Nationwide survey of Turnip mosaic virus and selection of cabbage lines with resistance against major TuMV isolates

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OPEN ACCESS

Citation: Chung JS, Han JY, Kim JK,Ju HK,Gong JS, Seo EY, Choi SR, Lim YP, Hammond J, Lim HS. 2016. Nationwide survey of Turnip mosaic virus and selection of cabbage lines with resistance against major TuMV isolates. Korean Journal of Agricultural Science 43:567-574.

DOI: http://dx.doi.org/10.7744/kjoas.20160058 Editor: Chang-Gi Kim, KRIBB, Korea Received: October 24, 2016 Revised: October 24, 2016 Accepted: November 28, 2016 Copyright: ©2016 Korean Journal of Agricultural Science.

This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non- Commercial License which permits unrestricted non- commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

PLANT & FOREST

Nationwide survey of Turnip mosaic virus and selection of cabbage lines with resistance against major TuMV isolates

Jinsoo Chung

¹

, Jae-yeong Han

¹

, Jungkyu Kim

¹

, Hyekyoung Ju

¹

, Junsu Gong

¹

, Eun-young Seo

¹

, Su Ryun Choi

²

, Yong Pyo Lim

²

, John Hammond

³

, Hyoun-Sub Lim

¹

*

1

Department of Applied Biology, College of Agriculture and Life Sciences, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea

2

Department of Horticulture, College of Agriculture and Life Sciences, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea

3

United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service, Floral and Nursery Plants Research Unit, Beltsville, Maryland 20705, USA

*Corresponding author: [email protected]

Abstract

This survey was conducted in 2015, following up on theed tthe occurrence of Turnip mosaic virus (TuMV) nationwide in radish and Chinese cabbage fields of 28 cities in South Korea. A total of 152 samples of Raphanus sativus and 29 samples of Brassica rapa, showing virus-like symptoms, were collected. Among these, 107 B. rapa samples and 9 B. rapa samples were positive for TuMV when analyzed by RT-PCR. The TuMV strains found in the two crops showed 99% homology in nucleotide and amino acid sequences of coat protein to each other.

Furthermore, their sequences showed 99% homology to the sequences of TuMV isolates R007 (GenBank: KU140420) and R041 (GenBank: KU140421) that were collected in 2014.

These results suggested TuMV isolated from radish and cabbage in 2015 were the same strain as the isolates R007 and R041 collected in 2014. A screening test was conducted using these two isolates to select TuMV-resistant B. rapa lines out of 167 B. rapa breeding lines.and identified eight lines resistant to R007 (Kenshin, 279002, 279012, 279064, 279081, MP, C-21, HKC-004) and nine lines resistant to R041 (C-26, HKC-005, 11Su-4, 11Su-5, 11Su-7, 11Su-8, Tian Jin Lv Qing Ma Ye, CNU_141193, Jing Lv 60). Our prior data indicated 4.24% difference in sequences between the two isolates and these can serve as potential tools to develop B.

rapa markers to screen for resistance against TuMV strainsin breeding populations.

Keywords: cabbage, cabbage field, radish field, Turnip mosaic virus

Introduction

우리나라에서 주로 재배되는 십자화과 작물인 배추(Brassica rapa)는 유럽 또는 중국이 원산지

로(Yu et al., 2010), 우리나라 식생활에서 다양하게 이용되고 있는데, 특히 배추김치의 주재료로

써 사용되고 있기 때문에 우리나라 전체 채소 생산량 대비 25% 내외를 차지하고 있는 대표 채소

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이다(Ku et al., 2006; Lee et al., 2014). 또한 종자 자급률은 거의 100%로 배추 종자 육종에서 세계 최고수준의 기술을 가지고 있다(Hong et al., 2011). 2014년도 우리나라의 배추 재배면적은 32,027 ha, 생산량은 2,538천 톤이었다. 배추 는 4계절 모두 생산되는데 전체 생산량 중에서 대부분인 67%의 배추가 가을에 재배되며 봄 14%, 겨울 12%, 고랭지 배추 재배는 7% 정도 재배 되고 있다(Lee et al., 2016). 2014년도 충청남도 배추재배지에서 25과 71종 이상의 다양한 잡초의 발생이 보고되었으며(Hwang et al., 2014), 1994년부터 1997년까지 강원도 고랭지 지역 배추(B. rapa)에 발생 하는 병해조사 결과 세균병인 부패병(Erwinia carotovora), 균핵병(Sclerotinia sclerotiorum), 진균병인 배추뿌리마 름병(Aphanomyces rapani), 노균병(Peronospora brassicae), 흰무늬병(Cercosporella albomaculans), 뿌리혹병 (Plasmodiophora brassicae), 검은무늬병(Alternaria brassicae), 탄저병(Collectotrichum higginsianum), 흰가루병 (Erysiphe polygoni), 밑둥썩음병(Rhizoctonia solani) 바이러스병인 Turnip mosaic virus (TuMV) 그리고 Ca 결핍증 등 다양한 병해가 조사되었다(Hahm et al., 1998; Park et al., 2011). 배추(B. rapa)에 발생하는 바이러스는 대표적으로 Potyvirus속의 Turnip mosaic virus (TuMV) 가 보고되어 있으며, Cucumovirus속 Cucumber mosaic virus (CMV), Comovirus속 Radish mosaic virus (RaMV), Tobamovirus속의 Ribgrass mosaic virus (RMV), Turnip vein clearing virus (TVCV), Chinese rape mosaic virus (CRMV) 등이 보고 되고 있다(Rhee et al., 2011; Komatsu et al., 2007; Kim et al., 2012). 십자화과를 감염시키는 주요 바이러스로 발병률이 가장 높은 TuMV는 Potyviridae과(科, family) Potyvirus속(屬, genus) 바이러스로 전 세계적으로 많은 피해를 주고 있다. 십자화과를 포함한 식용 작물과 잡초 등 300종 이상의 광범위한 기주 범위를 가지고 있다. 89종 이상의 진딧물을 통한 비영속성 전염으로 전파 된다 (Raybould et al., 1999; F. Sa´nchez et al., 2003; Suehiro et al., 2004). TuMV를 전염시키는 복숭아혹진딧물은 감자와 배추 등의 다양한 기주를 가지고 있는데 대관령 지역의 고랭지 씨감자 재배지의 진딧물 분포를 보면 1976 - 2000년 까지 약 5배가 증가하였다. 진딧물의 발생과 강수량은 밀접한 관계가 있어 강수량이 많으면 진딧물의 발생량은 적어 진다고 알려져 있는데 진딧물의 이상 증가가 있던 1994년과 1995년에는 평년에 비해 강수량과 강수일이 적고 평균 기온이 높았던 기후변화때문일 것으로 추측된다. 또한 배추(B. rapa)는 저온성 채소로써 이상 고온이 나타나면 생장 이 정지되고 결구되지 않으며 병충해가 많아질 수 있다(Lee et al., 2008). 이 같은 변화는 진딧물의 증가와 동시에 TuMV의 증가 또한 가져오고 있으며 isolate의 증가로도 연결된다(Kwon et al., 2002). 무(Raphanus sativus)와 B.

rapa를 재배하는 농가 중 소규모의 무(R. sativus)와 배추(B. rapa)포장을 대상으로 도서지역과 강원도를 제외한 전국 에서 세 가지 바이러스의 감염 실태를 조사하였다. 본 조사 결과를 바탕으로 2014 - 2015년도 무(R. sativus)와 배추 (B. rapa) 포장의 바이러스 병 분포현황을 확인할 수 있었다. 이 중 배추(B. rapa)에서 국내 발생이 보고된 바이러스로 는 TuMV, CMV그리고 RMV가 있다(Kim et al., 2010). 2014년도 이전까지 국내에서 무(R. sativus)와 배추(B. rapa) 에 발생하는 바이러스 병 발병을 대상으로 하는 전국 조사는 실시 되지 않았었지만, 2014년도 본 연구자가 전국 조사 를 통해 무(R. sativus)에 발생하는 TuMV, CMV와 RaMV의 발생을 보고한 바가 있다. 2014년도 조사 결과 가장 많이 발생한 바이러스 병은 TuMV로 43.5%, RaMV가 2.7% 그리고 TuMV와 CMV 복합 감염 1.8%로 확인 되었으며 CMV 단독 감염은 발견 되지 않았다(Chung et al., 2015). 본 연구자들은 무(R. sativus)와 배추(B. rapa) 재배 농가에 대해 2014년도에 이어 2015년 TuMV 분포 양상을 조사하였다. 2014년도 무(R. sativus)에 발생한 TuMV 발생 조사 결과를 바탕으로(Chung et al., 2015) 2015년에는 무(R. sativus)와 배추(B. rapa)에 TuMV 발생 및 기주에 따른 TuMV isolate 분포를 확인하고자 하였다. 또한 국내 육종 선별된 배추(B. rapa)라인에 접종하여 병징을 조절하는 바이러스 유전자 선별과 TuMV 저항성 배추(B. rapa) 개발을 위한 기초 자료를 수립하였다.

바이러스병 분포

서울특별시와 강원도를 제외한 대전광역시, 광주광역시, 경기도 광주시, 남양주시, 의정부시, 파주시, 김포시, 안

산시, 수원시, 충청남도 부여군, 아산시 충청북도 보은군, 청주시, 제천시, 충주시, 경상북도 문경시, 상주시, 경상남

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도 밀양시, 함안군, 산청군, 전라남도 나주시, 장성군, 전라북도 익산시, 김제시, 군산시, 구미시, 전주시, 청도군으로 총 28개 시, 군을 대상으로 하였으며 울릉도나 제주도와 같은 도서 지역은 조사에서 제외하였고(Fig. 1). 2015년 11월 한달 간 무(R. sativus)와 배추(B. rapa)에서 바이러스의 발병 조사를 위하여 대규모 생산지가 아닌 소규모로 무(R.

sativus)와 배추(B. rapa)를 재배하는 포장으로 한정하여 전국을 대상으로 조사를 실시하였다. 바이러스 병징이 뚜렷 이 나타나는 무(R. sativus)와 배추(B. rapa)의 잎을 채집하였고 모자이크(mosaic), 위축(dwarf), 괴사(necrosis), 얼룩 (mottle), 황화(yellowing) 등이 대표적인 병징으로 나타난다. TuMV가 감염된 무(R. sativus)에서는 전형적으로 위축 과 모자이크 병징을 나타내며, 배추(B. rapa)에서는 약한 모자이크 병징과 위축이 나타났다(Fig. 2).

Fig. 1. Geographical distribution of radish and cabbage sample collection sites.

Fig. 2. Typical symptoms of radish and Chinese cabbage infected by TuMV. Turnip mosaic virus symptoms of Chinese

cabbage A - C, Turnip mosaic virus symptoms of radish D - F.

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Table 1. Nucleic acid sequence of oligonucleotide primers used in this study.

Virus Primer name Sequence of primer Expected size

(bp) TuMV

^z

TuMV_CP_F

TuMV_CP_R 5`-AAACTGCAGAAGCAGGTGAAACGCTTGAC-3`

5`-AAAGGATCCTCATAACCCCTTAACGCCAA-3` 867

z

Turnip mosaic virus.

Table 2. Location of radish tissue sample collection and RT-PCR results.

Sample No. Localization Host Date TuMV

^z

detected R109, R110, R111, R112, R113, R114, R117,

R118, R119, R120, R121, R122 Daejeon Radish 2015-11-02 •

R115, R116 Daejeon Radish 2015-11-02 •

R127, R128, R129, R130, R131, R132, R133 Buyeo Radish 2015-11-03 •

R137, R141, R142, R144 Bouen Radish 2015-11-06 •

R152, R153, R154, R155, R156, R157, R158 Cheongju Radish 2015-11-06 •

R160, R161, R162, R163 Mungyeong Radish 2015-11-10 •

R164, R165, R166, R167, R168, R169, R170 Sangju Radish 2015-11-10 •

R171, R172, R173 Jecheon Radish 2015-11-12 •

R174, R176, R177 Chungju Radish 2015-11-12 •

R179 Naju Radish 2015-11-18 •

R181, R182, R183, R184, R185 Gwangju Radish 2015-11-18 •

R190, R191, R192, R193, R194, R195, R196 Gwangju, Gyeonggi-do Radish 2015-11-20 • R197, R198, R199, R200, R201 Namyangju Radish 2015-11-20 • R202, R203, R204, R205, R206 Uijeongbu Radish 2015-11-21 •

R207, R208, R209, R210, R211 Paju Radish 2015-11-21 •

R212, R213, R214, R215, R216, R217 Gimpo Radish 2015-11-21 •

R218, R222 Ansan Radish 2015-11-22 •

R225, R228, R229, R230 Suwon Radish 2015-11-22 •

R236, R237, R238 Gimge Radish 2015-11-20 •

R239, R240, R241 Gunsan Radish 2015-11-20 •

R247 Cheongdo Radish 2015-11-21 •

R248, R249 Miryang Radish 2015-11-21 •

R250, R251 Changwon Radish 2015-11-21 •

R252, R253, R254 Haman Radish 2015-11-21 •

R255 Sancheong Radish 2015-11-22 •

R256, R259, R260 Jeonju Radish 2015-11-24 •

CF002 Daejeon Cabbage 2015-11-10 •

CF003, CF004, CF005, CF006 Sangju Cabbage 2015-11-10 •

CF007, CF008 Asan Cabbage 2015-11-15 •

CF022, CF023, CF024 Ansan Cabbage 2015-11-22 •

z

Turnip mosaic virus.

채집된 시료는 Lim et al. (2005)에 제시된 방법으로 total RNA를 추출하고 TOYOBO ReverTra Ace -α-를 이용하

여 cDNA를 합성하였다. 진단용 PCR 프라이머 제작을 위해 미국 국립생물정보센터(National Center for

Biotechnology Information)의 유전자 염기서열을 참고하였다(Table 1). PCR은 95°C 30초, 58°C 30초, 72°C 1분으로

35 cycle을 실시하여 바이러스를 진단하였다(Chung et al., 2015).

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총 무(R. sativus) 152점, 배추(B. rapa) 29점의 샘플 중, 무(R. sativus)에서 TuMV는 107점 배추(B. rapa)에서는 TuMV는 9점이 진단되었다(Table 2). TuMV는 강원도를 제외한 7개 도 중에서 모든 지역에서 발생하였다. 또한 바이 러스 병징을 보였지만 바이러스가 검출되지 않은 무(R. sativus)와 배추(B. rapa) 시료는 여타 바이러스의 감염 가능 성이 존재하므로, 추가로 진단 할 예정이다.

국내 발병 TuMV 외피단백질(Coat protein) 계통수 분석

국내에서 2014년도에 무에서 채집된 TuMV 분리주 R007 (GenBank: KU140420), R041 (GenBank: KU140421)와 2015년도에 배추에서 채집된 TuMV 분리주 간의 유전적 상관관계를 조사하기 위하여 채집된 지역별로 3개씩의 외 피단백질 아미노산서열을 바탕으로 각각의 계통수 분석을 실시하였다. TuMV 계통수 작성에 같은 Potyvirus 속인 Potato virus Y의 외피단백질 아미노산서열을 Outgroup으로 사용하였으며, 크게 R007과 R041로 나뉘었다. 계통수 분석에 사용된 2014, 2015년 채집된 TuMV 분리주의 외피단백질 서열은 뉴클레오티드 99.04% 아미노산 99.47%의 높은 상동성을 나타내었다. 그 중 약한 병징을 나타내는 분리주 R007과 100% 일치하는 아미노산 서열은 없었으며 강한 병징을 나타내는 R041과 100% 일치하는 총 21개의 분리주가 확인되었다. 총 50개의 분리주 중에서 4개의 분리 주가 포함된 R007 Group과 46개의 분리주가 포함된 R041 Group의 상동성은 각각 99.57%와 99.63%로써 전체적으 로 차이가 거의 없는 보존적인 서열을 공유하고 있었다. 두 가지 Group을 나누거나 또는 각 그룹 내부적으로 뚜렷한 지역과 기주 별 특이점은 보이지 않았으며 전국적으로 TuMV의 외피단백질 아미노산 서열은 상당히 유사한 것으로 보여진다. 이 결과를 보아 2014년 전국 무 밭에서 분리된 TuMV R007 과 R041는 2015년 전국에 분포된 TuMV와 큰 차이가 없어 국내 TuMV를 대표할 수 있다고 판단하였다(Fig. 3).

TuMV 분리주 접종 시 배추(

B. rapa

) 병징 차이 조사

상기의 결과와 같이 국내 배추(B. rapa) 감염 대표바이러스는 2014년 본 연구자들을 통해 분리된 R007과 R041로 판단되며(Chung et al., 2015) R007과 R041은 뉴클레오티드 서열이 87.94%. 아미노산 서열 95.76%이며 두 가지 분 리주로 기 제작한 Infectious clone을 이용하여 배추(B. rapa)에 접종하여 병원성 분석을 실시하였다(Han et al., 2016).

육종으로 만들어진 총 167 종류의 배추(B. rapa)가 사용되었으며 두 가지의 분리주를 접종한 모델 식물(N. benthamiana) 의 잎을 Phosphate-buffered saline (PBS) buffer와 섞어 배추(B. rapa)에 2반복으로 즙액 접종을 실시하였다. 이로 인 해 나타나는 병징의 차이를 바탕으로 병원성 분석을 실시하였고 접종 30일 후, 배추(B. rapa)에 나타난 병징을 비교 하였을 때 총 167종류의 배추(B. rapa) 중에서 17종류의 배추(B. rapa)에서 확연한 차이를 나타내었다(Table 3).

Kenshin, 279002, 279012, 279064, 279081, MP, C-21, HKC-004이 여덟 종류의 배추(B. rapa)들은 R007을 접종하였

을 때 아무런 병징이 나타나지 않았지만 R041을 접종하였을 때는 괴사가 발생하였다. 반대로 C-26, HKC-005,

11Su-4, 11Su-5, 11Su-7, 11Su-8, Tian Jin Lv Qing Ma Ye, CNU_141193, Jing Lv 60 이 아홉 종류의 배추(B. rapa)에

서는 R007을 접종하였을 때 괴사가 발생하였고 R041을 접종하였을 때 아무런 병징이 나타나지 않았다(Fig. 4). 하지

만 배추(B. rapa)에 두개의 분리주를 각각 접종 하였을 때, 대부분의 배추(B. rapa)에서는 약한 병징이 나타나거나 두

가지 분리주 모두에서 병징이 나타나지 않거나 모두 괴사하는 등의 차이가 없는 모습을 보여 주었다. 두 분리주 간 아

미노산 서열의 상동성은 95.76%이며 4.24% 의 상이한 염기서열이 17종의 배추(B. rapa)라인에서 병징의 차이를 나

타냄에 따라 이를 이용하여 TuMV 저항성 판별을 위한 마커 개발에 도움이 될 것으로 기대될 것이라 사료된다.

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Fig. 3. Phylogenetic tree of coat protein (CP) amino acid sequence of Turnip mosaic virus isolated from R. sativus and B.

rapa. The phylogenetic tree was made with MEGA 6.0 program using the Neighbor-Joining method with 1,000 bootstrap

replicates. CP sequences for the phylogenetic analysis were obtained from 50 TuMV isolates from R. sativus and B. rapa

collected in Korea in 2014 - 2015. The names at the end of nodes indicate collected sites of isolate/country/host. Black

arrows indicate isolates found in this study. The scale bar indicates the number of amino acid substitutions. Potato virus Y

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Fig. 4. Different symptoms in B. rapa L. ssp lines after inoculation of TuMV isolates R007 and R041 (+, -: Result of PCR diagnosis).

Conclusion

2014년 전국 조사(Chung et al., 2015)에 이어 강원도를 제외한 총 28개 시, 군을 대상으로 전국적인 무(R. sativus) 와 배추(B. rapa) 포장의 순무모자이크바이러스병(Turnip Mosaic Virus, TuMV) 발생 분포 조사를 2015년에 실시하 였다. 무(R. sativus) 152점, 배추(B. rapa) 29점의 샘플 중, 무(R. sativus) 와 배추(B. rapa)에서 각각 TuMV는 107점 과 9점이 진단되었다. 무(R. sativus)와 배추(B. rapa)에 발생한 TuMV의 외피단백질의 염기 및 아미노산 99%이상 일치 하였으며 2014년 분리주 R007 (GenBank: KU140420)와 R041 (GenBank: KU140421) 외피단백질과 99%이상의 높 은 상동성을 보여 2014년, 2015년 무, 배추밭에서 발생하는 TuMV 는 모두 R007과 R041과 같은 계통 임을 판단할 수 있었다. 또한 국내 대표 분포 TuMV R007과 R041 를 이용하여 국내 육종 생산 167개의 배추(B. rapa) 라인 중 8종류 (R007 저항성 라인 Kenshin, 279002, 279012, 279064, 279081, MP, C-21, HKC-004)와 9종류(R041 저항성 라인 C-26, HKC-005, 11Su-4, 11Su-5, 11Su-7, 11Su-8, Tian Jin Lv Qing Ma Ye, CNU_141193, Jing Lv 60)를 선별하였다.

두 분리주 전체 아미노산 서열의 상동성은 95.76% 이며 4.24%의 상이한 염기서열이 17종의 배추(B. rapa)라인에서 저항성 차이를 나타냄에 따라 이를 이용하여 TuMV 저항성 판별을 위한 마커 개발에 도움이 될 것으로 기대될 것이 라 사료된다.

Acknowledgements

This work was supported by Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture, Forestry and Fisheries (IPET) through Golden Seed Project, Funded by Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA) (213002-04-4-WTz11).

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