 효과가 매우 우수한 것으로 판단되었다. Lee 등(35)이 마치현, 백년초, 알로에 베라, 감태 혼합 추출물 100, 300, 500 µg/mL의 농도에서 11.2%, 22.7% 및 37.2%의 HAase 저해 효과를 나타낸다고 보고한 결과와 비교하였을 때, CSP의 HAase 저해 효과가 더 뛰어난 것으로 확인되었다.
α-Glucosidase 저해 효과
α-Glucosidase는 전분 등의 다당류에 작용하여 glucose 와 glucose 간의 α-1,4, α-1,6 결합을 절단하는 효소이다.
0 20 40 60 80 100
50 100 150 200
Solid content (μg/mL)
Hyaluronidase inhibitory rate (%) .
CSWP CSEP Tannic acid
a
γ C C d
c β β B
b A
α
A
0
20 40 60 80 100
50 100 150 200
Solid content (μg/mL)
α-Glucosidase inhibitory rate (%) . CSWP CSEP
EGCG
a
β B B c
β c A β A b
α
B
Fig. 4. Hyaluronidase (A) and α-glucosidase (B) inhibitory activities of freeze-dried powder from C. sinensis fruits. CSWP, freeze-dried powder of water extract from C. sinensis fruits; CSEP, freeze-dried powder of ethanol extract from C. sinensis fruits. Mean±standard deviation (n=3). Means with different letters (a-d, α-γ, A-C) are significantly different at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
대부분의 생명체가 α-glucosidase를 가지고 있으며 효모에 가장 많고 α-glucose와 결합되어 있는 모든 물질에 작용하 여 분해할 수 있기 때문에 제약, 식품 등 다양한 산업에 이용 되고 있다(36). 인체 내에서는 소장 상피세포의 가장자리에 서 분비되며, 전분과 반응의 결과로 α-glucose만을 생성하 기 때문에 식후 혈당수치를 높이는 데에 중요한 역할을 한 다. 일반적으로는 생명활동에 필요한 효소이지만 식후 고혈 당의 위험이 있는 비만, 당뇨병 환자들에게는 α-glucosi- dase의 활성을 반드시 조절해야 한다(37). 현재 비만, 당뇨 병 환자들에게 α-glucosidase 저해 약물을 이용하여 활성 을 조절하고 있으나, 장기간 복용 시 올리고당 등이 장내에 과도하게 축적되어 복부팽만, 복통, 설사 등의 부작용을 유 발하기 때문에 안전한 천연물 소재의 α-glucosidase 저해 제를 연구해야할 필요가 있다고 판단된다(36). CSP의 α- glucosidase 저해 효과를 측정해본 결과, Fig. 4B에서와 같 이 CSWP는 50~200 µg/mL의 농도에서 56.47~92.17%, CSEP는 동일한 농도에서 92.90~99.06%의 저해 효과를 나 타내었다. Positive control로 사용한 EGCG의 경우 동일한 농도에서 84.24~94.47%의 저해 효과를 나타내었는데, 동 일한 농도에서의 저해 효과를 비교하였을 때 CSEP의 저해 효과가 더욱 우수한 것으로 확인되었다. Lee(38)가 볶은 구 기자 50% 에탄올 추출물이 100~1,000 µg/mL의 농도에서 35.38~55.92%의 α-glucosidase 저해 효과를 나타낸다고 보고한 결과와 비교하였을 때 CSP의 α-glucosidase 저해 효과가 더욱 우수하다고 판단되었다.
요 약
본 연구에서는 참죽나무 열매 추출물을 이용하여 항산화 및 elastase, collagenase 및 hyaluronidase 등의 효소활성 저 해 효과를 평가하였다. 참죽나무 열매 추출물의 total phe- nolic contents(TPC)는 50% 에탄올 추출물에서 104.94 mg/g으로 가장 높은 추출 수율을 나타내었으며 열수 추출물 의 경우 56.54 mg/g의 추출 수율을 나타내었다. 이를 동결
건조 한 분말(Cedrela sinensis powder; CSP)의 TPC 함량 은 390.73, 491.47 mg/g으로 높은 TPC 함량을 나타내었 다. CSP의 항산화 효과를 측정한 결과 DPPH 라디칼 소거 활성은 200 µg/mL 농도에서 CSWP와 CSEP가 각각 72.17
%와 71.38%의 소거 활성을 나타내었다. ABTS 라디칼 소 거 활성을 측정한 결과 200 µg/mL 농도에서 CSWP와 CSEP 가 각각 99.11%와 99.16%의 소거 활성을 나타내었다. PF 를 측정한 결과 200 µg/mL 농도에서 CSWP와 CSEP가 각 각 1.75와 1.91 PF를 나타내었고, TBARS는 200 µg/mL 농도에서 CSWP는 38.72%, CSEP는 56.95%를 나타내었 다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성은 positive control로 사용한 BHT보다 높은 활성을 나타내었으나, PF와 TBARS 의 경우 BHT보다 낮은 효과를 나타내었다. CSP의 elas- tase 저해 효과를 측정한 결과 200 µg/mL 농도에서 CSEP 에서 85.28%를 나타내었다. Collagenase 저해 효과를 측정 한 결과 200 µg/mL 농도에서 CSWP와 CSEP가 각각 29.38
%, 56.66%의 저해 효과를 나타내었다. 따라서 CSP는 elas- tase와 collagenase가 관여하는 주름 생성과정을 억제할 수 있을 것으로 예상되었다. CSP의 hyaluronidase 저해 효과 를 측정한 결과 200 µg/mL 농도에서 CSWP와 CSEP가 각 각 87.80%, 88.51%의 저해 효과를 나타내었다. α-Gluco- sidase 저해 효과를 측정해본 결과 200 µg/mL 농도에서 CSWP와 CSEP가 각각 92.17%, 99.06%로, positive con- trol로 사용한 EGCG와 유사하거나 더욱 높은 저해 효과를 나타내었다. 이상의 연구 결과를 통해 참죽나무 열매의 동결 건조물은 항산화 효과, 주름개선 효과, 항염증 효과 및 α- glucosidase 저해를 통한 혈당상승 억제효과가 우수한 것으 로 판단되었으며, 기능성 소재로서의 활용 가능성이 높다고 판단되었다.
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