증포 구기자의 항산화성 모니터링 및 추출조건 최적화
이 기 동 중부대학교 바이오융합학부
Monitoring of Antioxidative Activities and Optimization of Extraction Conditions for Steamed and Dried Gugija (Lycium chinensis Mill)
Gee-Dong Lee
Division of Integrated Biotechnology, Joongbu University
ABSTRACT To optimize the extraction of antioxidant extracts from steamed and dried Gugija, the extraction parame- ters were modified ethanol concentration (X1, 0∼80%) and extraction time (X1, 1∼5 h), and the response parameters were analyzed by RSM for yield, brown color intensity, flavonoid content, and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging activities. Coefficients of determi- nations (R2) of the regression models ranged from 0.8494∼0.9909 (P<0.01∼0.1) in the reaction parameters. Yield of the steamed and dried Gugija extracts showed a maximum at 23.95% under extraction conditions of 2.39 h at 1.88% ethanol. Brown color intensity of Gugija extracts (70 times dilution) showed a maximum at 0.59 (OD in 420 nm) under extraction conditions of 4.99 h at 35.62% ethanol. Flavonoid content showed a maximum at 3,802 μg/
100 g under extraction conditions of 4.99 h at 44.41% ethanol. DPPH radical scavenging activity of Gugija extracts (140 times dilution) showed a maximum at 92.99% under extraction conditions of 3.35 h at 30.18% ethanol. ABTS radical scavenging activity of Gugija extracts (20 times dilution) showed a maximum at 34.25% under extraction conditions of 4.82 h at 23.45% ethanol. Optimum extraction conditions obtained by superimposing the contour maps with regard to brown color intensity, flavonoid content, and DPPH and ABTS radical scavenging activities of steamed and dried Gugija were 4.5∼4.8 h at 28∼32% ethanol.
Key words: steamed and dried Gugija (Lycium chinensis Mill), antioxidative activity, browning compounds, flavonoids, optimum extraction
Received 23 August 2017; Accepted 18 October 2017
Corresponding author: Gee-Dong Lee, Division of Integrated Bio- technology, Joongbu University, Chungnam 32713, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-41-750-6291
서 론
청양지역은 구기자 재배를 위한 지리적, 기후적 환경이 매우 양호할 뿐 아니라, 생산기술과 생산량 부문에서 전국 최고의 경쟁력을 가지고 있다. 그러나 청양에서 가공되고 있는 상품 중에 구기자를 주원료로 사용하는 경우는 차, 술 및 추출액 정도이고 그 이외에는 한과, 떡, 약과, 고추장, 쌈장 등이 있으며, 대부분 구기자를 보조 원료로 사용하기 때문에 구기자 사용량이 1%에도 미치지 못하고 있다(1).
구기자는 건조되어 한약재로 많이 사용됐으나, 최근에는 다양하게 가공되어 건강식품으로 즐겨 사용되고 있다. 요구 르트에 구기자를 첨가하여 구기자 요구르트(2,3)가 개발되 었으며, 구기자에 둥굴레와 어성초를 혼합하여 한방기능성 음료(4), 전통차류(5) 등이 개발되고 있다. 또한, 구기자를 이용한 구기자 탁주(6)와 구기자 맥주(7,8)가 제조되어 항산
화 효과, ACE 저해 활성 등 발효제품의 기능성이 다양하게 연구되고 있다.
구기자는 조리의 건강 기능성 재료로도 많이 사용하고 있 는데, 구기자 증편(9), 녹두묵(10) 등이 만들어져 어르신의 건강용 간식으로 활용되고 있으며, 구기자를 이용하여 구기 자 수프, 구기자 샐러드, 구기자 비프스테이크, 구기자 아이 스크림 등 다양한 양식메뉴(11)와 구기자 연어스테이크, 구 기자 파이, 구기자 국수 등 건강용 웰빙 메뉴(12)가 개발되 어 각종 음식에 변화를 주고 있다.
전통적으로 한약재를 오래 저장하기 위해 발전되어 온 찌 고 말리는 증포기술은 최근 기호성과 기능성을 높이기 위해 많이 사용하고 있다. 대표적인 증포 제품으로는 홍삼, 흑삼, 숙지황, 둥굴레 등을 들 수 있으며, 찌고 말리는 과정을 통해 한약재의 저장 기간을 연장할 수 있어 전통적으로 많이 이용 되어 온 가공방법이나 모든 한방소재를 찌고 말린 것은 아니 다. 천연소재에 열을 처리함으로써 유효성분이 파괴되기도 하고 기능성 성분이 생성되기도 한다. 도라지는 열처리에 의해 색상의 변화가 크지 않으나 건조도라지를 threonine과 sucrose 혼합용액에 침지하여 threonine과 sucrose를 흡
Table 1. Experimental data on yield, brown color intensity, flavonoids, and DPPH and ABTS radical scavenging activities of the steamed and dried Gugija (Lycium chinensis Mill) under different conditions based on central composite design for response surface analysis
Exp.
No.1)
Extraction conditions
Yield (%)
Brown color intensity (OD
at 420 nm)3)
Flavonoids (μg/100 g)
DPPH radical scavenging activity (%)4)
ABTS radical scavenging activity (%)5) Ethanol con.
(%) Extraction time (h) 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10
60 (1) 60 (1) 20 (−1) 20 (−1) 40 (0) 40 (0) 80 (2) 0 (−2) 40 (0) 40 (0)
4 (1) 2 (−1) 4 (1) 2 (−1) 3 (0) 3 (0) 3 (0) 3 (0) 5 (2) 1 (−2)
21.652) 21.65 23.40 23.55 22.75 22.80 20.75 23.85 22.75 22.90
0.515 0.456 0.539 0.526 0.539 0.533 0.221 0.463 0.577 0.555
3,660 3,166 2,608 1,699 3,426 3,439 2,712 2,009 3,919 2,244
83.4 81.9 89.1 88.2 92.4 91.5 58.4 82.4 89.5 88.0
27.93 30.69 30.56 28.51 30.46 29.55 15.74 28.84 32.28 31.15
1)The number of experimental conditions by central composite design.
2)Data were expressed as mean of triplicate determinations.
3)Brown color intensity is optical density (OD at 420 nm) of 70 times dilution extracts.
4)DPPH radical scavenging activity is electron donating ability (%) of 140 times dilution extracts.
5)ABTS radical scavenging activity is radical scavenging activity (%) of 20 times dilution extracts.
습시킨 후 열처리를 하면 갈변되면서 구수한 갈색 물질들이 생성되어 향과 맛이 증가한다(13). 그리고 인삼에도 같은 방법으로 threonine과 sucrose를 흡습시켜 가열처리를 하 면 갈변 물질이 생성되어 갈색도가 급격히 증가하고 향미 또 한 증가한다(14). 이러한 현상은 당과 아미노산의 Maillard 반응을 통해 다양한 갈변 물질이 발현되기 때문이다. 홍삼은 찌고 말리는 과정을 1, 2회 반복한 후 완전 건조하여 제조되 며, 제조된 홍삼은 수삼에 들어 있던 당과 아미노산이 반응 하고 갈변 물질이 많이 발현되어 붉은 적갈색을 띠게 되며 관능적 향미도 우수하고 기능성도 백삼보다 상대적으로 우 수한 것으로 알려져 있다(15-17). 그에 비해 흑삼은 찌고 말리는 과정을 9회나 반복한 후 완전 건조한 것으로 찌고 말리는 과정이 반복됨에 따라 흑삼의 기능성 및 관능적 특성 이 많이 변화된다. 흑삼의 제조과정 중 찌고 말리는 반복 횟수에 따라 색상은 밝은 색에서 붉은색으로 홍삼화 되었다 가 점차 담흑갈색 또는 흑다갈색으로 변화해 간다(18). 찌고 말리는 과정을 반복함에 따라 색상만 변해 가는 것이 아니 라, 인삼의 가장 유용한 기능성 성분인 진세노사이드의 함량 도 점차 변하여 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Re, Rg1 등은 급격하게 줄어들고 항암 활성, 항당뇨 활성, 항건망증 효과 등 다양한 약리효능을 발휘하는 Rg3, Rk1 등은 점차 증가한 다(18). 그리고 흑삼의 증포횟수가 증가함에 따라 50% 에탄 올로 추출한 추출물의 갈색도가 크게 증가하고, 비례적으로 DPPH, hydroxy 및 ABTS 라디칼 소거능 또한 증가하여 증포횟수가 증가함에 따라 항산화성이 크게 증가하는 것으 로 밝혀지고 있다(19).
따라서 본 연구에서는 청양군에서 많이 생산 및 판매되는 증포 구기자의 항산화 성분과 항산화 효과를 모니터링 함으 로써 구기자를 찌고 말리는 과정에서 생기는 가용성 항산화 성분과 그 효과를 증대시키고자 하였으며, 반응표면분석을 통해 구기자 항산화 성분 및 그 효과를 최적화함으로써 증포
구기자의 최적 추출조건을 설정하고자 하였다.
재료 및 방법
실험재료 및 시약
본 실험에 사용된 구기자(Lycium chinensis Mill)는 청양 군 청양구기자농협에서 증포한 구기자(100°C에서 30분간 증자 후 상온에서 2시간 동안 말리는 과정을 4회 반복한 다음 50°C에서 수분 14% 이하로 건조한 구기자)를 구입하 여 시료로 사용하였다. 구기자의 전처리는 증포 구기자를 분쇄기(Samsung Pharmaceutical Machine, Seoul, Korea) 로 마쇄하여 20~40메쉬 분말을 추출 시료로 사용하였다.
그 외 시약은 aluminum chloride(Sigma-Aldrich Co., St.
Louis, MO, USA), naringin(Sigma-Aldrich Co.), DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich Co.), absolute ethanol(Samchun Chemical, Seoul, Korea), ABTS(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sul- fonic acid), Sigma-Aldrich Co.) 및 potassium persul- fate(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다.
실험계획 및 반응표면분석
증포 구기자의 추출조건에 따른 플라보노이드, 갈변 물질 등 항산화 성분과 DPPH, ABTS 라디칼 소거능 등 항산화성 의 변화를 모니터링 하고자 하였으며, 실험계획은 중심합성 계획법(20)에 의하여 설계하였고 반응표면 회귀분석을 위 해서는 SAS program(Statistical Analysis System, ver.
9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 사용하였다.
중심합성 실험계획에 따라 증포 구기자의 추출 용매로서 에탄올의 농도(0, 20, 40, 60, 80%) 및 추출시간(1, 2, 3, 4, 5 h)은 -2, -1, 0, 1, 2 다섯 단계로 부호화하였으며, 실험 계획은 Table 1에 나타내었다. 종속변수로는 수율, 갈색도,
Table 2. Polynomial equations and lack-of-fit calculated by RSM program for the steamed and dried Gugija
Responses Polynomial equations1) R2 Significance Pr>F Yield
Brown color intensity Flavonoids
DPPH radical scavenging activity ABTS radical
scavenging activity
YYield＝24.429613−0.024435X1−0.233036X2＋0.001875X1X2– 0.000278X12＋0.020089X22
YBrown color intensity＝0.540833＋0.005767X1−0.052333X2＋ 0.000575X1X2−0.000124X12＋0.0065X22
YFlavonoids＝−789.345238＋81.32381X1＋1004.2976X2−5.1875X1X2
−0.617589X12−66.785714X22
YDPPH＝74.125893＋0.801964X1＋4.125595X2＋0.0075X1X2− 0.013431X12−0.684821X22
YABTS＝22.648542＋0.468208X1＋0.362917X2−0.060125X1X2− 0.004986X12＋0.361875X22
0.9909 0.9521 0.8494 0.9717 0.8510
0.0004 0.0096 0.0847 0.0034 0.0831
0.1613 0.0802 0.0134 0.1617 0.1503
1)X1: ethanol concentration (%), X2: extraction time (h).
플라보노이드, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능으로 하였으 며, 데이터는 3 반복 분석한 것을 평균하여 나타내었다.
수율 및 갈색도 측정
수율은 증포 구기자 추출용액 10 mL를 항량을 구한 수기 에 취하여 105°C에서 증발 건조한 후 그 무게를 측정하였으 며, 추출액 조제에 사용된 건물 시료량에 대한 백분율로써 고형분 함량을 나타내었다.
갈색도를 측정하기 위한 증포 구기자 추출물은 증포 구기 자 시료 대비 70배 추출 및 희석하여 갈색도 측정용 시험용 액으로 사용하였다. 갈색도의 측정은 분광광도계(UV-spec- trophotometer UV1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용 하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량은 aluminium chloride 비색법(21) 을 이용하여 정량하였다. 분석 시료는 증포 구기자 시료 대비 70배 추출 및 희석한 시험용액 0.5 mL, 95% ethanol 1.5 mL, 10% aluminum chloride 0.1 mL, 1 M NaOH 1 mL 및 deionized water(DW) 2.8 mL를 혼합하여 상온에서 30 분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질의 제조는 naringin을 methanol에 용해하여 100 mg/
100 mL로 만든 후 DW로 희석하여 검량곡선을 작성 후 시 료 100 g 중 μg naringin으로 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거능 측정
중심합성계획에 의한 증포 구기자 추출물의 항산화성은 DPPH를 이용한 방법(22)으로 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능 측정을 위한 DPPH 용액은 DPPH 시약 16 mg을 100 mL absolute ethanol에 용해한 후 증류수 100 mL로 정용, 여과하여 DPPH 용액으로 사용하였으며, DPPH 용액 1.6 mL에 증포 구기자 시료 대비 140배 추출 및 희석된 시험용액 0.4 mL를 가하여 vortex mixer로 10초간 혼합하 여 10분간 방치(암실)한 후 528 nm에서 흡광도를 측정하였 다. DPPH 라디칼 소거능은 시료첨가구와 무첨가구(시료 대 신 증류수 0.4 mL)의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거능(%)={1－(A/B)}×100, A: 시료첨가 구의 흡광도, B: 시료무첨가구의 흡광도.
ABTS 라디칼 소거능 측정
증포 구기자 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 ABTS radical cation decolorization assay(23)를 이용하여 측정 하였다. 7.4 mM ABTS 용액과 2.6 mM potassium persul- fate를 혼합하여 실온의 암소에서 하루 동안 방치하여 양이 온(ABTS･+)을 형성시킨 다음, phosphate buffered sal- ine(PBS, pH 7.4)으로 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 1.0 이하가 되도록 하였다. 희석된 ABTS･+ 용액 150 μL와 증포 구기자 시료 대비 20배 추출 및 희석된 시험용액을 각각 5 μL씩 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능(%)은 다음 식으로 구하였다. ABTS 라디칼 소거능(%)={1－(A/
B)}×100, A: 시료첨가구의 흡광도, B: 시료무첨가구의 흡 광도.
결과 및 고찰
수율의 변화
구기자는 분말이나 건조 구기자로 많이 사용됐으나, 최근 구기자를 기능성 원료로 사용하고자 하는 경향이 증가하고 있다. 본 연구에서는 구기자의 저장 및 가공 적성과 기능성 을 향상하고자 찌고 말리는 과정을 4번 반복한 증포 구기자 의 추출 수율을 최적화하였다.
먼저 증포 구기자의 추출에 따른 수율의 변화를 관찰한 결과, 에탄올 농도 및 추출시간의 변화에 따른 수율의 변화 는 20.75~23.85%의 차이를 나타내었다(Table 1). 이를 회 귀분석한 결과 수율에 대한 모델식의 R2는 0.9909로 1%
이내 유의수준에서 유의성이 있었다(Table 2). 적합성 결여 검정(lack-of-fit test)에서 유의확률 Pr>F의 값이 0.1613 으로 0.05보다 큰 값이 얻어졌으므로 수율에 대한 회귀모델 은 독립변수의 변동에 따른 수율 변동을 적합하게 설명하고 있었다(Table 2).
증포 구기자의 추출에 따른 수율의 변화는 에탄올 농도가
Fig. 1. Response surface for yield of the steamed and dried Gugija as a function of extraction ethanol concentration and time.
Table 3. Regression analysis for regression model of yield, brown color intensity, flavonoids, and DPPH and ABTS radical scavenging activities of the steamed and dried Gugija
Regression model F-value
Ethanol con. Extraction time YYield
YBrown color
YFlavonoids
YDPPH
YABTS
142.78***
20.30***
4.11 41.56***
5.90*
0.50 0.69 3.51 0.48 0.37
*Significant at 10% level, ***Significant at 1% level.
Table 4. Estimated levels of optimum extraction conditions for antioxidant and antioxidative activity of the steamed and dried Gugija Responses
Extraction conditions
Estimated responses
Morphology Ethanol con. (%) Extraction time (h)
Max. Min. Max. Min. Max. Min.
Yield (%)
Brown color intensity (OD at 420 nm) Flavonoids (μg/100 g)
DPPH radical scavenging activity (%) ABTS radical scavenging activity (%)
1.88 35.62 44.41 30.18 23.45
79.98 79.92 4.89 79.98 79.32
2.39 4.99 4.99 3.35 4.82
2.94 2.76 2.04 2.95 3.37
23.95 0.59 3,802.86
92.99 34.25
20.63 0.25 1,313.89
60.32 17.68
Saddle point Saddle point Maximum Maximum Saddle point 증가할수록 비례적으로 감소하는 경향을 나타내었으나, 추
출시간의 변화에 따른 수율의 변화는 거의 없었다(Fig. 1).
이러한 현상은 에탄올 농도가 증가할수록 증포 구기자의 가 용성 성분인 당, 아미노산 등의 용해도가 낮아진 것으로 여 겨진다. 추출 변수인 에탄올 농도와 추출시간이 추출 수율의 변화에 미치는 영향을 알아보고자 회귀분석을 통해 F값을 구해본 결과(Table 3), 에탄올 농도의 영향이 아주 높게 나 타나 F값이 142로 1%의 유의수준에서 유의성이 인정되었 으나 추출시간의 영향은 낮게 나타났다.
증포 구기자 수율의 변화에 대한 반응표면은 안장점 (saddle point)의 형태를 나타내었으며, 최소의 수율은 에탄 올 농도 79.98% 및 추출시간 2.94 h에서 20.63%를 나타내 었다. 그러나 최대의 수율은 에탄올 농도 1.88% 및 추출시
간 2.39 h에서 23.95%를 나타내었다(Table 4). 최소의 추 출 수율과 최대의 추출 수율의 차이가 적어 추출조건에 따른 추출 수율의 변화는 크지 않는 것으로 나타났다. Lee(24)는 건조 구기자의 추출에 따른 수율이 20.2∼23.5%로 보고하 여 증포 구기자와 유사하였다.
갈색도의 변화
증포 구기자의 추출에 따른 갈색도의 변화를 관찰한 결 과, 에탄올 농도 및 추출시간의 변화에 따른 갈색도의 변화 는 증포 구기자 시료 70배 희석액의 흡광도가 0.22~0.58 (420 nm에서 흡광도)로 많은 차이를 나타내었다(Table 1).
이를 회귀분석한 결과 갈색도에 대한 모델식의 R2는 0.9521 로 1% 이내 유의수준에서 유의성이 인정되었다(Table 2).
적합성 결여 검정에서 유의확률 Pr>F의 값이 0.082로 0.05 보다 큰 값이 얻어졌으므로 갈색도에 대한 회귀모델은 독립 변수의 변동에 따른 갈색도 변동을 적합하게 설명하고 있었 다(Table 2).
증포 구기자의 추출에 따른 갈색도의 변화는 에탄올 농도 35%까지는 에탄올 농도가 증가할수록 다소 증가하였으나, 에탄올 농도 35% 이상에서는 에탄올 농도가 증가할수록 급 격히 감소하였다. 이러한 현상은 35% 이하의 저농도에서는 갈변 물질이 잘 추출되었으나 35% 이상에서는 갈변 물질의 용해도가 상대적으로 감소하여 추출률이 떨어지는 것으로 여겨진다. 추출시간의 변화에 따른 수율의 변화는 크지 않았 으나 추출시간이 증가할수록 다소 증가하는 경향을 나타내 었다(Fig. 2). 추출 변수인 에탄올 농도와 추출시간이 갈색 도에 미치는 영향을 알아보고자 회귀분석을 통해 F값을 구 해본 결과(Table 3), 에탄올 농도의 영향이 아주 높게 나타 나 F값이 20.30으로 1%의 유의수준에서 유의성이 인정되 었으나 추출시간의 영향은 낮게 나타났다.
증포 구기자의 갈색도에 대한 반응표면 형태는 안장점을 나타내었으며, 최소의 갈색도는 에탄올 농도 79.92% 및 추 출시간 2.76 h에서 0.25(420 nm에서 흡광도)를 나타내었 다. 그러나 최대의 갈색도는 에탄올 농도 35.62% 및 추출시 간 4.99 h에서 0.59(420 nm에서 흡광도)를 나타내었다 (Table 4). 찌고 말리는 과정에서 형성된 갈변 물질은 주로 Maillard 반응에 의해 형성된 멜라노이딘으로 고농도의 에 탄올 용액에 잘 용해되지 않는다. Lee(25)는 건조 구기자 추출 시 에탄올 농도가 증가할수록 갈색도가 증가한다고 하
Fig. 2. Response surface for brown color intensity of the steamed and dried Gugija as a function of extraction ethanol concen- tration and time.
Fig. 3. Response surface for flavonoid contents of the steamed and dried Gugija as a function of extraction ethanol concen- tration and time.
였는데, 건조 구기자의 갈색도 측정치를 높이는 물질은 Mail- lard 반응으로 형성된 멜라노이딘이 아니라 구기자 고유의 천연색소가 대부분이라고 하였다. 따라서 증포 구기자 추출 액은 증포 구기자 시료의 70배 희석된 추출액으로서 건조 구기자에는 없는 갈변 색소가 많이 생성되어 아주 높은 갈색 도를 나타낸 것으로 여겨진다.
플라보노이드의 변화
증포 구기자의 추출에 따른 총 플라보노이드 함량의 변화 를 관찰한 결과, 플라보노이드의 함량이 시료 100 g당 1,699
~3,919 μg으로 에탄올 농도와 추출시간의 변화에 따라 큰 차이를 나타내었다(Table 1). 이를 회귀분석한 결과 플라보 노이드의 R2는 각각 0.8494로 10% 이내 유의수준에서 유의 성이 있었다(Table 2). 적합성 결여 검정에서 유의확률 Pr>
F의 값이 0.0134로 0.01보다 큰 값이 얻어졌으므로 플라보 노이드에 대한 회귀모델은 유의수준 1% 이내에서 독립변수 의 변동에 따른 플라보노이드 변동을 적합하게 설명하고 있 었다(Table 2).
증포 구기자의 플라보노이드 함량은 에탄올 농도 45%까 지는 에탄올 농도가 증가할수록 증가하는 경향을 나타내었 으나 45% 이상의 높은 에탄올 농도에서는 다소 감소하는 경향을 나타내었으며, 추출시간이 증가할수록 비례적으로 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 3). 증포 구기자에 함유된 플라보노이드는 30~60% 에탄올 농도에서 잘 용해되는 성 분이 많은 것으로 여겨진다. Jin 등(26)은 와송 추출물에 함 유된 플라보노이드는 70% 에탄올로 추출할 때 잘 추출되었 다고 보고하여 증포 구기자와는 다소 차이를 보였다. 에탄올 농도와 추출시간이 플라보노이드의 변화에 미치는 영향을 알아보고자 회귀분석을 통해 F값을 구해본 결과(Table 3), 에탄올 농도와 추출시간이 비슷하게 나타났으나 모두 유의 성이 인정되지 않았다.
증포 구기자의 플라보노이드에 대한 반응표면 형태는 최 대점을 나타내었으며(Table 4), 최소의 플라보노이드 함량
은 에탄올 농도 4.89% 및 추출시간 2.04 h에서 1,313 μg/
100 g을 나타내었다. 그러나 최대의 플라보노이드의 함량 은 에탄올 농도 44.41% 및 추출시간 4.99 h에서 3,802 μg/
100 g을 나타내었다(Table 4). 증포 구기자의 플라보노이 드 추출을 위해서는 45%의 에탄올로 5시간 정도 추출하는 것이 더 많은 플라보노이드를 얻을 수 있는 것으로 여겨진 다. Lee(24)는 건조 구기자의 추출에 따른 플라보노이드 추 출 수율이 최대 3,100 μg으로 나타났다고 보고하여 증포 구기자 플라보노이드 추출 수율과 큰 차이를 보이지 않았지 만, 증포 구기자가 상대적으로 더 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
DPPH 라디칼 소거능의 변화
증포 구기자의 추출에 따른 DPPH 라디칼 소거능 변화를 관찰한 결과, 증포 구기자 시료 대비 70배 희석된 추출액의 DPPH 라디칼 소거능이 58.4~92.4%로 에탄올 농도와 추출 시간에 따라 다소 차이를 나타내었다(Table 1). 이를 회귀분 석한 결과 DPPH 라디칼 소거능의 R2는 0.9717로 1% 이내 유의수준에서 유의성이 있었다(Table 2). 적합성 결여 검정 에서 유의확률 Pr>F의 값이 0.1617로 0.05보다 큰 값이 얻어졌으므로 DPPH 라디칼 소거능에 대한 회귀모델은 독 립변수의 변동에 따른 DPPH 라디칼 소거능 변동을 적합하 게 설명하고 있었다(Table 2).
증포 구기자의 DPPH 라디칼 소거능의 변화는 플라보노 이드의 반응표면보다는 갈색도의 반응표면과 더 유사한 반 응표면 패턴을 나타내었다.
증포 구기자의 DPPH 라디칼 소거능은 에탄올 농도 30%
까지는 에탄올 농도가 증가할수록 비례적으로 증가하는 경 향을 나타내었으나, 에탄올 농도 30% 이상에서는 에탄올 농도가 증가할수록 급격히 감소하는 경향을 나타내었다. 그 러나 추출시간의 변화에 따른 DPPH 라디칼 소거능의 변화 는 거의 없었다(Fig. 4). 이러한 경향은 DPPH 라디칼 소거 능이 구기자 고유의 플라보노이드보다 증포 구기자의 찌고
Fig. 4. Response surface for DPPH radical scavenging activity of the steamed and dried Gugija as a function of extraction etha- nol concentration and time.
Fig. 5. Response surface for ABTS radical scavenging activity of the steamed and dried Gugija as a function of extraction etha- nol concentration and time.
말리는 과정을 통해 발현된 갈변 물질에 의해 나타나는 것으 로 여겨진다. 에탄올 농도와 추출시간이 DPPH 라디칼 소거 능 변화에 미치는 영향을 알아보고자 회귀분석을 통해 F값 을 구해본 결과(Table 3), 에탄올 농도의 영향이 상대적으로 높게 나타나 F값이 41.56으로 1%의 유의수준에서 유의성 이 인정되었으나 추출시간의 영향은 낮게 나타나 유의성이 인정되지 않았다.
증포 구기자의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 반응표면은 최대점의 형태를 나타내었으며(Table 4), 최소의 DPPH 라 디칼 소거능은 에탄올 농도 79.98% 및 추출시간 2.95 h에 서 60.32%를 나타내었다. 그러나 최대의 DPPH 라디칼 소 거능은 에탄올 농도 30.18% 및 추출시간 3.35 h에서 92.99
%를 나타내었다(Table 4). DPPH 라디칼 소거능은 상대적 으로 높게 나타났으며 증포 구기자 시료 대비 140배 희석된 추출액의 DPPH 라디칼 소거능임을 고려한다면 아주 높은 항산화 효과를 나타내었음을 알 수 있다. Lee(24)는 건조 구기자의 추출에 따른 최대 DPPH 라디칼 소거능이 96.93%
로 높게 나타났지만 건조 구기자 시료 대비 16배 희석된 추출물을 사용하였으나, 본 연구에서는 증포 구기자 시료 대비 140배 희석된 추출을 사용하였으므로 건조 구기자보 다 8배 이상의 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸다고 볼 수 있다. 이러한 변화는 구기자에 함유된 플라보노이드의 효과에 더하여 구기자를 찌고 말리는 과정에서 발현된 갈변 색소의 DPPH 라디칼 소거능이 훨씬 더 많이 나타난 것으로 여겨진다. 인삼을 찌고 말리는 과정을 9번 반복하면 흑삼이 만들어지는데, Kim 등(19)은 흑삼의 찌고 말리는 과정을 반 복함에 따라 갈색도의 증가와 비례적으로 DPPH 라디칼 소 거능이 증가한다고 보고하여 증포 구기자와 유사하였다.
ABTS 라디칼 소거능의 변화
증포 구기자의 추출에 따른 ABTS 라디칼 소거능 변화를 관찰한 결과, 시료 대비 20배 희석된 추출액의 ABTS 라디
칼 소거능이 15.74∼32.28%로 에탄올 농도와 추출시간에 따라 다소 차이를 나타내었다(Table 1). 이를 회귀분석한 결과 ABTS 라디칼 소거능의 R2는 각각 0.8510으로 10%
이내 유의수준에서 유의성이 인정되었다(Table 2). 적합성 결여 검정에서 유의확률 Pr>F의 값이 0.1503으로 0.05보 다 큰 값이 얻어졌으므로 ABTS 라디칼 소거능에 대한 회귀 모델은 에탄올 농도, 추출시간 등 독립변수의 변동에 따른 ABTS 라디칼 소거능 변동을 적합하게 설명하고 있었다 (Table 2).
증포 구기자의 ABTS 라디칼 소거능 변화는 갈색도와 유 사한 반응표면을 나타내었다. 에탄올 농도 23.5%까지는 에 탄올 농도가 증가할수록 비례적으로 증가하는 경향을 나타 내었으나, 에탄올 농도 23.5% 이상에서는 에탄올 농도가 증가할수록 서서히 감소하는 경향을 나타내었다. 그러나 추 출시간의 변화에 따른 ABTS 라디칼 소거능의 변화는 에탄 올 농도 23.5%까지는 추출시간이 증가할수록 비례적으로 증가하였으나, 에탄올 농도 23.5% 이상에서는 에탄올 농도 가 증가할수록 상대적으로 감소하였다(Fig. 5). 에탄올 농도 와 추출시간이 ABTS 라디칼 소거능 변화에 미치는 영향을 알아보고자 회귀분석을 통해 F값을 구해본 결과(Table 3), 에탄올 농도의 영향이 상대적으로 높게 나타나 F값이 5.90 으로 10%의 유의수준에서 유의성이 인정되었으나 추출시 간의 영향은 낮게 나타났다.
증포 구기자의 ABTS 라디칼 소거능에 대한 반응표면은 안장점의 형태를 나타내었으며, 최소의 ABTS 라디칼 소거 능은 에탄올 농도 76.32% 및 추출시간 3.37 h에서 17.68%
를 나타내었다. 그러나 최대의 ABTS 라디칼 소거능은 에탄 올 농도 23.45% 및 추출시간 4.82 h에서 34.25%를 나타내 었다(Table 4). ABTS 라디칼 소거능이 DPPH 라디칼 소거 능에 비해 상대적으로 낮게 나타났지만, 시료 대비 20배 희 석된 추출액의 ABTS 라디칼 소거능임을 고려한다면 적지 않은 항산화 효과를 확인할 수 있다. Lee(25)는 건조 구기자 의 추출에 따른 최대 ABTS 라디칼 소거능이 13%로 나타나
Fig. 6. Superimposed contour map for brown color intensity, flavonoids, and DPPH and ABTS radical scavenging activities of the steamed and dried Gugija as a function of extraction ethanol concentration and time.
증포 구기자의 라디칼 소거능보다 다소 낮은 소거능을 보였 으나, 증포 구기자와 건조 구기자의 반응표면 또한 유사한 구조를 그리고 있었다. 이처럼 건조 구기자와 증포 구기자의 ABTS 라디칼 소거능 차이가 거의 없고 반응표면이 유사한 것은 DPPH 라디칼 소거능에서와는 달리 ABTS 라디칼 소 거능이 찌고 말리는 과정에서 발현된 갈변 색소의 영향이 크게 미치지 못한 것으로 여겨진다. Kim 등(19)은 흑삼의 찌고 말리는 과정에 DPPH 라디칼 소거능이 4배나 증가하 나 ABTS 라디칼 소거능은 30% 정도 증가하여 증포 구기자 와 유사한 결과를 보고하였다.
따라서 항산화 성분과 항산화 효과가 우수한 최적 추출조 건을 얻고자 갈색도, 플라보노이드, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능에 대한 등고선도를 겹쳐 그려 최적 조건을 설정해 보았다(Fig. 6). 각각의 등고선도에서 항산화 성분 및 라디 칼 소거능이 가장 높은 등고선은 갈색도 0.57(420 nm에서 의 OD), 플라보노이드 3,621 μg/100 g, DPPH 라디칼 소거 능 91% 및 ABTS 라디칼 소거능 31%로 나타났으며, 이러 한 등고선을 겹쳐 그렸을 때 모두 만족하는 최적 추출조건의 범위는 Fig. 6의 어두운 부분으로 28~32% 에탄올 농도에서 4.5~4.8 h 추출하는 것으로 설정되었다.
이와 같이 증포 구기자의 추출특성을 모니터링 해 본 결 과, 가공한 증포 구기자는 건조 구기자보다 항산화 성분이 많이 추출되었고 그 효과도 아주 높게 나타났으며, 추출조건 에 따라 항산화 성분과 그 효과가 달리 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 반응표면분석을 통한 최적 추출조건으로 추출할 경우에는 증포하지 않은 구기자에 비교해 그 효과가 월등히 증가하는 것을 볼 수 있었는데, 구기자의 가공 및 추출 방법을 개선함으로써 건강 기능성이 우수한 구기자 가 공제품을 생산할 수 있을 것으로 여겨진다.
요 약
찌고 말리는 과정을 4번 반복한 증포 구기자의 항산화 성분 추출을 최적화하고자 반응표면분석을 하였으며, 추출을 위
한 조건변수는 에탄올 농도(X1, 0~80%) 및 추출시간(X2, 1~5 h)이고, 반응변수로는 수율, 갈색도, 플라보노이드, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능으로 설정하였다. 수율, 갈색 도, DPPH 라디칼 소거능에 대한 회귀식의 R2는 각각 0.9909, 0.9521, 0.9717로 1%의 유의수준에서 유의성이 인정되었으며, 플라보노이드 및 ABTS 라디칼 소거능은 0.8494 및 0.8510으로 10%의 유의수준에서 유의성이 인정 되었다. 증포 구기자의 수율이 가장 높은 추출조건은 에탄올 농도 1.88%에서 2.39 h 추출하는 것(23.95%)으로 나타났 다. 갈색도와 플라보노이드 함량이 가장 높은 추출조건은 에탄올 농도 35.62%에서 4.99 h 추출한 것(0.59, 흡광도)과 에탄올 농도 44.41%에서 4.99 h 추출한 것(3,802 μg/100 g)으로 각각 나타났다. DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디 칼 소거능이 가장 높은 추출조건은 에탄올 농도 30.18%에 서 3.35 h 추출한 후 140배 희석한 것(92.99%)과 에탄올 농도 23.45%에서 4.82 h 추출한 후 20배 희석한 것(34.25
%)으로 각각 나타났다. 갈색도, 플라보노이드 함량, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능에 대한 등고선도를 겹쳐 그려 얻은 최적 조건은 에탄올 농도 28~32%에서 4.5~4.8 h 추출하는 것으로 설정되었다.
감사의 글
이 논문은 2016년 (재)청양군부자농촌지원센터 지원에 의 하여 수행된 것으로 이에 감사를 드립니다.
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