미생물 발효 괭생이모자반의 생리활성 평가 강소미

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미생물 발효 괭생이모자반의 생리활성 평가

강소미^1,2․이 철²․정다혜²․김지원²․부경환^2,3․김재훈^2,3․김창숙^2,3

1(주)큐젠바이오텍

2제주대학교 생명공학부

3제주대학교 아열대/열대생물유전자은행센터

Evaluation of Biological Activities of Sargassum horneri Fermented by Microorganisms

So Mi Kang^1,2, Cheol Lee², Da Hye Jeong², Jiwon Kim², Kyung Hwan Boo^2,3, Jae Hoon Kim^2,3, and Chang Sook Kim^2,3

1Quegen Biotech Co., Ltd.

2Faculty of Biotechnology and ³Subtropical/Tropical Organism Gene Bank, Jeju National University

ABSTRACT We conducted a preliminary evaluation of the biological activities of fermented Sargassum horneri.

We used 3 bacterial strains, namely, Bacillus amyloliquefaciens, Lysinibacillus xylanilyticus, and Lactobacillus casei to ferment S. horneri and then tested its antioxidant activity and anti-inflammatory activity. The polyphenol content of fermented S. horneri increased marginally to about 2∼9% compared to the control group, but the total flavonoid content increased significantly to about 39∼104%. The 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl and 2,2′-azino-bis(3-ethylbenz- othiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenging activity of fermented S. horneri were higher compared to that of non-fer- mented samples. This was associated with an increase in total phenol and total flavonoid content. The anti-inflammatory effect of fermented S. horneri was measured in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells. The nitric oxide (NO) production inhibitory activity of fermented groups increased by about 8∼21% compared to the non-fermented sample and showed concentration-dependent NO production inhibitory activity. Also, these fermented groups showed inhibitory activity against inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression compared to the control group. It is suggested that the NO production inhibition by fermentation is due to iNOS and COX-2 expression inhibition. These results are considered to be important inputs for the study of the separation and utilization of active ingredients with antioxidant and anti-inflammatory effects using fermented S. horneri, which may have a potential application in the development of biomaterials such as functional foods. Further studies on other biological effects of the active ingredients should be conducted in the future.

Key words: anti-inflammatory, antioxidation, fermentation, Sargassum horneri

Received 17 July 2020; Accepted 21 September 2020

Corresponding author: Chang Sook Kim, Faculty of Biotechnology, Jeju National University, Jeju 63243, Korea,

E-mail: [email protected]

Author information: So Mi Kang (Researcher), Cheol Lee (Graduate student), Da Hye Jeong (Graduate student), Jiwon Kim (Graduate student), Kyung Hwan Boo (Professor), Jae Hoon Kim (Professor), Chang Sook Kim (Professor)

서 론

해조류는 단백질, 비타민, 미네랄, 폴리페놀, 다당류 및 식이섬유 등이 풍부한 저칼로리 식품 자원으로서 그 중요성 이 크게 부각되고 있다(Macartain 등, 2007). 특히 갈조류 는 플라보노이드 및 후코이단 등과 같은 기능성 물질들을 함유하고 있어서 항산화, 항암, 항염증, 면역조절 작용 등의 다양한 생리활성을 가진 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2006;

Kwak 등, 2005; Cha 등, 2006; Kim 등, 2008).

모자반과에 속하는 괭생이모자반(Sargassum horneri) 은 우리나라 동해안과 남해안을 비롯하여 일본의 전 연안과 중국의 동쪽 연안에 폭넓게 분포하고 있는데(Preeprame 등, 2001; Liu 등, 2012; Kim, 2015), 최근에는 동중국해에 서식하는 괭생이모자반 군락이 우리나라 남해안과 제주지 역으로 대량 유입되면서 여러 형태의 문제를 야기하고 있다 (Moon 등, 2018). 이렇게 대량 발생하는 괭생이모자반은 농업용 비료 또는 가축 사료 등으로 일부 이용되고 있으나 대부분은 매립하거나 소각하는 실정이라서 산업적으로 다양 하게 활용하기 위한 노력이 요구되고 있다. 예컨대 괭생이모 자반을 식재료로 활용하기 위한 노력과 이것들이 보유한 기 능성 물질을 바이오소재로 이용하기 위한 연구들이 진행되 고 있다. 현재까지 알려진 괭생이모자반의 생리활성은 골다 공증 방지 효과를 비롯하여 항산화 및 항암, 면역증진 등이

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Table 1. Analytical conditions of HPLC for fermented S. horneri Parameters Conditions

Instruments

Shimadzu HPLC system

(DGU-20A, LC-20AD, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-2-A)

Column Shim-pack GIS ODS (250×4.6 mm) Detector UV/Vis

Mobile phase

Time (min) H2O (%) MeOH (%) 0

5 45 50 55 60

70 70 0 0 70 70

30 30 100 100 30 30

Other conditions

Scan wavelength Wavelength Column temp.

Flow rate Injection volumn

190∼800 nm 240 nm 40°C 1 mL/min 20 µL 있다(Yamaguchi, 2006; Shao 등, 2014; Shao 등, 2015;

Kim 등, 2018). 한편, 모자반류를 포함한 해조류는 생리활 성이 우수한 성분들을 함유하고 있지만 유효성분의 산업화 과정에는 어려움을 갖고 있다. 해조류의 유효성분을 얻기 위해서는 일반적으로 열수 추출, 용매 추출, 산 및 알칼리 가수분해 또는 효소처리 등의 공정방법을 사용하고 있는데, 이들 방법은 생리활성 성분을 변성시키거나 파괴하는 등의 문제점을 갖고 있다(Kim과 Bae, 2002; Eom 등, 2010). 이 에 최근에는 해조류의 유효성분을 추출하는 과정의 단점을 극복하면서도 기존의 생리활성을 증가시키는 공정개발로써 유용 미생물을 이용하는 해조류의 발효 연구가 관심을 받고 있다(Shobharani 등, 2012; Lee 등, 2015; Lee 등, 2016).

본 연구에서는 제주지역에서 대량 발생하는 괭생이모자 반을 식품 등의 분야에 기능성 소재로 적용하기 위한 연구의 일환으로써 미생물 발효가 괭생이모자반의 생리활성 변화 에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 이를 위해 제주 해안 지역에서 분리 동정한 유용 미생물 Bacillus amyloliquefaciens, Lysinibacillus xylanilyticus와 유산균 Lactobacil- lus casei를 이용하여 발효시킨 괭생이모자반 발효물을 대 상으로 항산화 물질 및 항산화 활성을 측정하였고, 발효 괭 생이모자반이 lipopolysaccharide(LPS)로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 nitric oxide(NO) 생성 및 inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 cyclooxygenase-2(COX- 2) 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하여 괭생이모자반 발 효물의 항염증 증진 효과를 검증하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 유용 미생물

본 실험에 사용한 괭생이모자반은 2019년 5월 5일 제주 특별자치도 제주시 애월읍 구엄리 해안가에 대량 유입된 군 락에서 채집하여 수돗물로 2회 세척한 다음 그늘에서 자연 건조 시킨 뒤, 마쇄기(DH-400, DaeHwa, Cheonan, Korea) 로 분쇄하여 미세 분말화한 후 4°C에 보관하면서 사용하였 다. 미생물 배양 및 발효에 이용된 배지는 Difco(Detroit, MI, USA)에서 구입하여 사용하였고 생리활성 평가에 이용한 모 든 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 한편, 괭생이모자반 발효에는 제주 비양도 및 형제섬 퇴적토에서 분리하여 제주테크노파크 생물종다양성 연구소에서 보관 중인 B. amyloliquefaciens BMM34, Lys. xylanilyticus HST13과 제주대학교 생명공학부에 보관 중인 Lac. casei KCCM 12452(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)를 사용하였다.

괭생이모자반 발효물의 제조

3종의 유용 미생물은 각각 MRS 액체배지에 접종하여 30°C에서 정치배양한 후 원심분리(3,000×g, 15 min)하여 균체를 회수하였다. 괭생이모자반의 발효물 제조는 Lee 등

(2016)의 방법을 응용하였는데, 미생물 배지는 괭생이모자 반 분말 시료를 5% 첨가하여 brain heart infusion(BHI) broth를 제조한 다음 120°C의 감압조건에서 1시간 멸균하 였다. 발효는 멸균 제조된 배지에 각각의 미생물 균주를 1%

농도로 접종한 후 30°C에서 8일 동안 정치배양 또는 현탁배 양 하면서 배양시간에 따른 발효 효과를 조사하였다. 발효액 은 원심분리(3,000×g, 15 min)한 후 상등액을 회수, -80°C 에서 동결한 후 동결건조기(HyerCool 55-4, Gyrozen, Gim- po, Korea)를 이용하여 건조 고형물을 제조하였고 이를 실 험 시료로 사용하였다.

괭생이모자반 발효액의 특성 조사

미생물에 의한 괭생이모자반 발효액의 특성 변화 여부를 확인하기 위해 2일 간격으로 배양액의 pH를 측정하였고, 발효과정에서 괭생이모자반 유용성분들의 변화를 탐색하기 위해 발효 전과 발효 6일째의 배양액을 대상으로 Table 1 조건으로 HPLC(Shimadzu HPLC System, Shimadzu, Kyo- to, Japan) 분석을 수행하였다.

항산화 물질 및 항산화 활성 측정

총 폴리페놀 화합물의 함량은 Folin과 Denis(1912) 방법 에 따라 측정하였다. 농도별로 희석한 시료 100 µL를 증류 수 400 µL와 희석한 다음 1 N Folin-Ciocalteu’s reagent 200 µL를 가하여 혼합한 후 암소에서 3분간 반응시켰다.

여기에 10% Na2CO3 용액 300 µL를 가하여 혼합한 후 암소 에서 30분간 반응시켰다. 반응액을 96-well plate에 200 µL씩 옮긴 다음 microplate spectrophotometer(Thermo scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 quercetin을 사용하여 농 도별 표준용액에 대한 흡광도로 표준검량선을 작성한 후 폴 리페놀 함량을 구하였으며, 총 페놀 함량은 µg quercetin

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equivalent(QE/mL)로 표기하였다. 총 플라보노이드 함량 은 Moreno 등(2000)의 aluminum chloride 방법을 응용하 여 측정하였다. 시료 40 µL를 96-well plate에 옮기고 증류 수 140 µL와 혼합한 후, 10% AlCl3 용액 20 µL를 가하여 암소에서 10분간 반응한 다음 microplate spectropho- tometer를 이용하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성 은 Blois(1958)의 방법에 준하여 측정하였다. 시료 추출물 40 µL에 0.3 mM DPPH 용액 160 µL를 가하여 혼합하고 암소에서 30분간 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 각 시료의 DPPH 라디칼 소거능은 다음 식에 의해 계산하여 백분율(%)로 나타내었다.

DPPH 라디칼

소거활성(%) ＝

(

^1－_{대조구의 흡광도}^{시료의 흡광도}

)

^×100

ABTS[(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonate)] 라디칼 소거 활성은 Re 등(1999)의 방법에 준하 여 측정하였다. 분석에 사용된 ABTS 용액은 7.4 mM ABTS 용액과 2.6 mM potassium persulfate 용액을 혼합하여 14 시간 동안 암실에 방치하였고, ABTS 양이온을 형성시킨 후 734 nm의 흡광도 값이 0.7±0.02 범위가 되도록 조절하였 다. 시료 10 µL를 96-well plate에 옮기고 ABTS 용액 190 µL와 혼합한 후, 암실에서 30분간 반응시킨 다음 734 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 ABTS 라디칼 소거능은 다음 식에 의해 계산하여 백분율(%)로 나타내었다.

ABTS 라디칼

소거 활성(%)＝

(

^1－ _{대조구의 흡광도}^{시료의 흡광도}

)

^×100

세포배양 및 세포독성 측정(MTT assay)

대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 10% fetal bovine serum(FBS)과 penicillin-streptomycin 100 units/mL(SAFC, Brooklyn, Australia)이 함유된 DMEM 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37°C, 5% CO₂ 항온기에서 배양했으며, 3일 간격으로 계대배양을 시행하였다. 괭생이 모자반 발효물이 RAW 264.7 세포에 대한 세포독성은 3- [4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다(Chung 등, 2005). RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 에 현탁시킨 후 48-well plate에 5×10⁵ cells/mL의 세포수 가 되도록 300 µL씩 분주하여 37°C, 5% CO₂ 항온기에서 18시간 동안 배양하고, 각각의 발효액 시료를 300, 500 µg/

mL 농도로 처리하여 24시간 동안 다시 배양하였다. 이후 5 mg/mL의 MTT를 각 well에 1 mg/mL 농도가 되게 넣고 잘 섞어 준 다음 4시간 동안 37°C 항온기에서 배양한 후 상층액을 제거하고 DMSO를 300 µL 첨가하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 2.5×10⁵ cells/mL로 조절한 후 48-well plate에 접종하고, 발효물 시료와 LPS(1 µg/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO양은 Griess 시약[1%(W/V) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphthylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양 중에 존 재하는 NO₂^-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 µL와 Griess 시약 100 µL를 혼합하여 96-well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

생성된 NO의 양은 2-amino-4-methylpyridine을 stand- ard로 비교하였다.

iNOS 및 COX-2 발현 억제 효능 평가(western blot analysis) RAW 264.7 세포(1.0×10⁶ cell/mL)를 18시간 전 배양한 후, 시료와 LPS(1 µg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하 였다. 세포를 phosphate buffered saline으로 2회 세척한 후 200 µL의 lysis buffer[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO₃, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride, 25 µg/mL aprotinin, 25 µg/mL leupeptin]를 첨가하여 4°C에서 1시간 동안 lysis 시킨 후 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin을 표준화하여 Bio-Rad protein assay kit(Bio-Rad, Her- cules, CA, USA)을 사용하여 정량하였다. 분리된 단백질 20

~30 µg을 10~12% mini gel SDS-PAGE(poly acrylamide gel electrophoresis)로 변성 분리하여 이를 PVDF(poly- vinylidene difluoride) membrane(Bio-Rad)에 200 mA로 2시간 동안 transfer 하였다. 그리고 membrane의 blocking 처리는 5% skim milk가 함유된 TBST(TBS+0.1% Tween 20) 용액에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현량을 확 인하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS(1:1,000, BD Bio- sciences Pharmingen, San Jose, CA, USA)를, COX-2의 발현량을 확인하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2(BD Biosciences Pharmingen)를 TBST 용액에 희석하여 상온 에서 2시간 반응시킨 후 TBST로 4회 세척하였다. 반응이 완료된 membrane을 ECL 기질(Intron Biotechnology, Inc., Seongnam, Korea)과 1분간 반응 후 X-ray 필름에 감광하 였다.

통계처리

모든 실험은 3 반복 이상 실시하여 측정한 값을 각 항목에 따라 평균±표준오차(SE)로 표시하였다. 통계처리는 SPSS (Statistical Package for Social Science, Chicago, IL, USA) v18을 이용하여 일원배치 분산분석(one-way ANOVA) 및 최소유의차검증(LSD)을 통해 특정 처리군과 대조군 간의 통계적 유의차를 신뢰수준 95%(P<0.05)에서 평가하였다.

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A

B

Fig. 1. HPLC chromatogram of the non-fermented and fermented S. horneri for 6 days by Lac. casei.

(A) static culture, (B) suspension culture.

결과 및 고찰

괭생이모자반 발효액의 특성 변화

미생물에 의한 괭생이모자반의 발효 여부를 확인하기 위 해 각각의 미생물 균주를 접종한 괭생이모자반 발효액의 pH 변화와 물질의 변화 여부를 HPLC로 조사하였다. 미생물 발 효 기간에 따른 배양액의 pH는 대조군인 비발효군이 pH 5.4~5.7 범위로 변화가 거의 없었으나, Lac. casei를 접종 한 배양액은 초기 pH 5.4에서 4일 차에 pH 3.9~3.8로 감소 하고 8일 차까지 pH 3.8~3.7 수준을 유지하였다. 반면, B. amyloliquefaciens 및 Lys. xylanilyticus를 접종한 각각의 배양액의 경우에는 초기 pH 5.4에서 4일 차에 pH 6.1~6.3 으로, 8일 차에는 pH 6.6~6.7 범위로 다소 증가하였다(자료 미제시). 유산균인 Lac. casei를 접종한 배양액에서는 유산 균이 생장하면서 lactic acid를 배출하기 때문에 발효상태에 따라 배양액의 pH가 감소한 것으로 여겨진다. 이는 미생물 생장에 따라 발효가 정상적으로 진행되고 있음을 의미하고 있다. 한편, 미생물 발효에 의한 배양액의 물질 변화 여부를 확인하기 위해 6일 차 배양액을 대상으로 HPLC 분석을 수 행하였다(Fig. 1). Fig. 1에서 보는 바와 같이 retention time 15분 및 30분 위치에서 나타나는 HPLC 크로마토그램 피크 의 변화와 증가는 괭생이모자반의 발효과정에서 물질의 변 화가 일어나고 있음을 간접적으로 유추할 수 있게 하였으며, 최적의 조건에서 발효가 제대로 이루어진다면 유용성분의 함량 변화와 더불어 생리활성의 변화도 일어날 수 있음을 보여주는 것이라 여겨진다. 향후 지표물질 설정과 발효에 따른 유효성분의 변화 등에 관한 세부적인 연구는 계속 진행 될 예정이다.

발효 괭생이모자반의 항산화 성분 분석

폴리페놀계 물질들은 분자 하나에 hydroxyl(-OH)기를

여러 개 가지고 있는 방향족 화합물들을 총칭하며 식물체에 는 phenolic acids, flavonoids, catechin, resveratrol 등 8,000여 개의 물질들이 분포하는 것으로 알려져 있다(Pan- dey와 Rizvi, 2009). 또한, 이들 폴리페놀 화합물은 항암, 고혈압 억제, 충치 예방 등의 다양한 생리적 효과를 보유할 뿐만 아니라 강력한 항산화 활성을 갖는 우수한 항산화 물질 로 알려져 있다. 특히 톳, 다시마 등 해조류의 항산화 활성은 폴리페놀 화합물의 함량과 높은 상관성을 갖는다는 연구보 고와 더불어 발효 미생물을 이용하여 해조류를 발효한 경우 에는 폴리페놀 함량 증가에 따른 항산화 활성이 높아진다고 보고하고 있다(Kwak 등, 2005; Song 등, 2011b; Lee 등, 2015). 이에 2일간 발효한 괭생이모자반 발효물과 비발효 물을 대상으로 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량을 측정 하여 비교하였다(Table 2). 발효물의 총 폴리페놀 함량은 대조구에 비해 약 2~9% 범위로 약간 증가하는 경향을 보였 으며, B. amyloliquefaciens 균주에 의한 발효물이 상대적 으로 높은 값을 보였다. 반면 10 mg/mL의 발효물인 경우 총 플라보노이드 함량은 발효에 의해 약 39~104% 범위로 크게 증가하였는데, Lac. casei, Lys. xylanilyticus 및 B. amyloliquefaciens 발효물은 비발효물 대비 각각 69%, 39%, 104%로 크게 증가하였다.

발효 괭생이모자반의 항산화 활성

괭생이모자반 발효물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소 거능으로 측정하여 Table 3에 나타내었다. 발효물의 농도에 따라 발효 전과 후의 DPPH 라디칼 소거 활성을 비교한 결과 대조구인 quercetin보다는 전반적으로 활성이 낮게 나타났 으나 발효 괭생이모자반은 비발효 괭생이모자반에 비해 높 은 활성을 보였다. 발효 2일 차인 경우, 발효물의 농도 200, 1,000 및 2,000 µg/mL에서 비발효액은 각각 15.9%, 47.3

% 및 74.3%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈는데, B.

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Table 2. The contents of total polyphenol and flavonoid in non-fermented and fermented S. horneri for 2 days

Sample concentration (mg/mL) 1 5 10

Antioxidants Bacteria Content (µg/mL)¹⁾

Total polyphenol

No bacteria Lac. casei Lys. xylanilyticus B. amyloliquefaciens

11.0±0.2 11.4±0.2 12.0±0.3^* 11.8±0.1^*

78.0±0.6 80.0±0.7 84.7±4.4 83.9±2.2

141.9±2.3 144.5±4.4 140.5±5.3 148.3±1.6

Total flavonoid

ND²⁾ ND ND ND

2.1±0.3 2.1±0.1 1.9±0.6 2.8±0.3

2.3±0.6 3.9±0.2^* 3.2±0.2 4.7±0.6^**

1)µg quercetin equivalent/mL of sample. ²⁾ND: not detected.

Data were expressed as mean±SE for three tests. A significant difference was determined by one-way ANOVA with LSD test.

*P<0.05, ^**P<0.01; compared with no bacteria.

Table 3. DPPH radical scavenging activities of fermented S. horneri

Sample concentration (µg/mL) 200 1,000 2,000

Fermentation period (day) Bacteria Activity (%)

2

15.9±0.6 17.0±0.3 19.2±0.5^**

17.3±0.6

47.3±1.5 51.3±1.4^* 52.6±0.8^* 54.6±0.8^*

74.3±1.6 76.8±1.8 77.5±0.4 79.3±1.5^*

4

16.0±1.0 16.7±0.2 13.9±0.2^* 13.5±0.5^*

46.0±1.0 54.2±1.0^**

48.0±1.9 49.0±1.2

74.4±0.4 79.2±0.9^* 78.0±2.0 77.5±1.0

6

13.4±0.5 14.3±1.4 14.3±0.1 12.9±0.2

43.4±1.3 53.5±0.8^***

50.3±1.3^**

47.3±1.2^*

72.8±2.2 76.4±2.7 81.6±0.9^* 73.9±2.4 Positive control

(quercetin)

Quercetin (µg/mL) 2 10 20

Activity (%) 17.6±0.5 70.0±0.7 82.3±0.7

Data were expressed as mean±SE for three tests. A significant difference was determined by one-way ANOVA with LSD test.

*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001; compared with no bacteria.

amyloliquefaciens에 의한발효 괭생이모자반인 경우는 각 각 17.3%, 54.6% 및 79.3%의 소거 활성을 보이는 것처럼 전반적으로 미생물 발효물에서 DPPH 라디칼 소거 활성이 높아지는 경향을 보였다. 특히 Lac. casei 발효물인 경우에 는 비발효물에 비해 발효 기간이 늘어날수록 DPPH 라디칼 소거 활성이 높게 나타났으며, 1,000 µg/mL의 발효물인 경 우는 비발효군 대비 발효 2일, 4일, 6일 차에 각각 8.4%, 17.8%, 23.3% 증가하였다. 이 결과는 꽈배기모자반, 톳, 다 시마 등과 같은 해조류의 발효 추출물이 비발효 추출물에 비해 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 가진다는 보고들과 비슷하다(Song 등, 2011b; Park 등, 2014; Lee 등, 2015).

ABTS는 DPPH와 마찬가지로 천연물질의 항산화 활성을 검 증하기 위해 많이 이용되는 방법인데, 청록색의 ABTS 양이 온 라디칼(ABTS⁺)은 항산화 물질과 반응하여 무색의 중성 형태로 전환되고 이를 흡광도 수치로 나타내어 추출물의 항 산화 활성을 평가할 수 있다. 이에 괭생이모자반 발효물을 대상으로 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하여 Table 4에

나타냈다. Table 4에 나타난 바와 같이 500 µg/mL 농도에 서도 ABTS 라디칼 소거 활성은 상대적으로 DPPH 라디칼 소거 활성에 비해 높게 나타났는데, 이는 ABTS 라디칼은 DPPH 라디칼과 다르게 극성물질 및 비극성물질 모두와 반 응하여 소거되며, ABTS 라디칼과 잘 반응하는 항산화 물질 이 DPPH와는 전혀 반응하지 않을 수도 있다는 보고(Re 등, 1999)와 부합한다고 여겨진다. DPPH 소거능의 결과와 유 사하게 괭생이모자반 시료의 농도가 증가할수록 ABTS 라 디칼 소거 활성이 유의적으로 증가하였으며 21.4~97.3%의 활성을 보였다. 한편, 발효 괭생이모자반의 ABTS 라디칼 소거능은 비발효군에 비해 대체로 높은 경향을 유지하였으 나 뚜렷이 큰 차이는 나타나지 않았다. 이는 DPPH가 안정한 자유라디칼인 반면에 ABTS는 양이온 라디칼이어서 발효액 에 존재하는 항산화 물질의 종류에 따라 반응에 차이가 생길 수 있기 때문으로 사료된다. 이상의 결과는 유산균 발효에 의한 톳 추출액의 폴리페놀 증가가 항산화 활성 증가를 초래 했다는 보고(Song 등, 2011a)와 유사하며, 미생물 균주에

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A

B

Fig. 2. Inhibitory effects of the fermented S. horneri for 4 days on cell viability and NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. A: Cytotoxicity was determined using the MTT method. B: The production of NO was assayed in the culture medium of cells treated with LPS (1 µg/mL) for 24 h in the presence of fermented S. horneri (300 and 500 µg/mL). NB:

fermented by no bacteria, LC: fermented by Lac. casei, LX:

fermented by Lys. xylanilyticus, BA: fermented by B. amyloli- quefaciens, S: 2-amino-4-picoline (20 µg/mL). Data were ex- pressed as mean±SE for three tests. A significant difference was determined by one-way ANOVA with LSD test. ^*P<0.05; com- pared with no bacteria.

Table 4. ABTS radical scavenging activities in fermented S. horneri

Concentration (µg/mL) 50 250 500

Fermentation period (day) Bacteria Activity (%)

2

22.6±1.6 21.4±1.7 23.1±2.1 23.4±1.4

68.0±3.0 70.3±2.4 72.6±2.3 71.0±2.0

92.5±3.1 91.8±3.6 91.9±2.7 97.3±1.0

4

22.2±1.3 22.4±1.8 22.0±1.2 22.8±1.4

64.6±2.0 68.3±1.7 64.4±3.6 69.4±2.3

89.1±3.5 93.5±2.5 93.2±1.5 93.1±1.3

6

23.6±1.6 22.6±1.1 22.4±1.1 22.1±1.3

68.7±2.9 70.7±2.0 70.2±2.2 69.0±2.0

92.5±3.4 95.7±1.5 95.4±1.6 93.9±1.4 Positive control

(quercetin)

Concentration (µg/mL) 2 10 20

Activity (%) 21.2±1.0 75.6±1.6 97.5±1.1

Data were expressed as mean±SE for three tests.

의한 괭생이모자반의 발효과정에서 물질변화가 유도되어 총 플라보노이드 함량이 증가하였고 그 결과로 항산화 활성 이 증가하는 것으로 사료된다.

세포독성에 미치는 영향

괭생이모자반 발효물의 RAW 264.7 세포에 대한 세포독 성은 MTT assay로 확인하였다(Fig. 2A). RAW 264.7 세포 에 비발효 괭생이모자반과 발효 괭생이모자반을 각각 300, 500 µg/mL 농도로 처리하여 세포 생존율을 측정한 결과, 84.0%의 세포 생존율을 보인 500 µg/mL 농도의 Lys. xylanilyticus 발효물를 제외하고는 나머지 모든 시료에서 90%

이상의 세포 생존율을 보여 RAW 264.7 세포에 대한 독성이 나타나지 않음을 확인하여 이 농도 범위에서 발효물의 염증 억제 활성을 측정하였다.

NO 생성 억제 효과

RAW 264.7 세포와 같은 대식세포에서는 LPS와 같은 외 부 자극에 의해 염증반응이 일어날 때 NO, prostaglandin E2(PGE2), pro-inflammatory cytokines와 같은 염증 매개 물질들이 분비된다(Lazarov 등, 2000). 이 사실을 근거로 하여 미생물 발효 괭생이모자반이 세포 내에서 NO 생성에 미치는 영향을 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 조사하 였다(Fig. 2B). 발효물의 NO 생성 억제능은 Lys. xylanilyticus 발효물 농도 300 µg/mL에서 약 14% 수준으로 유의하 게(P<0.05) 증가하였으나, Lac. casei 및 B. amyloliquefaciens 발효물인 경우에는 큰 차이가 나타나지 않았다. 반면 발효물 농도 500 µg/mL인 경우에는 통계적 유의성은 다소 낮으나 비발효군에 비해 약 8~21% 증가하는 것으로 나타나 미생물 발효는 괭생이모자반의 항염증 활성을 증진시킬 수 있음을 보여주었다. 한편, Lys. xylanilyticus 및 B. amylo- liquefaciens에 의해 4일째 발효된 괭생이모자반의 농도별

NO 생성 억제력은 Fig. 3에 나타냈으며, 발효물의 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 NO 생성 억제능이 유의하게

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Fig. 3. Inhibitory effects of the fermented S. horneri for 4 days on NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells were treated by LPS (1 µg/mL) for 24 h in the presence of the fermented S. horneri (100, 300, 500, and 1,000 µg/mL). LX: fer- mented by Lys. xylanilyticus, BA: fermented by B. amylolique- faciens. Data were expressed as mean±SE for three tests. A sig- nificant difference was determined by one-way ANOVA with LSD test. ^*P<0.05, ^***P<0.001; compared with positive control (LPS treatment without sample).

A

B

Fig. 4. Inhibitory effects of fermented S. horneri for 4 days on the protein level of iNOS and COX-2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. A: RAW 264.7 cells (1×10⁶ cells/mL) were pre-in- cubated for 18 h, and the cells were treated with LPS (1 µg/mL) in the presence of fermented S. horneri (500 µg/mL) for 24 h.

iNOS and COX-2 protein levels were determined using immuno- blotting method. B: Cells were treated by LPS (1 µg/mL) for 24 h in the presence of the fermented S. horneri (100, 300, and 500 µg/mL). NB: fermented by no bacteria, LX: fermented by Lys. xylanilyticus, BA: fermented by B. amyloliquefaciens. Data were expressed as mean±SE for three tests. A significant difference was determined by one-way ANOVA with LSD test. ^*P<

0.05; compared with positive control (LPS treatment without sample).

증가하였다(P<0.001). 이 결과는 Lactobacillus sp. 등의 유산균으로 발효한 꽈배기모자반 발효물 뿐만 아니라 톳 발 효물은 비발효군에 비해 NO 생성 억제 효과가 높다는 연구 결과들과 유사하였다(Lee 등, 2016; Mun 등, 2015).

iNOS와 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향

대식세포와 같은 염증세포들은 NO, PGE2, tumor ne- crosis factor-α(TNF-α) 및 interleukin-6(IL-6) 등과 같 은 염증매개 물질을 분비하여 염증반응을 일으키며, NOS와 COX-2의 발현을 유도하여 많은 양의 NO와 PGE₂를 생성시 킨다(Albina와 Reichner, 1995; Lazarov 등, 2000). 따라 서 발효 괭생이모자반의 NO 생성 억제 활성이 염증 유발 단백질로 알려진 iNOS와 COX-2의 발현 조절과 관련이 있 는지를 알아보기 위해 단백질 수준에서의 발현을 western blot으로 조사하였다. LPS(1 µg/mL)를 처리한 RAW 264.7 세포에 발효 괭생이모자반을 24시간 처리한 후 iNOS와 COX-2의 발현 억제 활성을 확인하였다. 그 결과 LPS 단독 처리구에서는 iNOS와 COX-2의 발현이 현저히 증가하였 고, 대조구인 비발효군에 대비하여 Lys. xylanilyticus 및 B. amyloliquefaciens의 발효물 처리구에서는 iNOS와 COX-2 발현이 현저히 억제됨을 알 수 있었다(Fig. 4A). 또한, Lys. xylanilyticus 발효물은 농도(50, 100, 300, 500 µg/mL)에 의존적으로 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 효과를 보였 다(Fig. 4B). 따라서 괭생이모자반 발효물의 NO 생성 억제 효과는 iNOS 및 COX-2 발현 억제를 통한 것으로 여겨진다.

요 약

본 연구에서는 대량 발생하는 괭생이모자반을 기능성 소재 로서의 이용 가치를 증진하기 위한 연구의 일환으로 제주

연안 지역에서 분리된 유용 미생물 B. amyloliquefaciens 및 Lys. xylanilyticus와 유산균 Lac. casei를 이용하여 발 효시킨 괭생이모자반의 항산화 및 항염증 효과를 평가하였 다. 발효 괭생이모자반의 총 폴리페놀 함량은 대조구에 비해 약 2~9% 범위로 소폭 증가하였으나, 총 플라보노이드 함량 은 미생물 발효에 의해 약 39~104% 범위로 크게 증가하였 다. 특히, B. amyloliquefaciens 균주에 의한 발효물이 상대 적으로 높은 값을 보였다. 발효 괭생이모자반의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능은 비발효물에 비해 높은 경향을 보였 으며, 이는 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량 증가와 연관되 어 나타났다. LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 발효 괭 생이모자반의 항염증 효과를 측정한 결과, 발효물의 NO 생 성 억제능은 비발효군 대비 약 8~21% 증가했으며 농도 의

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존적으로 NO 생성 억제 활성을 보였다. 대상 미생물 중에서 는 Lys. xylanilyticus 발효물이 가장 높은 NO 생성 억제 효과를 보였다. 또한, 이들 발효물은 대조군에 비해 iNOS 및 COX-2 발현이 현저하게 억제됨을 보였다. 미생물 발효 괭생이모자반에 의한 NO 생성 억제는 iNOS 및 COX-2 발 현 억제에 의한 것임을 제시한다. 이상의 결과는 괭생이모자 반의 발효물을 이용한 항산화 및 항염증 효능을 갖는 유효성 분 분리 및 활용화 연구에 중요한 기초자료가 될 것이며 기 능성 식품 등의 바이오 소재 개발에 적용 가능성이 높다고 사료된다. 향후 다른 생리활성 증진 효과 및 유효성분에 대 한 연구는 좀 더 진행돼야 할 것이다.

감사의 글

본 연구는 2019년도 환경부지정 제주녹색환경지원센터(과 제번호 19-18-03-03-22-06)의 연구비 지원에 의해 이루 어진 것으로 감사드립니다.

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