The Anti-osteoporosis Effects of Cassia tora L. Seed Ethanol Extract in Ovariectomixed Rats

Kor. J. Pharmacogn.

47(4) : 333∼ 342 (2016)

333

결명자 주정추출물의 난소적출 랫드에서 항골다공증 효과

이무진^1,2·안병관¹·정호경^1,2·이기호¹·김아현¹·이현주¹·장지훈¹·심미옥¹·김태묵¹·김민석¹· 성태경¹·우경완¹·조정희¹·김종춘²·조현우^1*

1한약진흥재단 한약자원본부, ²전남대학교 수의과대학 BK21

The Anti-osteoporosis Effects of Cassia tora L. Seed Ethanol Extract in Ovariectomixed Rats

Mu-Jin Lee^1,2, Byeong-Kwan An¹, Ho-Kyung Jung^1,2, Ki-Ho Lee¹, A-Hyeon Kim¹, Hyun-Joo Lee¹, Ji-Hun Jang¹, Mi-Ok Sim¹, Tae-Muk Kim¹, Min-Suk Kim¹, Tea-Gyeong Seong¹, Kyeong-Wan Woo¹,

Jung-Hee Cho¹, Jong-Choon Kim² and Hyun-Woo Cho¹*

1Division of Tradition Korean Medicine Research, National Development Institute of Korean Medicine

2College of Veterinary Medicine BK21 Plus Project Team, Chonnam National University

Abstract − In our study, osteoporosis was induced by ovariectomized in female rats, and the prevention and treatment efficacy of the climacteric disease the postmenopausal type I pattern was examined by using the experimental substance Cassia tora (CT) ethanol extracts. Female rats were either sham-operated (sham; n=5) or surgically ovariectomized (OVX; five animals per group) and then administered to OVX control, raloxifene hydrochloride (RLX) 1 mg/kg/day, or CT (20 and 200 mg/kg/day) for 12 weeks. Serum osteocalcin and creatinine concentration were significantly lower in the CT 200 mg/kg/day group com- pared with the OVX control group. Serum progesterone concentration was significantly higher in the CT 200 mg/kg/day group compared with the OVX control group. Reduction grade of the trabecular bone decreased in the RLX 1 and CT 200 mg/kg/

day group compared with that of the OVX control group. In conclusion, CT 200 mg/kg/day may have inhibitory effects on oste- oporosis in OVX rats.

Key words − Cassia tora L., Ovariectomized, Osteocalcin, Progesterone, Creatinine

현대 사회에서 급격한 고령화가 진행되면서 대표적인 노 인성 질환인 골다공증에 대한 예방과 치료의 필요성이 증 대되고 있다. 골다공증은 골량의 감소와 미세구조의 이상을 특징으로 하는 전신적인 골격계 질환으로 뼈가 약해져서 쉽 게 부러지게 되는 질환이라고 세계보건기구(WHO)는 정의 하고 있다.¹⁾ 골 형성은 사춘기 때 급속히 증진되고, 35-40 세부터 골이 상실되기 시작하여, 45-50세 때 난소 기능의 감퇴와 관련되어 가속화 되는데, 폐경 이후 5년 정도에 개 인의 일생의 골량의 50%가 상실된다.²⁾ 전세계적인 골다공 증 약제 시장은 약 90억 달러의 규모로 Bisphosphonate계열 이 골다공증 약제의 주류를 이루어 전체 사용의 73%를 차 지하였으며, 다음이 SERM(Selective estrogen receptor

modulator) 15%, Calcitonin 10%, PTH(parathyroid hormone) 1.4%의 순이었다.³⁾ 폐경기 여성은 호르몬 불균형과 칼슘 결 핍 및 체내 산화적 스트레스 증가로 여러 질병의 위험에 처 해 있으며 에스트로겐 및 비스포스포네이트 등 투여는 골 다공증을 감소시키는 것으로 알려져 있으나 치료요법에 따 른 유방암, 자궁암 및 위장관 장애 등 부작용의 발생위험도 는 높아지는 것으로 보고되고 있다.^4,5) 현재 임상에서 사용 하고 있는 골다공증 치료제의 한계점이 드러나기 시작하면 서 새로운 치료제를 개발하기 위한 필요성이 제기되었고 특 히 생체이용률이 높고 부작용이 적은 천연물을 이용하여 치 료제를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.⁶⁾

결명자(Cassiae semen)는 콩과(Leguminosae)에 속하는 1 년생 초본식물인 초결명(Cassia obtusifolia L.) 또는 긴강남 차(Cassia tora L.)의 성숙한 종자로 북아메리카가 원산지이 며, 성질은 약간 차고 맛은 달고 쓰며 짜고 독이 없다. 대한

*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel): +82-61-860-2801

민국의 남쪽지방에서 재배되고 있는 결명자는 대부분 Cassia tora L.(CT)로 약재 및 차의 형태로 이용되어 왔다. 한방에 서 청간명목(淸肝明目), 음허에 의하여 간양(肝陽)이 상승하 는 것을 치료하고 간의 내풍(內風)을 평하게 하는 평간잠양 (平肝潛陽) 및 장(腸)을 적셔주고 대변(大便)을 통하게 하는 윤장통변(潤腸通便) 등의 효능이 있다.^7,8) 결명자의 주요 성 분으로는 chrysophanol, physcion, emodin, aloe-emodin, obtusin, chryso-sbtusin 및 aurantio-obtusin 등과 같은 anthraquinone류와 glucoobtusifolin, glucochryso-obtusin 및 glucoaurantio-otusin 등과 같은 anthraquinone glycoside류 및 torachrysone, toralactone, rubrofusarin, cassiaside 등과 같은 naphthalene 유도체 등이 보고되었다.⁹⁾ 결명자의 생리 활성 연구결과를 살펴보면 간 보호,¹⁰⁾ 항산화,¹¹⁾ 혈압강하,¹²⁾ 혈중 지질저하 효과,¹³⁾ 혈당강하,¹⁴⁾ 면역증강,¹⁵⁾ 등의 다양 한 효능들이 있는 것으로 밝혀져 있으나 결명자 추출물에 대한 여성 갱년기 및 골다공증에 대한 연구결과의 보고는 확인되지 않는 상태이다. 골다공증 환자들의 혈액에서는 혈 중 비타민 C와 E, glutathione, peroxidase, superoxide, dismutase 등이 감소되는 것으로 알려져 있으며,¹⁶⁾ alkaline phospatase(ALP)는 간 내에서는 간세포의 소관 쪽 세포막과 담관 상피세포의 내강 쪽 세포막에 존재하며, 간질환 시 ALP 혈중 농도의 상승하고,¹⁷⁾흰쥐에서 난소를 적출할 경 우 칼슘과 ALP의 농도가 증가하는 것으로 알려져 있다.¹⁸⁾ 그래서 골다공증과 같은 대표적인 대사성 질환에 간질환과 항산화에 효과가 있는 결명자가 여성의 폐경 후 에스트로 겐 분비 감소로 인한 제 1형 골다공증¹⁹⁾ 모델을 위하여 랫 드의 난소를 적출하여 폐경을 유도하고 성호르몬 결핍 상 태인 랫드에 골대사 약화 상태를 확인한 후 결명자 주정 추 출물을 투여하여 골다공증에 미치는 효과를 연구하고자 하 였다.

재료 및 방법

시험물질 조제 − 본 실험에 사용된 결명자(Cassia tora L.) 는 2014년 전라남도 해남에서 생산된 것을 구입하여 한약 진흥재단 조현우 및 안병관 박사가 감별한 후 3차원 회전 뒤틀림방식과 간접 열풍방식을 이용한 볶음기(Gene Café CBR-101A, Genesis Co., Ltd., Gunpo, Korea)로 200^oC온 도에서 10분간 볶음처리를 하였다. 볶음 처리된 결명자를 수세, 건조한 후 40 mesh로 분쇄한 시료 1 kg에 50% 주정 용액 10 L를 가하여 온도 50^oC에서 7일간 침지하고 95^oC에 서 4시간씩 2회 추출한 후 filter paper(Whatman No. 2, Whatman, Maidstone, UK)로 여과하였고, 얻어진 여액은 감 압농축기(EYELA, N-1100 series, Tokyo, Japan)에서 농축 하여 주정을 기화시켜 농축액을 얻었다. 농축이 완료된 추 출물은 동결건조기(Lyoph-pride 20R, Ilshin, Yangju, Korea)

를 이용하여 건조하여 205 g(수율: 20.5%)의 시료를 얻었다.

조제물질 분석 − 결명자 주정추출물의 시료 100 mg을 25 ml 용량플라스크에 넣고 50% EtOH 용액으로 정용하였 으며, 필터 후 시험용액 1 µl 주입하고 LC/MS를 사용하여 정성 분석을 진행하였다. 분석장비는 Shimadzu UFLC-IT- TOF MS system을 사용하였으며, Waters ACQUITY UPLC

®BEH C18(2.1×150 mm, 1.7µm) column을 사용하였다. 이 동상으로는 Solvent A(water in 0.1% formic acid)와 Solvent B(acetonitrile)을 사용하여 0.21 ml/min의 유속으로 흘려주었으며, 시간에 따른 이동상의 조건은 Table I과 같 다. 분자량은 TOF MS(time of flight, Shimadzu, Japan)를 통해 측정하였으며, nebulizing gas의 유속은 1.5 L/min, CDL(curved desolvation line) 및 heat block의 온도는 200^oC로 하였다. 결명자 주정추출물의 성분은 DAD(diode array detector)의 설정된 파장인 280 nm로 검출하였으며, 용 출되는 순서에 따라 IT-TOF MS를 통해 분자량을 측정하였 다.

실험동물 및 사육환경 − 본 시험에서는 ㈜ 샘타코바이오 코리아(Osan, Korea)로부터 입수한 6주령 암컷 특정병원체 부재(specific-pathogen free) Sprague-Dawley 랫드를 사용하 였다. 1주일간의 검역 및 순화를 거친 뒤 건강하다고 판정 된 것을 선발하여 시험에 제공하였다. 동물실의 사육환경은 온도 22±3^oC, 상대습도 50±15%, 환기횟수 10~15 회/시간, 조명시간 12시간(07:00 점등~19:00 소등) 및 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경에서 폴리카보네이트 사육상자 (260W×420L×180H mm)에 수용하였으며, 실험식이와 (Altromin 1314 feed, Lage, Germany)와 식수를 자유 급여 하였다. 본 실험에 사용된 모든 동물은 미국 National Research Council(1996)의 “실험동물의 관리와 사용에 관한 지침”에 따라 유지하였으며, 동물실험은 한약진흥재단 동 물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 승인(승인번호: 2015-1-01) 하에 수 행되었다.

난소적출 및 투여 − 7주령 암컷 랫드를 2,2,2-Tribromo- ethanol(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)과 2- methyl-2-butanol(Sigma)을 혼합한 avertin stock solution를 PBS로 125 mg/kg되게 희석한 주사액을 복강 주사 하여 전 Table I. Gradient conditions of mobile phase

Time (min) Solvent A (%) Solvent B (%)

0 85 15

20 75 25

25 60 40

32 40 60

40 40 60

신마취 후 등 부위의 털을 제거하고 좌 우 난소위치의 피 부, 근육, 복막을 절개한 후 5호 실크 봉합사로 난소를 결 찰 한 후 난소를 적출(ovariectomized; OVX)하고 복막과 근 육, 피부를 각각 5호 실크 봉합사로 봉합한 후 5주간 골다 공증을 유발시켰다. 수술 후 1주간 매일 diclofenac sodium(Sigma) 5 mg/kg/day를 경구 투여하고 포비돈을 이 용하여 수술 부위를 소독하였다. 군분리는 일반증상 및 체 중증가에 이상이 없는 동물 중에서 난소적출 후 5주간의 회 복기간 종료일에 실시하였다. 5주째 1주간의 성주기검사 결 과 Sham(복막만 절개)군은 정상적인 발정주기(estrous cyclicity)를 보이는 동물을 선발하였으며, OVX군은 정상적 인 발정주기를 보이지 않는 동물을 선발하였다. 또한, 군분 리 전에 측정한 오스테오칼신(osteocalcin), 에스라디올 (estradiol), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 칼슘 측정치 및 군분리일의 평균체중에 가까운 암컷 각 25마리 를 선발하였다(data not shown). 선발한 동물을 각 군에 효 소면역측정, 혈액생화학적 측정치 및 평균체중이 균등하도 록 무작위로 군분리하였다. RLX 투여용량은 Black 등²⁰⁾의 결과에 근거하여 1 mg/kg/day로 설정하였으며, 결명자는 예 비시험 결과에 근거하여 200 mg/kg/day 설정하고 최저효과 를 확인하기 위하여 공비 10를 적용하여 20 mg/kg/day을 저 용량으로 설정하였다. 군구성은 Sham+칼슘20 mg/kg/day (calcium lactate; Sigma), OVX+칼슘, OVX+칼슘+RLX 1 mg/kg/day, OVX+칼슘+결명자 20 및 200 mg/kg/day 투여 군으로 하였다. 투여액량은 5 mL/kg으로 하고, 개체별 투여 액량은 최근의 측정체중을 기준으로 산출하였다. 매일 오전 에 경구투여용 존데를 부착한 일회용 주사기를 이용하여 12

주간 1일 1회 위내에 강제 투여하였다.

체중 및 사료섭취량 측정 − 모든 동물에 대하여, 난소적 출 후 5주째에 투여 전, 투여 후 주 1회 체중을 12주간 측 정하였다. 단, 부검일의 체중은 절식을 실시하였으므로, 체 중평가에서 제외하였다. 또한, 사료섭취량은 1주일간의 섭 취량을 측정하여 1일의 평균섭취량을 산출하였으며, 주 1회 12주간 측정하였다.

효소면역측정 − 모든 동물에 대하여 약 18시간 이상 절식 시킨 후, 마취하여 복대정맥으로부터 채취한 혈액을 혈청분 리 튜브(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에 넣고 3,000 rpm 으로 10분간 원심분리 후 혈청을 취하여 이용하였다. 혈청 에 대한 효소면역측정은 osteocalcin(Shanghai Yehua Biological Technology, Shanghai, China) 및 progesterone (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)에 대하여 각 회사에서 제공한 측정방법에 따라서 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) kit를 이용하여 측정하였다. 또한, 간 및 신장 조직을 취하여 각 조직 100 mg당 1 mL의 PBS buffer를 가하여 4^oC 온도 이하에서 homogenizer로 분쇄하 고, 이때 얻은 균질액을 600 g에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 취하여 이용하였다. 조직액에 대한 효소면역측정은 malondialdehyde(Shanghai Yehua Biological Technology, Shanghai, China) 및 superoxide dismutase(Cusabio Life Sciences, Hubei, China)에 대하여 각 회사에서 제공한 측정 방법에 따라서 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 측정 기 기는 ELISA microplate reader(Infinite 200 pro, TECAN, Grödig, Austria)를 이용하여 각 회사에서 제공한 조건의 파 장에서 측정하였다. 또한, creatinine(CRE)은 혈액생화학 분

Fig. 1. LC/MS chromatogram of Cassia tora L. seed (A: UV chromatogram, B: total ion chromatogram).

석기(FUJI DRI-CHEM 4000i, FUJI, Tokyo, Japan)를 이용 하여 측정하였다.

장기중량 측정 − 모든 동물에 대하여 자궁(uterus) 및 대 퇴골(femur, Lt)에 대한 습중량을 측정하고, 절식체중에 대 한 상대장기중량비를 산출하였다.

조직병리학적 검사 − 부검을 실시한 모든 동물에 대하여 대퇴골을 적출하여 10% 중성완충 포르말린용액(Sigma)에 2주간 고정하고, 골조직을 calci-clear-rapid^TM액(National diagnostics, Hackensack, NJ, USA)을 사용하여 탈회하였다.

탈회한 골조직은 삭정, 탈수 및 파라핀 포매 등의 일반적인 조직처리과정을 거쳐 조직절편을 제작하여 박절한 후, hematoxylin-eosin(Sigma)염색을 실시하였다. 잔여 골조직은 10% 중성완충포르말린용액에 보존하였다. 조직병리학적 검 사는 검체 제작된 모든 동물의 대퇴골조직에 대하여 검경 하였다.

통계분석 − 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었 으며, 통계 프로그램인 PASW statistics 18(IBM Co., Armonk, NY, USA)을 이용하여 각 실험결과들로부터 Table II. Compounds retention time and molecular weight result of included 50% EtOH ext. from Cassia tora L. seed

Compounds Rt Molecular Weight (m/z)

Positive Negative

Isorubrofusarin-gentiobioside 10.29 597.17701 [M+H]⁺ 641.1630 [M+HCOO]^- Nor-rubrofusarin-glucoside 15.43 421.1086 [M+H]⁺ 419.0923 [M-H]^- Aurantio-obtusin-glucoside 16.51 493.1330 [M+H]⁺ 491.1118 [M-H]^- Rubrofusarin-gentiobioside 16.8 619.1566 [M+Na]⁺ 597.1804 [M+H]⁺ 595.1612 [M-H]^- Obtusifolin-glucoside 25.66 469.1099 [M+Na]⁺ 491.1123 [M+HCOO]^- Aurantio-obtusin 28.92 331.0742 [M+H]⁺ 329.0622 [M-H]^-

Obtusin 32.39 345.0900 [M+H]⁺ 343.0778 [M-H]^-

Obtusifolin 32.88 283.0581 [M-H]^-

Emodin 34.33 269.0414 [M-H]^-

Rubrofusarin 35.22 273.0680 [M+H]⁺ 271.0575 [M-H]^-

Isorubrofusarin 36.01 273.0675 [M+H]⁺ 271.0578 [M-H]^-

Chrysophanol 38.25 253.0451 [M-H]^-

Table III. Mean body weights in ovariectomized rats Group /

Dose (mg/kg/day)

Week of dosing

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Sham control

Mean 235.0^b 231.8^b 242.6^b 245.8^b 255.4^b 259.6^b 262.6^b 261.8^b 267.4^b 266.0^b 269.6^b 284.4^b 282.6^b S.D. 7.3 9.6 10.2 9.6 9.2 11.1 7.0 6.3 6.6 8.0 4.3 10.8 8.3

N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

OVX control

Mean 285.8^a 290.8^a 310.6^a 314.2^a 330.4^a 326.2^a 335.8^a 336.0^a 344.6^a 341.2^a 342.8^a 355.8^a 355.4^a S.D. 25.4 28.6 32.9 34.9 37.9 38.9 40.7 40.4 41.1 40.8 40.9 43.0 43.5

N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

OVX + RLX 1 mg

Mean 285.8^a 278.0^ab 292.0^ab 287.0^ab 297.4^ab 301.2^ab 304.8^ab 306.8^ab 314.6^ab 311.6^ab 310.8^ab 326.0^ab 324.2^ab S.D. 32.4 30.9 33.5 32.2 33.6 34.9 34.2 33.4 31.1 28.3 29.0 31.3 31.8

N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

OVX + CT 20 mg

Mean 286.4^a 289.8^a 307.4^a 313.8^a 325.0^a 325.2^a 337.8^a 338.0^a 351.2^a 349.8^a 350.6^a 363.2^a 358.2^a S.D. 15.2 16.3 15.6 21.1 21.9 27.7 30.3 31.0 28.0 22.7 27.2 24.2 24.8

N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

OVX + CT 200 mg

Mean 285.8^a 286.4^a 300.6^a 304.4^a 314.0^a 314.4^a 327.4^ab 325.0^ab 338.2^ab 335.6^ab 335.4^a 346.4^a 341.6^ab S.D. 17.0 19.9 20.4 23.0 25.7 29.1 31.3 32.6 30.8 23.6 28.5 23.0 26.0

N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Values are expressed as mean±S.D. of five ovariectomized (OVX) rats. RLX: Raloxifene, CT: Cassia tora, test material (mg/kg/

day).

Means with the different letters are significantly different ( P<0.05) by Scheffe’s multiple range test.

ANOVA(analysis of variance)를 적용하였으며, 유의성이 인 정되었을 경우, Scheffe’s multiple test(체중; P<0.05) 또는 Duncan’s multiple test(효소면역측정, 장기중량 및 조직병리

; P<0.05)를 이용하여 각 군의 평균간의 유의성을 검정하였다.

결 과

결명자 주정추출물 성분분석 − LC-MS를 이용한 결명자 주정추출물에 대한 성분분석 결과 12종의 페놀성 및

Fig. 2. Enzyme immunoassay in ovariectomized rats. Values are expressed as mean±S.D. of five ovariectomized (OVX) rats. RLX:

Raloxifene, CT: Cassia tora, test material (mg/kg/day). Different letters are significantly different at P<0.05 by Duncan's multiple range test.

anthraquinone 화합물이 확인되었으며, 성분은 isorubro- fusarin-gentiobioside, nor-rubrofusarin-glucoside, rubrofusarin- gentiobioside, rubrofusarin, isorubrofusarin 등의 페놀성화합 물 5종과 aurantio-obtusin-glucoside, obtusifolin-glucoside, aurantio-obtusin, obtusin, obtusifolin, emodin, chrysophanol 등의 anthraquinone화합물 7종으로, 각각의 관찰된 시간 및 분자량에 대한 결과는 Fig. 1 및 Table II와 같다.

체중 및 사료섭취량 측정 − 랫드 암컷의 난소를 적출한 (OVX)군에서 투여 0주부터 12주까지 Sham군과 비교시 유 의성 있는 체중 증가가 관찰되었나, RLX 1 mg/kg 투여군 은 투여 후 1주째부터, 결명자 200 mg/kg 투여군에서는 투 여 후 6주째부터 OVX 대조군에 비하여 감소가 관찰되었다 (Table III). 사료섭취량에서 난소를 적출한군에서 투여 0주 부터 12주까지 Sham군과 비교시 섭취량 증가가 관찰되었 으나, OVX 대조군에 비하여 대조약 및 결명자 투여군에서 는 차이가 관찰되지 않았다.

효소면역 측정 − 혈청 중 효소면역측정에서 오스테오칼신 (osteocalcin)은 Sham군에 비하여 OVX 대조군에서 유의성 있는 증가가 관찰되었으나, 결명자 200 mg/kg 투여군에서 는 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 감소가 관찰되었다 (Fig. 2A). 프로게스테론(progesterone)은 Sham군에 비하여 OVX 대조군에서 유의성 있는 감소가 관찰되었나, 결명자 200 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비하여 유의성 있 는 증가가 관찰되었다(Fig. 2B). 크레아틴(creatinine)은 Sham 군에 비하여 OVX 대조군에서 유의성 있는 증가가 관찰되

었으나, RLX 1 mg/kg 및 결명자 200 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 감소가 관찰되었다(Fig.

2C). 조직액 중 효소면역측정 검사에서 신장 조직의 지질과 산화물(malondialdehyde)은 Sham군에 비하여 OVX 대조군 에서 증가가 관찰되었으나, RLX 1 mg/kg은 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 감소가 관찰되었으며, 결명자 20 및 200 mg/kg 투여군에서 모두 감소경향이 관찰되었다(Fig. 2D).

간장 조직의 과산화물제거효소(superoxide dismutase)는 Sham군에 비하여 OVX 대조군에서 유의성 있는 감소가 관 찰되었나, OVX 대조군에 비하여 결명자 200 mg/kg 투여군 에서는 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 증가가 관찰되 었다(Fig. 2E).

장기중량 측정 − 절대 장기중량에서 대퇴골 중량이 Sham 군에 비하여 OVX 대조군에서 유의성이 있는 차이가 관찰 되지 않았다. 자궁 중량이 Sham군에 비하여 OVX 대조군 에서 유의성 있는 감소가 관찰되었으나, OVX 대조군에 비 하여 RLX 1 mg/kg 및 결명자 200 mg/kg 투여군에서 증가 가 관찰되었다. 상대 장기중량에서 대퇴골 중량이 Sham군 에 비하여 OVX 대조군에서 유의성 있는 감소가 관찰되었 으나, OVX 대조군에 비하여 RLX 1 mg/kg 및 결명자 200 mg/kg 투여군에서 증가가 관찰되었다. 자궁 중량이 Sham 군에 비하여 OVX 대조군에서 유의성 있는 감소가 관찰되 었으나, OVX 대조군에 비하여 RLX 1 mg/kg 및 결명자 200 mg/kg 투여군에서 증가가 관찰되었다(Table IV).

조직병리학적 검사 − 대퇴골에 대한 조직병리학적 검사에

Table IV. Absolute and relative organ weights in ovariectomized rats Parameter Sham

control

OVX control

OVX+RLX 1 mg

OVX+CT 20 mg

OVX+CT 200 mg Body weight (g) 259.8±5.3^a 337.0±41.9^b 303.4±29.8^b 335.0±22.3^b 322.8±25.2^b Organ weights (g)

Femur (Lt.) 0.73±0.09^NS 0.76±0.06 0.81±0.19 0.76±0.03 0.81±0.09 Uterus 0.60±0.18^a 0.11±0.06^b 0.18±0.06^b 0.11±0.03^b 0.17±0.12^b Organ weights (% of body weight)

Femur (Lt.) 0.28±0.03^a 0.23±0.03^b 0.26±0.05^ab 0.23±0.02^b 0.25±0.04^ab Uterus 0.23±0.07^a 0.03±0.03^b 0.06±0.02^b 0.03±0.01^b 0.05±0.04^b

Values are expressed as mean±S.D. of five ovariectomized (OVX) rats. RLX: Raloxifene, CT: Cassia tora, test material (mg/kg/

day).

Means with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

Non-significant.

Table V. Histopathological findings of femur in ovariectomized rats

Parameter Sham

control

OVX control

OVX+RLX 1 mg

OVX+CT 20 mg

OVX+CT 200 mg Reduction grade of

trabecular bone 0.0±0.0^c 3.2±0.4^a 2.2±0.4^b 3.0±0.8^a 2.6±0.8^ab

Values are expressed as mean±S.D. of five ovariectomized (OVX) rats. RLX: Raloxifene, CT: Cassia tora, test material (mg/kg/

day). Grade 0: No abnormalities detected, Grade 1: Minimal, Grade 2: mild, Grade 3: Moderate, Grade 4: Severe.

Means with

the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

서 대퇴골 원위부 골간단의 관찰된 해면골 감소(reduction of trabecular bone)가 Sham군에 비하여 OVX(중증이상 소 견: 100%)군에서 유의성 있는 증가가 관찰되었나, RLX 1 mg/kg(중증이상 소견: 20%)은 OVX 대조군에 비하여 유 의성 있는 감소가 관찰되었으며, 결명자 200 mg/kg 투여군 에서도 해면골 감소의 중증이상 소견이 40%로 OVX 대조 군에 비하여 60% 감소가 관찰되었다(Fig. 3, Table V).

고 찰

골다공증은 골절의 위험을 증가시키는 질환으로 노년에 활동의 제약과 사회적, 정신적, 경제적인, 손실이 크게 발생 하는 것으로 단순히 본인의 문제가 아닌 가족 전반의 부양 과 관련된 중요한 질환으로,²¹⁾ 미국 국립보건원(NIH)에서는 골강도의 약화로 골절의 위험성이 증가하게 되는 골격계 질 Fig. 3. Histopathological findings of femur in ovariectomized rats. OVX: Ovariectomy, RLX: Raloxifene, CT: Cassia tora, test material (mg/kg/day). Representative photomicrograph of H&E stained trabecular bone. Scale bars, 200µm.

환으로 규정하였다.²²⁾특히 폐경 전 젊은 나이에 난소절제 술을 받은 여성은 예외 없이 골다공증이 발생 한다.²³⁾ 현재 가장 많이 사용되는 치료제인 비스포스포네이트 계열의 치 료제는 장기 투여 시 턱뼈가 괴사,²⁴⁾ 대퇴골의 비정형 골절 과도 관련이 있다는 보고가 있다.²⁵⁾결명자는 콩과 식물로 isoflavone 및 flavonoid 함유되어 있으며,²⁶⁾ 이소플라본은 여 성 호르몬인 에스트로겐과 유사한 기능을 하는 식물성 에 스트로겐으로 폐경기에 유발되는 골다공증의 예방 효과가 있는 것으로 알려져 있다.^{27, 28)} 또한, 결명자의 항산화 효과 에 관한 연구는 간질환 모델에서 결명자 에탄올추출물의 항 산화 및 지질대에 미치는 영향,²⁹⁾에탄올추추물의 특성 및 항산화 효과³⁰⁾ 등 다양하게 보고되어 있으나 결명자 추출물 에 대한 여성 갱년기 및 골다공증에 대한 연구결과는 보고 되지 않았다.

LC-MS를 이용한 결명자 주정추출물에 대한 성분분석 결 과 12종의 페놀성 및 anthraquinone 화합물이 확인되었으며, 이러한 화합물 중 rubrofusarin-gentiobioside 및 nor- rubrofusarin-glucoside 등 페놀성 성분이 항산화 활성(DPPH radical scavenging activity)을 증가시키는 것으로 보고되었 다³¹⁾. 난소절제군은 Sham군에 비하여 유의적으로 체중이 증가하였는데 이것은 선행연구에서 난소절제는 Sham 수술 한 쥐에 비하여 체중이 유의적으로 증가하였다는 결과와 일 치하였다. 난소절제 쥐가 체중이 증가하는 이유는 에스트로 겐 결핍으로 인한 것을 보충하기 위하여 에스트로겐 생성 이 가능한 체지방을 증가시켜 뼈에 가하는 힘을 부과시킴 으로써 체중지탱능력(weight bearing activity)을 키우기 위 한 방어기전으로 보고하였다.³²⁾ 결명자 200 mg/kg 투여군에 서 투여 후 6주째부터 OVX 대조군에 비하여 감소가 관찰 되어, 결명자 투여를 통해 체중 증가가 억제되는 것으로 사 료된다.

오스테오칼신(osteocalcin)은 뼈에 매우 특이한 단백질로 써 조골세포의 활동성을 평가하는 골 형성 정도를 반영하 는 가장 좋은 단일 지표로 보고되어 있으며,³³⁾ 폐경기 여성 은 골 교체율이 증가하여 혈청 오스테오칼신 농도가 증가 하는 것으로 알려져 있다.³⁴⁾혈청 오스테오칼신 농도 증가 는 젊은 연령층에서는 골 형성의 증가를 의미하는 긍정적인 면으로 해석되지만 폐경 후에는 골밀도와 음의 상관관계를 갖는 것으로 보고되어 골 교체율의 증가를 의미한다.³⁵⁾ 프 로게스테론(progesterone)은 황체와 자궁에서 생산, 분비되 는 임신지속 호르몬으로, 임신 지속을 위해서 필수적인 호 르몬으로 알려져 있다.³⁶⁾ 난소절제에 의해 유발된 골다공증 은 프로게스테론 투여로 치료효과를 나타낼 수도 있다고 하 였다.³⁷⁾ 크레아티닌(creatinine)은 신장 기능평가 지표로 난 소절제를 하면 증가하는 것으로 보고되어있다.¹⁸⁾

혈청의 오스테오칼신은 Sham군에 비하여 OVX 대조군에 서 유의성 있는 증가가 관찰되었으나, 결명자 200 mg/kg 투

여군에서는 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 감소가 관 찰되고, 프로게스테론은 Sham군에 비하여 OVX 대조군에 서 유의성있는 감소가 관찰되었나, 결명자 200 mg/kg 투여 군에서는 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 증가가 관찰 되어 결명자가 골다공증 개선에 효과가 있는 것으로 사료된다.

만성퇴행성 질환의 주요 원인 중 세포의 산화적 손상은 신체내의 유산소적인 대사과정에서 생성된 자유라디칼(free radical)에 의해 발생한다.³⁸⁾지질과산화 반응은 생체 조직막 의 다가불포화지방산 유리기에 의해 산화적 분해를 일으키 는 지표로 지질과산화물(malondialdehyde)을 확인하였으며 이의 증가는 산화적 스트레스의 증가를 나타낸다.³⁹⁾과산화 물제거효소(superoxide dismutase) 활성 증가는 free radical 생성을 감소시켜 세포막의 다가불포화지방산으로부터 지질 과산화물의 생성을 억제하는 것으로 보고되고 있다.⁴⁰⁾ 간장 조직의 과산화물제거효소는 Sham군에 비하여 OVX 대조군 에서 유의성 있는 감소가 관찰되었나, OVX 대조군에 비하 여 결명자 200 mg/kg 투여군에서 유의성 있는 증가가 관찰 되었으며, 신장조직액의 지질과산화물은 Sham군에 비하여 OVX 대조군에서 증가가 관찰되었으나, OVX 대조군에 비 하여 RLX 1 mg/kg, 결명자 20 및 200 mg/kg 투여군에서 모두 감소가 관찰되었으며, 혈청의 크레아틴은 Sham군에 비하여 OVX 대조군에서 유의성 있는 증가가 관찰되었으 나, RLX 1 mg/kg 및 결명자 200 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 감소가 관찰되었다. 따라서 난소절제 대사성 모델에서 결명자 투여에 의한 과산화물제 거효소 활성의 증가는 지질화산물 생성을 감소시키며, 신장 기능을 회복시켜 주는 것으로 기대된다.

폐경이 진행되면 자궁조직이 위축되어 자궁 중량이 감소 하는 것으로 보고되고 있다.⁴¹⁾ 자궁 중량이 Sham군에 비하 여 OVX 대조군에서 유의성 있는 감소가 관찰되었으나, OVX 대조군에 비하여 RLX 1 mg/kg 및 결명자 200 mg/kg 투여군에서 증가가 관찰되어, 결명자는 자궁조직이 위축되 는 것을 억제 및 회복시켜주는 것으로 기대된다.

난소적출 모델에서 골 감소는 대부분 해면골에서 일어나 골다공증이 발생한다고 하였다.⁴²⁾대퇴골에 대한 조직병리 학적 검사에서 대퇴골 원위부 골간단의 해면골 감소(reduction of trabecular bone)가 Sham군에 비하여 OVX군에서 유의성 있는 증가가 관찰되었나, 대조약은 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 감소가 관찰되었으며, 결명자 200 mg/kg 투여 군에서도 감소가 관찰되어 결명자가 해면골 감소를 억제시 켜 골다공증을 어느 정도 개선 및 예방시키는 것으로 사료 된다.

결 론

본 연구는 골다공증 시험에 암컷 랫드의 난소를 적출하여

폐경을 유도한 후 결명자 주정 추출물을 12주간 경구 투여 하여 골다공증에 미치는 효과를 연구하고자 하였다. 체중측 정에서 결명자 200 mg/kg 투여군에서 투여 후 6주째부터 OVX 대조군에 비하여 감소가 관찰되었다. 혈청 검사에서 osteocalcin은 결명자 200 mg/kg 투여군에서 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 감소가 관찰되고, progesterone은 결명 자 200 mg/kg 투여군에서는 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 증가가 관찰되어 결명자가 골다공증 개선에 효과가 있 는 것으로 사료된다. 간장 조직의 과산화물제거효소는 OVX 대조군에 비하여 결명자 200 mg/kg 투여군에서 유의성 있 는 증가가 관찰되었으며, 신장조직액의 지질과산화물은 OVX 대조군에 비하여 결명자 투여군에서 모두 감소경향이 관찰 되었으며, 혈청 크레아틴에서도 결명자 200 mg/kg 투여군 에서 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 감소가 관찰되어 과산화물제거효소 활성의 증가는 지질화산물 생성을 감소 시키며, 신장 기능을 회복시켜 주는 것으로 기대된다. 자궁 중량이 OVX 대조군에 비하여 결명자 200 mg/kg 투여군에 서 증가가 관찰되어, 결명자는 자궁조직이 위축되는 것을 억제 및 회복시켜주는 것으로 기대된다. 대퇴골에 대한 조 직병리학적 검사에서 대퇴골 원위부 골간단의 해면골 감소 가 대조약은 OVX 대조군에 비하여 유의성 있는 감소가 관 찰되었으며, 결명자 200 mg/kg 투여군에서도 감소가 관찰 되어 결명자가 해면골 감소를 억제시켜는 것으로 사료된다.

이상의 결과는 난소적출 후에 일어나는 골격 대사의 이상 에 결명자가 골 교체율 억제, 호르몬 변화, 항산화 신장기 능 회복 및 해면골 감소억제 등 유익하게 나타남으로써 임 상상 폐경기에 나타나는 골다공증을 어느 정도 예방시킬 수 있음을 시사하며, 폐경 후 여성의 골대사에 유익한 효과를 줄 것으로 사료된다.

사 사

본 연구는 한약진흥재단의 2016년도 한의약 기술 과학화 사업의 일환으로 수행된 연구결과이며, 지원에 감사 드립니다.

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(2016. 10. 14 접수; 2016. 12. 07 심사;

2016. 12. 16 게재확정)