서 문
수년전 최불암 시리즈가 유행한 적이 있었다. 실험실에 있던 최불암이 사탕을 좋아했는데 어느 날 시약장을 보니 여기저기 에“단거”라고 쓰인 병이 있는 것이었다. 다음 날 아침 최불암 은 쓰러진 채로 발견되었고 주위에는“danger”라고 표지된 약 병들이 뒹굴고 있었다는 이야기.
단 맛을 싫어하는 사람은 없다. 단 맛을 내는 당 즉, 탄수화 물은 핵산, 단백질, 지질과 함께 생물의 4대 요소 중 하나이지 만 극히 최근까지, 그리고 아직도 많은 사람들이 에너지원 정도 로 여기고 있다. 포도당 같은 탄수화물이 중요한 에너지원으로 쓰이고 있는 것은 사실이지만, 당이 생체 내에서 다른 분자들과 함께 복합체로서 다양한 형태로 존재하는 것을 발견하고 에너 지 외의 다른 역할에 대한 호기심을 가지게 됨으로서 시작된 新 학문이 있다. “당생물학”이 그 것으로 단어 자체도 겨우 20년 정도 밖에 되지 않았다. 지금은 옥스퍼드 대학의 당생물학 연구
소 소장이자 생화학과 학과장인 Raymond A. Dwek 교수가 1988년 영국의 텔레비전 모닝쇼에서 처음으로‘glycobiology’
라는 단어를 사용했었다. 지금도 유전학이니 생리학이니 하는 다른 생물학 분야에 비해 하고 있는 사람들도 많지 않고 이룩 한 성과도 상대적으로 부족하다 할 수 있다. 그러나 최근 들어 많은 연구가 진행되고 참여하는 연구자가 많아지면서 당생물학, 그리고 이를 바탕으로 하는 글라이코믹스에 대한 인식은 매우 달라지고 있다. 미국에서는 수년 전“Consortium for Func- tional Glycomics”라는 주제로 국립보건원 (NIH)에서 $34M의 연구비를 받아 단백질과 탄수화물간의 상호작용을 주로 연구하 였으며 그 후로 생물정보학 분야에서의 글라이코믹스 등 여러 연구비가 만들어져 활발한 활동을 하고 있다. 국내에서도 상대 적으로 소규모이지만 정부의 지원을 받아 연구가 시작되고 있 으니 참으로 다행한 일이라 하겠다.
글라이코믹스란 무엇일까? 풀이하자면 글라이코 (glyco-)는 달다는 뜻을, -ome은 전체, -ics는 방법론적인 학문을 말하는
1가톨릭대학교 생명공학부 Tel. 02-2164-4512 / Fax. 042-865-3419 / E-mail. yongil382@catholic.ac.kr
2한국생명공학연구원 단백질의약연구센터 Tel. 042-860-4457 / E-mail. dboh@kribb.re.kr
3한국생명공학연구원 단백질의약연구센터 Tel. 042-860-4378 / Fax. 042-860-4594 / E-mail. hyunkang@kribb.re.kr
4한국기초과학지원연구원 단백질체구조연구부 Tel. 042-865-3425 / Fax. 042-865-3419 / E-mail. shkim@kbsi.re.kr
달콤한 세상
- Glycomics; an Emerging Science and Technology -
것으로, 전체적으로는 당 (糖)을 포함하는 물질에 대해 기초와 응용을 아울러서 연구하는 학문 분야라 할 수 있겠다. 글라이코 믹스는 기존의 생물, 화학, 물리 등의 통합학문인 것이다.
단백질과 지질 등에 다양한 형태로 부가되는 탄수화물은 세 포내에서의 구조와 기능에 커다란 영향을 미친다. 모든 병의 시 작이라 할 수 있는 세균 감염이나 암, 면역 반응 등에서도 탄수 화물은 마치 사람의 눈처럼 인식하고 구분하는 역할을 포함해 서 매우 다양하고 중요한 역할을 수행하는 것을 알고 있다. 동 일한 탄수화물 분자가 당단백질, 당지질, 다당체, 배당체 등 다 양한 당복합체의 구성요소로 참여하거나 단당류의 형태로 존재 하는 특성상, 생명체에서 탄수화물의 역할과 기능을 전체적으로 보고자 하는 글라이코믹스 연구는 복잡하기도 하지만 역으로 보 아 그만큼 많은 시각과 부가가치를 생산할 수 있는 기회를 우 리에게 제공할 수 있다. 그러나 이에 대한 깊은 이해를 구하기 위해서는 다양한 분야에서의 연구를 훨씬 더 필요로 하는 것이 현재의 상황이라 할 수 있겠다. 본 논단에서는, 많은 종류의 당 복합체가 있지만 생체에서 가장 직접적인 행동을 하는 당단백 질을 주 대상으로 하여 구조와 기능을 알아보고 특히, 글라이코 믹스 분야에 근거한 첨단 생물의약품인 당단백질성 의약품의 개 발과 활용에 대해 살펴보고자 한다.
생체 물질 중 가장 복잡한 구조
탄수화물은 서문에서 언급했듯이 자연계에서 매우 다양한 형 태로 존재한다. 그 중에서도 당단백질의 당사슬 (oligosaccha- rides, glycan)은 당생물학의 발달을 저해하는 큰 요인이 되었 을 만큼 생체고분자 중 가장 복잡한 구조와 복잡성을 지닌다.
이는 근본적으로 당단백질 당사슬의 합성이 다른 종류의 과정 을 거쳐서 이루어지기 때문이다. 생체에는 주형을 토대로 하여 찍어내는 반응과 각 단계마다 모두 효소반응을 거쳐 이루어지 는 두 가지 모드의 생합성이 있다. 전자에는 DNA 복제나 mRNA 전사 (transcription), 단백질 생합성 (translation) 등이, 후자는 당사슬이나 지질 생합성이 해당된다. 당사슬은 직접적인 단백질 당화 (glycosylation)의 30여 단계를 포함한 약 200 단계의 효 소 반응을 거쳐 완성된다. 당화되기 위해 단백질은 수많은 종류 의 당전이효소 (glycosyltransferase)와 당분해효소 (glycosi- dase)가 둘러싸고 있는 길고 긴 터널을 지나야 한다. 이 과정에 서 자연스럽게 당단백질의 특징인 당사슬의 상이성 (hetero-
geneity)이 나타나게 되고 이를“glycoform”이라 한다.
당사슬 형태는 진화와 밀접하게 관련이 있어 (1, 그림 1), 효 모 등의 진균류, 곤충, 식물, 동물 등에서 서로 다르게 나타난 다. 세부적으로는 동물 종 사이에서도 약간의 차이가 발견되기 도 한다. 이는 당사슬이 질병이나 먹이 같은 외부 자극에 반응 하는 것과 연관이 있는 것으로 보인다. 단백질 당화의 유전적인 결함으로 발생하는“선천성 당화부전 (Congenital Disorder of Glycosylation, CDG)”(2)의 경우를 제외하고도 암, 호흡기질 환 등 질병에 의해서 후천적으로 당화 프로필이 변하거나 새로 운 구조의 당사슬이 나타나기도 한다. 또한, 봄 가을로 일년에 두 번 사육하는 누에는 생육환경의 변화에 의해서 당화 프로필 이 크게 다른 것을 발견할 수도 있다(3). 연구자들은 이러한 변 화가 실제적으로 무엇으로부터 어떻게 유래되었는지를 밝히고, 이에 대한 조절인자를 개발함으로써 병의 치료나 진단에 새로 운 방법을 제시할 수 있을 것으로 믿고 많은 노력을 경주하고 있다.
글라이코믹스가 새롭게 각광을 받고 있는 분야로는 재조합 단 백질로 대표되는 생물의약품이라 할 것이다. 아스피린을 비롯하 여 화학적 합성법으로 만들어지는 의약품은 전 세계적으로 약
$3천억의 거대 시장을 형성하고 있다. 시장의 일부라도 차지하 기 위해 Pfizer, Merck 등의 다국적 제약사들은 엄청난 연구개 발비를 쏟아붓고 있으며 대학이나 정부 연구소 등에서도 이를 위한 기초 연구에 자원의 많은 부분을 투자하고 있다. 문제는 유기합성으로 만들어지는 의약품 시장이 더 이상의 블록버스터 그림 1. 진화에 따른 당화의 차이(“Introduction to Glycobiology”
Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer (Eds))
를 만들지 못해 시장 규모는 답보하고 있다는 점이다. 그러나 재조합 단백질의약품 시장은 2003년 현재 전체 시장의 10%에 불과한 연 $300억 정도이지만 성장 속도가 2-30%에 달할 정 도로 급신장하고 있다 (그림 2). 흥미로운 점은 이들 재조합 단 백질의 대부분이 세포외 즉, 혈액으로 분비된다는 점이고 따라 서 당단백질이라는 점을 주목할 필요가 있다. 체외에서 단백질 을 세포내로 집어넣는 다는 것은 상당한 기술적 개발을 요구하 고 있는 것이 현실이므로, 혈액에서 작용할 수 있는 치료용 단 백질을 생산하여 주사로 주입할 수 있는 부분이 먼저 발전하고 있는 것이다. 여기에서 당사슬은 당단백질 의약품의 반감기와 활성에 결정적인 역할을 수행하고 있기 때문에 적절한 단백질 당화를 위해 연구자들은 많은 노력을 기울이고 있다.
생체고분자의 기능은 구조와 매우 밀접한 관계를 갖는다. 특 히, 구조가 매우 유사한 탄수화물을 기질로 사용하는 당전이효 소의 경우 단지 몇 개의 아미노산만 바뀌어 단백질 구조에는 큰 차이가 없을 것으로 예상되는데도 불구하고 다른 활성을 갖는 예를 흔히 볼 수 있다. 구조에 기반을 둔 기능 연구와 이의 활 용을 살펴보기 위해 우선 당사슬 구조가 만들어지기까지의 과 정과 대표적 단백질 당화, 그리고 특이한 일부 당화를 소개한다.
1. 당단백질 당사슬 생합성
단백질 당화는 서론에서 언급한 바와 같이 수많은 효소 반응 을 필요로 한다. 상상해보자. 생물종 (種), 기관, 세포, 나이, 질 병 등 모든 생물학적인 변수에 반응하여 다른 종류의 효소가, 혹은 같은 효소라도 다른 양만큼 발현될 수 있을 것이다. 음식, 기후 등의 환경적인 비생물학적 변수도 영향을 미칠 수 있다.
물론 이 같은 변수들이 DNA 복제 같은 주형의존적 반응에도 영향을 미치기는 하겠지만 최종 산물의 양적인 면에서만 차이
날 뿐 내부 구조가 틀려진다거나 하는 일은 거의 없다. 만일 있 다면 지나친 돌연변이로 인해 생물이 존재하기도 어려울 것이 다. 그러나 당화를 위한 효소들이 서로 다른 활성을 가지고 다 른 양으로 존재하는 두 시스템이 있다고 가정할 때, 단백질의 당화 조건이 다르게 존재하는 것이므로 동일 단백질이라 할지 라도 서로 다른 형태나 다른 프로필을 가진 당화가 이루어지는 것은 자연스러운 일이라 할 것이다. 유전자에서 극명하게 드러 나다시피 생명체를 유지하기 위해서는 보존이라는 개념이 최상 위를 이루는 것으로 알고 있었는 데 왜 이렇게 신은, 어찌 보면 무책임한, 상황을 만들어 놓은 것일까? 아마도 그 해답은 적응 에 있다고 필자는 생각한다. 기본 질서 보존과 현실에의 적응은 상호보완적인 것으로, 적어도 이 지구라는 자연에서 생명체를 유지하는 데 있어서 가장 근본이 될 수 있는 두 가지 원리인 것 이다. 그리고 적응은 당단백질 당사슬에서 glycoform이라는 형 태로 나타나고 있다.
적응이라는 가치를 실현하기 위해 당화 효소들은 소포체 (endoplasmic reticulum)와 골지 (Golgi apparatus)에 적절한 순서를 가지고 종류별로 배열되어 있다. 소포체와 골지는 내부 와 막상에 단백질 당화에 필요한 각종 효소와 chaperon을 포함 하고 있으며 여러 층의 막 구조물과 vesicle로 이루어져 있다.
예전에는 이 들 막 구조물이 서로 완전히 분리된 것으로 알려 져 있었으나 전자현미경이나 여러 생화학적인 연구결과들은 층 간에 매우 빠르고 연속적으로 연결과 끊어짐이 반복되는 것으 그림 2. 2003년 생물의약품 시장. Ernst&Young, Resilience:
Americas Biotechnology Report 2003.
그림 3. 당단백질이 생체에서 위치하는 곳 (“Introduction to Glycobiology”Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer (Eds)).
로 보고하고 있다 (4). 즉, 당화되는 단백질은 효소들이 널려있 는 터널을 통과하면서 필요한 효소와 상호작용을 하고 이때 필 요한 당이 기질로서 적절하게 공급되면 비로소 하나의 반응이 완성되면서 다음 반응을 다시 준비하게 된다. 이런 과정들이 반 복되다가 골지의 끝에 도달하게 되면 당단백질은 자기가 가야 할 곳으로 이동하게 된다. 이를 단백질 sorting이라 한다 (5, 6).
일반적인 당단백질은 생체 내에서 다음 세 가지의 장소에 머 무를 운명을 가지고 태어난다 (그림 3). 첫째는, 혈액이나 체액 같은 세포외의 장소이다. 골지에서 만들어져 세포외로 분비되는 수용성 단백질은 호르몬이나 항체가 많으며, 체내를 돌아다니면 서 수용체와 반응하여 신호를 전달하거나 면역작용에 관여한다.
물론 이 중에는 당단백질이 아닌 경우도 있으며 이는 다음 장 에서 얘기할 기회가 있을 것이다. 당단백질이 수용체나 다른 단 백질과 상호작용을 할 때는 많은 경우에 단백질-탄수화물 간에 이루어진다. 탄수화물에 결합하는 단백질을 렉틴이라 하며 사람 뿐만 아니라 대부분의 생명체에 존재하고 그 종류는 수천가지 에 이른다고 알려져 있다. 당사슬 구조에 따라 렉틴이 결합하는 정도는 차이가 나며, 말했듯이 glycoform의 형태로 존재하는 당 사슬을 한 분자가 아닌 집단으로 바라보았을 때 전체적 결합 정 도는 당화 프로필에 의해 영향을 받을 것이다. 분비된 당단백질 이나 수용체 어느 것이나 렉틴 활성을 가지고 있을 수 있으며 이를 통해 상호작용을 하고 신호전달을 이끌어낸다.
두번째는, 막단백질과 세포 바깥 표면에 머무르는 점액 (mucus)을 포함한 extracellular matrix이다. 약물표적의 반 이 상을 차지할 만큼 막단백질은 중요하지만 당사슬이 발달되어 있 고 지질과 함께 구조를 이루어야만 하는 특성 때문에 실제 연 구는 답보상태였다. 또한, 발현되는 곳이 생체막이라는 한정된 공간에서만 가능하다는 특성상 많은 양의 단백질을 필요로 하 는 구조연구를 하기에는 최악의 소재인 것이다. 최근 들어, 천 연 지질을 대신할 수 있는 대체품이 많이 개발되고 있고 생산 이나 정제에 대한 방법 및 도구가 많이 연구되면서 막단백질 구 조에 대한 보고도 점차 늘어나고 있다. 세포 표면에 있는 대표 적 당단백질인 뮤신은 탄수화물 함량이 전체의 반 이상을 차지 하고 그 대부분이O-당화로 구성되어있다. 사람에서 약 20 종 류가 알려져 있으며 코, 폐, 장 등 각 기관에 따라 뮤신의 종류 와 비율은 다르게 분포한다. 특히 많이 연구된 경우는 백인에게 서 주로 나타나는“cystic fibrosis”라는 호흡기질환으로 뮤신의 종류는 물론 당사슬 구조와 프로필이 다르게 나타나는 것으로
확인되고 있다.
마지막으로, 당단백질은 세포 내 소기관에 존재한다. 유통기 한이 지난 단백질이나 외부로부터 침투한 이물질을 처리하는 곳 으로서 리소좀(lysosome)이 있다. 이 곳에 가기 위해서는 다른 당단백질과 달리 특별한 표식을 필요로 하며, N-당사슬의 구성 요소인α-만노오스에 인산기가 붙는 것이 그 것이다. 이들은 생 산된 다음 특별대우를 받으며 리소좀으로 옮겨가게 된다. 식물 세포에서는“protein body”라고 하는 소기관이 콩이나 쌀 등의 종자에서 나타난다. 아직까지 특별한 기능이 알려지지 않았으나 주로 저장단백질이 모여 잇는 것으로 보아 새로운 생명으로 자 라날 때 필요한 영양분을 공급하는 것으로 여겨지고 있다. 아직 까지 어떻게 당단백질이“protein body”로 가는지에 대해서는 연구되어 있지 않다. 리소좀처럼 특별한 표식이 ”protein body”
로 가는 당단백질의 당사슬에 있을 수도 있을 것이다.
2. N-당화
단백질은 리보좀 (ribosome)을 통하여 생합성되고 리보좀이 소포체와 연계되면 당단백질로 발달할 수 있는 가능성을 가진 다. 이때 필요한 탄수화물은 일반적인 형태가 아닌 GDP-만노 오스 (mannose), UDP-포도당, CMP-시알산(sialic acid) 등처 럼 핵산당 (nucleotide-sugar)으로 활성화되어 있어야 한다. 직 접적 당화는“dolichol”이라는 지질로부터 시작된다. 여기에 GDP-N-acetylglucosamine (GlcNAc)으로부터 GlcNAc-phos- phate가 옮겨와 dolichol-pp-GlcNAc가 되고, 계속되는 반응으 로 세포질에서 dolichol-pp-Man5GlcNAc2까지 만들어지면 fli- pase라는 효소의 도움을 받아 소포체 내부로 들어간다. 다시 만 노오스가 4개 더 붙게 되는 데 이때는 dolichol-pp-만노오스로 부터 공급받는다. 그리고 포도당이 3개 더 붙어서 당사슬 전구 체로서 완성된다. 즉, 14개의 단당류가 연결된 Glc3Man9Glc- NAc2가 3개의 가지를 가지고 dolichol위에 만들어 진 것이다 (7).
Asparagine의 질소에 연결되는 N-당화를 위해선 특별한 아 미노산 서열이 필요하다. Asn-Xaa (proline을 제외한 아미노 산)-Ser/Thr이 그것으로서 가운데 오는 아미노산의 종류에 따라 당화율은 영향을 받는다. Glycine이나 alanine처럼 작은 아미노 산이 오면 잘 되고 lysine이나 methionine처럼 크면 잘 안되는 것으로 알려져 있다. 따라서 해당되는 서열이 없는 알부민 같은 당단백질과 같은 길을 거쳐서 혈액으로 분비되지만 당단백질은
아니다. 당화에는 단백질의 전체적 conformation과 함께 지역 적 구조 등도 영향을 미친다. 이러한 서열이 존재함에도 불구하 고 약 10-30%가 당화되지 않는 것으로 알려져 당화의 복잡성 을 더욱 증가시키고 있기도 하다. 최근에는 Asn-Xaa-Cys의 서 열에서 N-당화가 이루어지는 경우가 일부 발견되기도 하였다 (8). Translation되는 펩티드에서 위와 같은 서열이 발견되면 oligosaccharyltransferase라는 효소는 준비된 당사슬 전구체를 통째로 지질로부터 펩티드로 옮겨서 당펩티드를 생성하게 된다.
당화가 post-traslational modification의 대표적인 것으로 잘 알 려져 있지만 실제로 N-당화는 co-translational modification인 것이다.
옮겨오자마자 맨 끝의 포도당이 잘려나간다. 그리고 다음 포 도당, 또 다음 포도당이 좀 더 천천히 제거되면서 당펩티드는 접힘을 완성하게 된다. 그리고 생체는 모든 포도당이 잘려나가 면 단백질 접힘이 일단 완료된 것으로 인지하고 다음 과정을 준 비한다. 여기에 한번 더 검증하는 과정이 있어, 적절한 단백질 접힘이 이루어져 있지 않으면 다시 포도당 한 분자를 붙여 접 힘을 완성할 수 있는 기회를 주는 과정을 반복한다. 여기까지의 과정은 모든 효모에서 척추동물에 이르는 모든 진핵생물에서 동 일하다. 인간인 내가 하고 있는 일을 곰팡이도 하고 있는 것이 다. 정말 신기한 일이 아닐 수 없다.
접힘이 완료된 당단백질은 골지로 옮겨와 다듬는 과정을 계 속하게 된다. 생물종에 따라 효모 등 곰팡이에서 주로 나타나는 high-만노오스 形, 포유류에서 나타나는 복잡형, 그리고 복잡형 과 만노오스가 같이 나타나는 혼합형으로 발달하게 된다. 그러 나 형태의 종류에 관계없이 N-당화에서는 모두 Man3GlcNAc2
로 이루어진 5당류가 핵심구조로 나타나는 특징을 가진다.
3. O-당화
O-당화는 여러 가지 면에서 흥미로운 점을 갖는다. 첫째는 골 지에서 당화가 시작된다는 것으로, 완전히 단백질 접힘이 끝난 상태에서 당이 하나씩 부가된다. 즉, post-translational modifi- cation이다. N-당화와 달리 특별한 아미노산 서열이 없이 ser- ine이나 threonine의 산소에 연결되는 O-당화이긴 하지만 부근 아미노산들을 살펴보면 serine이나 threonine이 반복적으로 나 타나고 proline도 매우 많이 나타나는 것으로 보아 지역적 소수 성이 영향을 많이 미치고 있음을 알 수 있다. 최근, 독일 과학 자들은, 아직 완전치는 못하지만, 아미노산 서열만 가지고 O-당
화가 생성되는 장소를 추정하는 프로그램을 개발하여 공개하기 도 하였다(9).
O-당화는 매우 다양한 형태로 나타나지만 대표적인 경우는 뮤신形으로서 N-acetylgalactosamine으로부터 시작하는 것이 특 징이다. 연구자에 따라 4-8가지의 핵심구조를 언급하는 것으로 보아 뮤신形에서도 여러 가지가 있음을 알 수 있다. 즉, N-당화 에 비해 변이가 매우 심한 편으로, 이는 외부 환경의 변화를 상 대적으로 잘 반영하는 것으로 해석할 수도 있을 것이다. N-당 화와 함께 O-당화의 변화를 잘 분석해낼 수 있다면, 예를 들어, 질병의 진행정도에 대한 중장기적 모니터링도 가능할 수 있을 것으로 생각된다. 이와 같은 개념을 발달시켜 글라이코믹스 기 술에 의한 질병의 진단과 치료 방법을 연구하는 과학자들도 많 아지고 있다.
최근 들어, 세포질에서의 O-당화에 대한 연구가 활발해지고 있다. 세포질에서의 당화는 없는 것으로 생각했었지만 GlcNAc 이 하나 결합되는 O-당화가 세포질 및 핵막 단백질에서 발견된 것이다. 그 것도 일부가 아닌 엄청나게 많은 수의 단백질이 O- GlcNAcylation되어 있는 것이 밝혀졌고 이에 관련된 효소들도 보고되었다. 흥미로운 사실은 동일한 아미노산에서 신호전달에 서 결정적 역할을 하는 인산화가 이루어진다는 점으로 O-Glc- NAc가 인산화의 antagonist로 작용하고 있지는 않은가에 대한 연구가 미국과 한국 등에서 활발히 진행되고 있다 (10).
그 외에도 mannosylation, glucosylation, fucosylation 등 O-당화는 정말 다양한 모습으로 나타나 연구자를 즐겁게 한다.
앞으로도 새로운 당화 형태가 얼마나 나타날지는 짐작하기 어 렵지만 이는 분명 생물학자들의 가슴을 뛰놀게 할 소재임에는 틀림없을 것이다.
당복합체의 생물학적 기능
1970년대 중반까지만 해도 탄수화물 연구는 셀룰로오스, 전 분 등 주로 식물이나 미생물의 호모 다당류 등에 대한 기초적 인 분석과, 식품산업 등에의 이용에 국한되었었다. 그러다 당단 백질, 당지질, proteoglycan 등을 대변하는“glycoconjugates (당복합체)”라는 용어가 생겨나고, 1975년에 와이즈만 연구소 의 Nathan Sharon이“많은 자연 폴리머 (polymer)들의 특이 성 (specificity)이 아미노산이나 핵산이 아닌 탄수화물에 의해 결정된다”고 하였으며, 이후 당화의 생물학적인 활성에 관한 연
구 발표가 빈번하게 이루어졌으나, 여전히 그 중요성이 폭넓게 인식되지 못하였다. 그러나 이시기에 구조다당 및 세포외 다당 류의 생합성 과정, 효소학적 연구, 분리 정제 및 구조분석을 위 한 생화학적 및 NMR, MS 등 기기분석적 연구가 활발히 이루 어 졌으며, 이러한 탄수화물생화학의 발전은 향후 80년대 중반 부터 시작되는 당생물학의 태동에 중요한 기반이 되었다.
1980년대 초에, Montreuil (11), Kornfeld 등 (12)에 의해, 당단백질 당사슬 (N- and O-당화)의 구조 및 생합성 과정, 당 전이 및 당분해효소, 이들 당들의 생물학적 활성 등에 관한 review가 발표되면서, 단백질 및 지질 당화의 중요성이 폭넓게 인식되기 시작하였다. 1985년에 미국 국립 복합탄수화물연구소 (CCRC)가 설립되었으며, 영국과 일본 등에서도 탄수화물 전문 연구소나 연구그룹들이 형성되어 생체 당복합체의 구조와 기능 해석연구 (functional glycomics)가 활발히 시작되었다. 1990년 대 초반에는 생화학, 미생물학, 분자생물학, 면역학, 세포생물학 등 생물학 전반에 걸쳐 당화에 관한 폭넓은 연구가 진행되었거 나 시작되었다. 이후 생물체에 폭넓게 존재하는 당사슬이 단백 질의 3차구조 접힘과 수송 (protein folding and targeting), 단 백질-단백질 상호인식 및 상호작용 (protein-protein recognition and interaction), 세포와 세포간 상호인식 및 상호반응 (cell-
cell recognition and interaction), 병원성 미생물과 동물 host 간의 상호작용 등에 관여하여, 암의 전이, 여러 가지 유전질병, 바이러스나 미생물 및 선충 등의 감염 등 다양한 질병, 면역, 수 정, 세포분화 및 조직발달 등 다양한 생명현상에 관여한다는 것 이 밝혀지면서, 기존의 유전체학과 단백질체학 연구로 밝힐 수 없었던 생명현상들이 규명되기 시작하였다 (13, 14) (표 1).
당복합체의 구조는 각각의 해당 당단백질이나 당지질에 본연 의 생물학적 기능을 부여하며, 당화 여부 및 당사슬 구조의 변 화에 따라 해당 당단백질의 기능 또는 상대 리간드의 활성을 조 절하게 된다. 특정 구조의 당사슬을 수용체로 혹은 리간드로 인 식하고 결합하는 단백질군을 통칭하여 렉틴 (lectin)이라 하며, 당사슬의 생물학적인 기능은 결국 당사슬과 이들 렉틴간의 상 호 작용에 의해 결정된다고 하겠다. 현재까지도 많은 당복합체 의 당사슬의 구조와 기능이 밝혀지지 않은 부분이 많이 있다.
본 논단에서는 주로 당단백질 및 당지질에 결합되어 있는 당복 합체의 물리화학적 및 생물학적 기능에 대해 소개하고자 한다.
1. 당질화와 단백질의 물리, 화학적 성질
당단백질에 결합되어 있는 당사슬은 단백질에 정상적인 3차 구조 접힘 및 열안정성 부여 등 단백질의 물리, 화학적 성질을 결정하거나 변화시킨다. 당단백질의 당사슬은 소포체에서 새롭 게 생합성되고 있는 펩타이드의 접힘에 기여하고 최종 단백질 의 3차구조를 안정화시킴으로서 결과적으로 단백질의 활성에 기 여한다. 인간 혈장의β2-glycoprotein I으로 부터 효소적으로 당 사슬 부분을 제거하였을 경우 2차 구조에 현저한 변화가 생겨 3차구조가 변형되었으며, 이는 당사슬 부분이 펩타이드 사슬의 입체구조를 유지하는데 중요하다는 것을 보여 준다. 당단백질에 결합되어 있는 당사슬은 펩타이드와 수소결합을 통해 단백질을 안정화 시킬 수도 있으며, 당사슬은 단백질 표면을 광범위하게 감싸기 때문에 단백질의 열안정성 (heat stability)에 기여한다.
또한, 단백질 분해효소의 공격으로부터 당단백질을 보호하는 것 으로 보고되었다 (13).
2. 신규 생합성되는 당단백질의 세포내 이동 표식 세포표면 수용체 막단백질은 대부분이 당단백질로서 소포체 에서 생합성될 때 정상적으로 당질화 되지 않으면 골지 복합체 를 거쳐 세포막으로 이동 (targeting)하지 못한다 (15)(그림 4).
Ribosome으로부터 소포체에서 새롭게 생합성 되는 펩타이드에
Type Functions
Modify solubility, electrical charge, mass, size, and viscosity in solution Phycochemical Control protein folding
Stabilize protein conformation
confer thermal stability and protection against proteolysis
Regulate intracellualr traffic and local- ization of glycoproteins
Determine lifetime of glycoproteins in circulation
Modify immunological properties Biological modulate activity of enzymes and hor-
mones
Act as cell surface receptors for lectins, antibodies, toxins, etc.
Participate in cell-cell recognition, inter- action and signal transduction
(Lis H, Sharon N. 1993. Eur. J. Biochem. 218, 1-27.) 표 1. Biological functions of glycoprotein glycans
당사슬이 결합되면 분자 샤페론 (molecular chaperon)인 cal- nexin이 당사슬 비환원말단의 glucose를 인식하고 결합하여 폴 리펩타이드의 정상적인 접힘을 유도하는데, 만일 당화가 제대로 일어나지 않은 경우 calnexin이 결합하지 못하고, 풀린 상태에 있는 펩타이드는 서로 소수성 상호작용에 의해 엉겨 붙거나 분 해되어 세포 밖으로 제대로 분비되지 못하게 된다. 생체 고분자 의 세포내 분해장소인 리소좀에는 다양한 분해효소 (hydrolases) 가 존재한다. 이들 효소 단백질이 소포체에서 생합성되어 골지 를 거쳐 리소좀으로 이동되는 표식의 하나가 골지에서 단백질 의 당질화 수식과정 중에 만노오스가 인산화 되어 생성되는 man- nose 6-phosphate (M6P)이며, 골지막에 있는 M6P 수용체 단 백질 (렉틴의 일종)이 M6P로 표식된 단백질들을 결합하여 lyso- some으로 이동하게 된다 (12, 14). 만일 이러한 분해효소에 당 질화가 정상적으로 일어나지 않거나, M6P 수용체 단백질 발현 및 기능에 이상이 있으면, 이들 효소가 리소좀으로 이동하지 못 하게 되어, lysosome에서 분해되어야 할 당단백질이나 당지질 이 분해되지 않고 축적되어 I-세포 질병 (I-cell disease) 등 치 명적인 질환을 야기 한다. 리소좀에서 스핑고당지질의 분해 이 상으로 생기는 고셔병 (Gaucher’s disease)은 당복합체 분해대 사 이상으로 생기는 대표적 유전질병이다.
3. 당단백질 수명 표식 및 사멸세포의 제거
당단백질의 당사슬 구조의 변화는 동물 혈액 등 순환계 시스
템으로부터 당단백질을 단백질 가수분해로 제거하는데 표식으 로 작용함으로서 제거될 운명에 있는 당단백질의 수명을 결정 한다. 당단백질 N-당사슬의 시알산이 제거되고 노출된 말단β- galactose를 인식하는 렉틴의 일종인 수용체 (hepatic asialo- glycoprotein receptor)에 의해 혈액내에서 단백질이 신속히 제 거된다. 즉, 비환원 말단의 시알산이 해당 당단백질을 보호하는 역할을 한다고 볼 수 있다. 재조합 EPO 단백질의 경우 in vivo 활성 감소의 한 원인은 동물세포가 아닌 식물 등에서 발현시켰 을 경우, N-당사슬 비환원 말단의 시알산이 없어 노출된 말단 β-galactose로 인해 상기 수용체에 의해 혈액내에서 단백질이 신속히 제거되기 때문으로 생각된다 (16). 아직 자세한 기작이 명확히 밝혀지지는 않았지만 단백질 뿐 만 아니라, apoptosis로 사멸된 세포를 통째로 제거하는 데에도 이와 유사한 기작이 작 용하는 것으로 일부 보고되고 있다. 사멸 동안에 세포표면 시알 산의 손실 등 당사슬의 구조 변화가 일어나며, 이로 인해 새롭 게 노출된 특정 구조의 당사슬을 대식세포 표면의 특정 수용체 가 인식하여 결합하고 식균작용으로 사멸세포를 제거하는 것으 로 보고되었다 (17).
4. 당질화와 당단백질 효소의 촉매활성
혈액 응고 활성을 갖는 플라스미노겐 활성화 인자 (tPA)는 serine protease로서 3개의 N-당화 결합부위를 갖는데, Asn117 은 만노스형 당사슬이, Asn184와 Asn448는 복합형 (complex- type N-glycans)으로 당화 되어 있다. Type I은 3개 부위 모 두 당질화 되어 있고, type II는 Asn117과 Asn448에만 당질 화 되어있는데, 이들 두가지 타입의 단백질이 저해제에 의한 촉 매 활성 저해 정도가 다르며, 나아가 CHO cell에서 발현된 재 조합 tPA 단백질의 경우, Asn448 부위의 변형된 당사슬 구조 가 tPA의 촉매활성에 영향을 주는 것으로 보고되었다 (18).
5. 세포표면 당사슬화 수용체와 호르몬 단백질의 기 능
호르몬 당단백질인 hCG의 경우, site-directed mutagenesis 로α-chain의 Asn52에만 당화 시키면 호르몬 활성이 여전히 충분하여 신호전달이 정상적으로 일어났으나, β-chain의 Asn13 에 당질화된 경우, 활성이 중간 정도로 줄었고, Asn30에 당질 화 된 경우는 불활성으로 되었다. 최근에, 비당화 (deglycosy- lation)된 hCG의 경우 정상 hCG에 비해 수용체의 다른 도메 그림 4. Glycoconjugate biosynthesis and cell surface recog-
nition.(Bertozzi CR, Kiessling LL. Chemical glycobiology.
Science. 291, 2357-2364.)
인에 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 아마도 이것이 수용체와 결 합은 하되 신호전달이 이루어지지 않은 결과를 나타낸 것으로 보인다 (13). 다른 호르몬인 EPO의 경우, 당사슬을 제거하면 in vitro 실험에서 수용체에 결합 친화도 (affinity)가 오히려 증가 하고 정상적인 활성을 보였으나, in vivo 활성은 감소하였다 (16). in vivo 활성의 감소는 비당화 또는, 불완전한 당화에 의 해 N-당사슬의 시알산이 없어 노출된 말단β-Gal에 대한 수용 체에 의해 단백질이 신속히 제거되기 때문으로 생각된다. 재조 합 EPO의 경우, biantennary 구조보다 tetraantennary 구조가 많을수록 in vivo 활성이 높으며, O-당화는 in vitro나 in vivo 모두에서 활성에 무관한 것으로 보고되었다(16).
6. 세포 표면 당사슬 수용체와 세포-세포 상호 작용, 병원체 감염 및 공생
세포표면 수용체 당단백질들이 소포체에서 정상적으로 당화 되어 골지를 거쳐 세포막으로 이동하면, 이들의 특정 당사슬 구
조가 다양한 바이러스, 세균, 기생충, 독소 단백질에 대해 고도 의 특이성을 갖는 수용체로 작용한다(표 2). 이들 수용체의 당 사슬은 세포와 세포간 상호 작용 및 신호전달, 단백질 리간드와 세포간 상호작용 등에 관여한다(그림 4). 인플루엔자 바이러스 표면의 haemagglutinin 단백질은 숙주 세포의 세포막 단백질 (glycophorin A)에 결합되어 있는 O-당사슬의 시알산을 수용 체로 인식하여 결합하고, 콜레라 독소 단백질은 세포막 스핑고 당지질인 ganglioside GM1의 특정 당사슬 구조를 수용체로 인 식하여 결합한다. Helicobacter pylori 세포 표면의 렉틴 단백 질은 위벽 조직 상피세포 표면의 Leb 구조 (blood group anti- gen, Fucα1,2Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAcβ)를 높은 특이성으로 인식하여 결합한다 (19). 이외에도 다양한 병원성 세균이나 공 생 생물체가 특정구조의 당사슬을 수용체로 인식하여 결합하게 되고, 이러한 숙주 조직에의 부착이 감염성 질환 발병의 시작점 이 되거나, 동물의 장내 세균이나 식물의 뿌리 노듈 형성 세균 과 같은 공생 생물체와 숙주간의 공생관계를 유지시켜 준다 (14,
Carbohydrate
Organism Target tissue
Structure Predominant
form Viruses
Influenza type A respiratory tract NeuAc(α2-6)Gal GP
Influenza type B respiratory tract NeuAc(α2-3)Gal GP
Influenza type C respiratory tract 9-O-aceuAc(α2-3)Gal GP
Bacteria
E. coli type 1 urinary tract Man(α1-3){Man(α1-3)[Man(α1-6)]Man(α1-6)}Man(β1-4)- GP
E. coli type P urinary tract Gal(α1-4)Gal GSL
E. coli type S neural NeuAc(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc GSL
E. coli type CFA/1 intestine NeuAc(α2-8)- GSL
E. coli type K99 Intestine NeuGc(α2-3)Gal(β1-4)Glc GSL
Actinomyces naeslundii oral GalNAc(β1-3)Galβ GP
Neisseria gonorrhoea genital Gal(β1-4)Glcβ GSL
NeuAc(α2-3)Gal(β1-4)GlcNAc GP
Streptococcus pneumonia respiratory tract GlcNAc(β1-3)Gal GP
Fungi
Candida albicans skin and mucosa Gal(β1-4)Glc GSL
Protozoa
Entamoeba histolytica intestine Gal(β1-4)GlcNAc GP
Giardia lamblia intestine Man-6-P
GP = glycoprotein; GSL = glycosphingolipid.
(Lis H, Sharon N. 1993. Eur. J. Biochem. 218, 1-27.)
표 2. Carbohydrates as attachment sites for infectious agents
19).
7. 당복합체와 면역 및 수정, 분화, 발달
당단백질이나 당지질에 결합된 특정 구조의 당사슬이 인간 ABO 혈액형 결정인자라는 것은 잘 알려진 사실이다. 항원과 항체간의 상호 반응은 항체 단백질의 당화와 당사슬 구조에 의 해 영향을 받는다. Anti-(α-1,6 dextran) MAb의 경우, heavy chain의 가변부위 (variable region)의 Asn58 부위에 당화 부 위를 도입하였을 경우, 당화 되지 않은 경우에 비해 15배 높게 항원에 결합하였다. IgG의 constant region에서 당사슬을 제거 하였을 경우에 항원과의 결합은 영향을 받지 않았지만, 대식세 포의 Fc 수용체에 결합하지 않았다.
세포표면 당사슬은 세포성 면역 기능에도 관여한다. 정상세포 가 암화되면 세포표면에 Galα-1,3Galβ4GlcNAc 등 다양한 비 정상적 구조의 당사슬이 발현된다 (13, 20). NK 세포는 정상 세포와 암세포를 구분하여 공격하게 되는데, 예를 들어, NK 세 포는 복합형 당사슬을 발현하는 정상세포 보다 만노스형이나 혼 합형만을 합성하는 CHO 세포의 돌연변이를 선택하여 공격한 다(13). B 세포는 Galα-1,3Galβ4GlcNAc 구조를 인식하여 이 에 특이적인 항체를 생산한다.
당복합체는 수정과정에도 관여하는데, 마우스의 정자세포의 세포막 단백질인β-1,4 galactosyltransferase가난자표면의ZP3 단백질의 O-당사슬의 말단α-galactose를 선택적으로 인식하고 결합함으로서 수정 과정이 시작된다. 무지개 송어의 경우 난자 표면에 있는 polysialic acid의 일종인 poly-KDN이 없으면 수 정이 되지 않는다. 세포 표면 당사슬은 신경세포, 면역세포 등 다양한 세포의 분화와 기관 발달 및 조절에도 폭 넓게 관여한 다. T 세포가 분화되어 발달 성숙해 감에 따라 세포표면 Galβ1- 3GalNAc에 시알산 발현이 증가한다. 신경계 발달에 있어 신경 세포간의 교류는 필수적으로, 신경세포의 분화와 발달 과정에도 세포 표면 당사슬이 관여한다. 특히, 신경세포 막단백질인 neur- al cell adhesion molecule (NCAM)의 polysialic acid (PSA) 는 배아 상태와 발달 과정 동안에는 고도로 발현되어 있지만 성 인의 NCAM에는 PSA의 발현이 현저히 줄어 있다. 또한, PSA 는 신경 세포의 분화 초기에 NCAM에 고도로 발현되어 있으 나 그 발현이 감소하면서 신경세포의 축삭 (axon)이 자라나는 것으로 보고됨에 따라 세포표면 NCAM-PSA 발현 조절이 신 경계 발달 과정에 중요한 인자인 것으로 보인다.
생물의약품
2001년 인간 지놈 프로젝트의 완성 이후 대량의 데이터 분 석을 특징으로 하는 이른바‘~omics’기술의 붐이 유전자, 단 백질에 이어 제 3의 정보 고분자로 일컬어지는“당사슬(Gly- can)”로 옮아가 바야흐로 글라이코믹스(Glycomics) 시대가 도 래되었다. 글라이코믹스 기술을 활용한 새로운 개념의 신약 개 발 연구는 미국과 일본 등의 선진국에서 현재 큰 주목을 받고 있다. Glycome의 구조와 기능 분석 정보를 토대로 신약 개발 을 위한 새로운 당사슬 마커 발굴과 더불어 의약품 소재들의 당 사슬을 리모델링함으로서 그 효능이나 안정성이 현격히 증대된 고성능의 차세대 의약품을 개발하려는 연구 분야는 바이오 의 약 산업의 핵심 미래 원천기술 분야로 대두되고 있다 (21).
현재까지의 의약 시장은 화학합성 의약품이 대부분을 차지하 여 왔으나, 연평균 20% 이상의 고성장을 보이는 바이오 의약 품들이 의약 시장의 주력으로 빠르게 자리 잡아 가고 있다 (22).
이들 바이오 의약품 시장은 그 특성상 거대한 매출을 올리는 블 록버스터 제품들에 대한 의존성이 매우 높은 편인데, 초기 블록 버스터 제품들의 특허 만료가 임박해 오면서 바이오 제너릭 시
그림 5. 당사슬 리모델링을 통한 차세대 EPO 및 저분자 헤파 린 제품 개발 사례
(A) Amgen은 Epogen 의 차세대 버전으로 2개의 N-glycosylation 위 치가 증가한 AranespTM를 개발 상용화하였음. (B) 천연 헤파린의 항 응고 작용에 필요 없는 부위들을 제거해서 부작용이 감소된 저분자 헤파 린(Aventis사의 Lovenox , Pfizer사의 Frgmin , DuPont사의 Inno-
대를 목전에 두고 있다. 따라서, 다국적 제약 기업 및 선진 바 이오 기업들은 기존 오리지널 제품보다 성능이 획기적으로 향 상된 차세대 버전을 개발하여 지속적으로 시장을 점유하려는 전 략으로 다가오는 바이오 제너릭 시대에 대비하고 있다. 이러한 차세대 버전(개량형 바이오 신약) 개발을 위한 전략으로 글라이 코믹스 연구에 기반을 둔 당사슬 공학 기술이 활발히 사용되고 있으며, 그 대표적인 사례로 EPO의 차세대 버전인 Aranesp 와 천연 헤파린의 부작용을 없앤 저분자 및 합성 헤파린 제품 들이 성공적으로 개발되어 의약 시장에서 그 유용성이 이미 입 증되었다 (그림 5).
글라이코믹스 연구에 기반을 둔 의약품 개발 기술의 범주에 는 당사슬의 구조와 기능 분석을 통한 표적 발굴 기술, 의약품 개발 및 대량생산 기술 등이 폭넓게 포함된다. 본 논단에서는 현재 산업적으로 큰 관심을 받고 있는 개량형 바이오 신약 개 발을 위한 당사슬 공학 기술들과 대표적인 성공 사례들 위주로 최근의 연구 개발 현황을 살펴보고자 한다.
당사슬 공학을 통한 바이오 의약품 개발 연구 현황
단백질들을 비롯한 의약품 소재에 부착되어 있는 당사슬의 성 분 및 구조는 치료 효능과 인체 내 체류 시간, 약리 활성 및 면 역 반응 등에 큰 영향을 미치게 된다. 따라서, 의약품의 당사슬 구조를 최적 상태로 만들어서 치료 효능과 안정성을 증진시키 고 면역 반응과 같은 부작용을 줄이려는 연구가 활발히 이뤄지 고 있다. 이런 연구로 기존 의약품들을 개량해 새로운 질병 치 료제를 만들 수 있을 뿐만 아니라 투여량을 줄여서 가격을 낮 출 수 있다. 또한, 투여 간격을 늘려 환자의 삶의 질 향상에 이 바지 할 수도 있다. 최적의 당사슬 부착으로 의약품의 성능 향 상을 이루어 개량형 바이오 신약을 개발하는 전략은 크게 네 가 지 기술 분야, ①당단백질 의약품 개발 기술, ②당사슬 제어 생 산 기술, ③탄수화물 및 ④배당체 의약품 개발 기술에서 큰 각 광을 받고 있다.
1. 당단백질 의약품
최근 급속도로 증가하고 있는 의약품 시장의 가장 두드러진 특징 중의 하나는 재조합 단백질 의약품의 빠른 성장으로 지난 10년간 시장 규모가 4배 이상 성장하였고, 2005년에 이미 500
억불을 넘어서 전체 의약품 시장 규모의 10%를 차지하고 있다 (23). 현재 재조합 단백질 의약품 시장은 EPO와 인터페론 등 과 같은 블록버스터들이 주도하고 있으며 그 의존도가 70%를 상회하고 있지만 대부분 특허 만료가 임박한 상황이다. 이러한 상황에 맞서서 다국적 제약회사 및 선진 바이오 업체들은 당사 슬 변형 등의 첨단 생명공학 기술들을 활용하여 약효 및 지속 성이 향상된 차세대 버전을 출시하여 계속해서 시장을 점유하 려는 노력을 기울이고 있다(24).
EPO (erythropoietin): EPO는 신장에서 만들어지는 조혈 인자로 악성 빈혈 환자, 만성 신부전 환자 등에 사용되며 전체 시장 규모가 100억 달러에 달하는 최고의 바이오 블록버스터이 다. Amgen은 Epogen 의 차세대 제품으로서 N-당화 부위를 증 가시켜서 시알산 함량이 증가한 AranespTM를 개발하여 성공 적으로 상용화함으로써 글라이코믹스 이용 기술이 의약용 단백 질의 성능 향상에 매우 효율적인 전략임을 입증하였다. Arane- spTM는 2001년 시장에 처음 진입하여 2003년에는 15억불의 매출을 이루었고, 2005년에는 33억불의 매출을 올리는 경이적 인 신장세 (연성장률 50% 이상)를 보이며 거의 선두에 근접하 고 있다(25). 이와 같은 상승 추세를 고려하면, 2010년에는 Epogen 과 Procrit 과 같은 기존 제품들을 제치고 전체 EPO 제품 시장의 30% 이상을 차지하며 베스트셀러에 오를 것으로 전망되고 있다. 또한, 미국 Neose사는 GlycoPEGylation이라는 platform 기술을 사용하여 PEG가 결합된 시알산을 도입한 Glyco-PEGylated EPO를 개발 중인데 전임상 자료에 의하면 체내 반감기가 현저히 증대되었으며, 임상 또한 성공적으로 진 행되고 있다고 보고 되었다.
치
치료료용용 항항체체: 항체를 치료제로 개발하기 위한 기술로 1980 년대 후반‘인간화 항체 제작기술’이 개발되었고, 이후 더욱 진 보하여 1990년대에는 display 기술 또는 형질전환 mouse 등을 이용한‘완전 인간 항체 제작기술’등이 개발되었다. 아울러, 최 근에는 치료 효능을 극대화하기 위한 친화도 향상(affinity mat- uration) 기술 및 Fc engineering 기술 등이 계속해서 개발되 고 있다. 특히, 항체의 불변영역 (Fc)에 부착된 당사슬의 구조 를 변형시키면, 외래 병원균 및 자가이상 세포 (암, 이상면역세 포) 등을 제거하는 ADCC (Antibody Dependent Cell Cytotox- icity) 성능을 크게 향상 시킬 수 있다는 사실이 밝혀지면서 큰
주목을 받고 있다(그림 6A). 스위스 ETH의 연구 그룹은 bisect- ing GlcNAc이 있는 당사슬 구조를 갖는 항체가 월등한 ADCC 성능을 보인다는 사실을 발견하고, 항체의 성능향상 기술(Gly-
coMAbTM)을 제공하는 Glycart사를 설립하였다(26). 일본의 거대 제약 회사인 Kowa Hakko사는 fucose가 없는 당사슬이 부착된 항체가 기존 제품 보다 50~100 배 이상의 ADCC 성 능향상을 보인다는 사실을 발견하고, 미국에 자회사인 Biowa사 를 설립하여 fucose 제거에 의한 성능향상 기술(POTELLE- GENTTM)을 이용한 차세대 제품 개발에 주력하고 있다(27- 28). 한편, 올해 초에 갈락토스가 붙지 않은 G0 형태의 당사슬 이 부착된 항체가 세포 사멸 (cell killing) 효과가 더 좋다는 사 실이 보고 되었고(29), 지난 9월에는 Fc의 당사슬에 시알산이 부가되어 S2 형태를 갖게 되면 염증 반응을 억제한다는 사실이 새롭게 밝혀졌다(그림 6B, 참고문헌 30). 이와 같은 연구결과 들은 인체의 면역계는 외부에서 침입하는 세균 및 바이러스 등 에 대항해서 면역 세포의 당화 스위치를 작동시켜 항체에 부착 되는 당사슬을 바꾸어서 면역 반응을 조절함을 제시하고 있어, 향후 치료용 항체 개발 분야에서는 당사슬 공학 기술이 더욱 큰 각광을 받을 전망이다.
효
효소소 치치료료제제: 미국 Genzyme 사는 선천적인 유전 이상에 의 하여 결핍된 체내 효소를 체외에서 주사하는 효소대체 요법 (Enzyme Replacement Therapy) 제품으로 1988년 처음으로 고셔병 치료제 Ceredase를 시판한 이래 Cerezyme, Fabrazyme, Aldurazyme과 Myozyme 등의 재조합 효소들을 개발하였다 (표 3, 참고문헌 31). 효소 치료제는 고가의 재조합 의약품으로 유전성 대사 질환군을 주요 대상으로 하고 있어서, 전 세계 시 장 규모가 1조원에 달함에도 불구하고 당사슬 변형 및 최적화 에서의 기술적 장벽으로 인하여 1-2개 기업만이 시장을 독점하 그림 6. 항체 불변 영역 (Fc)에 부착된 당사슬의 구조와 기능 및
당사슬 공학 기술
(A) 항체의 Fc 당사슬 공학(glycoengineering) 기술 및 보유회사(Biowa 사의 발표자료 인용) (B) 항체에는 보통 biantenary의 복합형 당사슬이 부착되어 있는데, 양 말단이 갈락토스로 끝나는 G2 당사슬형이 가장 일 반적인 형태임. 이 갈락토스 말단에 시알산이 부가되면 (S1 또는 S2 당 사슬형), 항체의 Fc 부위가 면역 세포의 표면에 있는 Fc 수용체에 결합 하는 능력이 떨어지며 염증 반응 등을 억제하는 anti-inflammatory 효과 를 보임. 반대로, 갈락토스가 부착되지 않고 N-acetylglucosamine (Glc- NAc)으로 끝나는 G0 형태의 당사슬은 염증 반응을 활성화시키며, 외부 병원균이 침입했을 때 면역 반응에서 중요한 역할을 담당함 (Burton DR
& Dwek RA,(2006) “Sugar determines antibody activity”Science 313, p628의 그림 인용).
질
질환환 제제품품 개개발발 회회사사 매매출출액액 (US $ Millions)
효
효소소명명 및및 특특징징 2004 2007 (예예상상치치)
Ceredase Genzyme 443 N/A ◆ Glucocerebrosidase
◆ 산모의 태반으로부터 정제
고셔병 (Gaucher) ◆ Glucocerebrosidase
Cerezyme Genzyme 932(2005) 1048 ◆ 동물세포(CHO cell) 생산
◆ 3단계의 당사슬 절단 효소 공정
파브리병 (Fabry) Fabrazyme Genzyme 209 397
◆ alpha-galactosidase
Replagal TKT 57 168
MPS-1 Aldurazyme Genzyme 12 204 ◆ alpha-L-iduronidase
폼베병 (Pompe) Myozyme Genzyme Approved (2006) ◆ aglucosidase alfa 표 3. 효소 치료제 제품 및 시장 동향
는 비정상적인 구조를 보이고 있다. 특히, 재조합 효소들이 치 료 효능을 나타내기 위해서는 이상 조직 및 세포로의 타겟팅이 무엇보다도 중요한데, 효소에 부가된 당사슬 구조 및 성분이 타 겟팅에 결정적인 영향을 미치므로 효소 치료제 개발에 있어서 당사슬 변형 기술이 특히 강조된다. 가장 대표적인 당사슬 변형 효소 치료제로서는 Genzyme 사에서 개발된 Cerezyme으로써, 거식세포로 타겟팅되는 효율을 증가시키기 위해 당사슬 절단 효 소공정을 통해 만노즈형 N-당사슬이 부착된 재조합 glucocere- brosidase로 개발되었다.
2. 당사슬 제어 생산 기술
앞에서 언급된 바와 같이 당단백질에 부착된 당사슬의 구조 와 종류는 단백질의 접힘, 활성, 효능 및 체내 안전성 등에 큰 영향을 미치므로 이러한 당사슬을 원하는 일정한 형태의 특정 구조로 제어해서 고성능, 고품질의 제품을 대량생산하는 기술은 산업적으로 매우 중요한 위치를 차지하고 있다. 현재, 이들 당 사슬을 제어하는 생산 기술로는 ①발현 숙주의 당사슬 생합성 경로를 재설계하는 방법, ②배양 공정 제어 기술을 이용하는 방 법 및 ③in vitro 당사슬 변형 공정 기술을 이용하는 방법 등이 주목을 받고 있다.
숙
숙주주 세세포포 재재설설계계: 재조합 단백질을 대량으로 생산하기 위 해서는 균주의 조작이 용이하고, 경제적이며 대량 배양이 용이
한 대장균이나 효모와 같은 미생물들을 일차적으로 고려하지만, 인체 유래의 복잡한 당단백질들을 활성형으로 생산하기 어려운 문제가 있다. 특히, 대장균은 당사슬 부가 능력이 없고, 효모 및 식물 등에서 발현되는 당단백질은 인체 주입 시 면역 부작용을 일으킬 수 있는 비인간 당사슬 구조를 가지고 있어서, 현재 의 약용 당단백질은 주로 동물세포 배양기술로 생산되고 있다 (표 4). 그러나, 동물세포의 경우 생산 세포주의 개발 기간이 길고 배양 시간이 오래 걸리며 배지 비용도 고가이기 때문에 생산 비 용이 고가인 단점을 가지고 있으며 또한 인간에게 치명적인 바 이러스 및 광우병의 원인인 프라이온이 오염될 가능성과 같은 위험 요소들을 갖고 있다 (32). 따라서, 이러한 단점들을 극복 한 고품질, 고효율의 경제성 있는 차세대 발현 시스템의 개발이 요구되고 있으며, 이를 개발하기 위해서 많은 연구가 집중되고 있다. 대표적으로 미국의 Glycofi사는 메탄올자화 효모인 Pichia pastoris의 당사슬 생합성 경로를 재설계하여 인체형 당단백질 의 발현에 성공하여 차세대 발현 시스템으로서 산업계의 큰 주 목을 받고 있으며 (33-34), 최근에는 가장 어려운 최종 단계인 시알산이 부가된 당단백질을 생산하는 데에 성공하였다 (35). 한 편, 한국생명공학연구원의 본 연구팀에서도 B형 간염 백신 생 산 숙주로 이미 그 유용성과 안정성이 입증된 메탄올자화 효모 Hansenula polymorpha를 이용하여 인체 만노스형 당사슬 부 착 단백질 생산이 가능한 숙주 개발에 성공하였다 (36). 곤충 세포의 경우, 혈청이 포함된 배지에서 배양하는 경우 시알산을
Characteristics E. coli Yeast/Fungi Insect cells Mammalian cells
◆ Cell growth rapid(30 min) rapid(90 min) slow(18-24 h) slow(24 h)
◆ Cost of growth medium low low high high
◆ Expression level high low to high low to high low to moderate
◆ Extracellular expression secretion to secretion to secretion to secretion to
periplasm medium medium medium
◆ Protein folding refolding usually required proper folding proper folding proper folding
◆ Post-translational modifications
N-glycosylation none high mannose simple,
complex no sialic acid
O-glycosylation no yes yes yes
Phosphorylation no yes yes yes
Acetylation no yes yes yes
Acylation no yes yes yes
- 자료: Nevalainene et al. TRENDS in Biotechnology 23, 468 (2005) 표 4. 재조합 단백질 생산 숙주별 특징 및 비교
포함한 인체형 N-당사슬 부착이 가능하도록 당사슬 생합성 경 로가 재설계된 Sf9 숙주 세포(MimicTM cells, Invitrogen)가 상용화되어 있다.
배
배양양 공공정정 제제어어 기기술술: 현재, 재조합 당단백질 생산 시장을 선도하고 있는 동물세포 배양 기술은 지난 20년 동안 빠르게 발전해 왔으며 지금까지 약 100배에 이르는 생산성 증가가 보 고 되었다(32).이러한 비약적인 기술 발전과 더불어 배양 공정 의 변화를 통하여 당사슬 변형이 가능하다는 사실이 밝혀지면 서 이 분야의 연구가 집중적으로 이루어지고 있다. 포도당, 암 모늄 이온, glucosamine, 호르몬 등의 배지 조성뿐만 아니라, pH, 배양 온도, CO2 농도 및 shear stress 등에 의해서 시알산 등을 포함한 당사슬 패턴이 변화한다는 사실이 보고 되었다 (37- 39). 따라서, 이러한 조건들을 최적화하여 원하는 당사슬이 부 착된 당단백질을 생산하려는 시도가 계속되고 있으나 비균일한 (microheterogeniety) 당사슬의 당단백질을 발현하는 근본적인 한계로 인하여 맞춤형 당사슬의 생산을 위해서는 in vitro 당사 슬 변형 공정과 같은 다른 부가적인 수단이 필요하다는 단점이 있다.
당
당사사슬슬 변변형형 공공정정 기기술술: 미국의 Neose 사는 동물세포 배양 등으로부터 생산된 불완전한 당사슬에 갈락토오스 혹은 시알산 을 도입하는 in vitro 당전이 효소 반응 공정인 GlycoAd- vanceTM 기술을 개발하여 Bristol-Myers Squibb, Glaxo- SmithKline 및 Novozyme 등의 메이져급 회사들과 공동연구 및 기술이전을 통해 이 분야를 선도하고 있다. 한편, 일본은 인 간 유전체 정보 분석을 통해서 기존에 분석되지 않은 신규 인 간 당전이 효소들을 발굴하기 위하여 정부 지원의 대형 연구 사 업인 GlycoGene 프로젝트를 수행하였으며, 현재까지 보고 된 인체 유래 당전이 효소 유전자들의 35%에 해당하는 신규 유전 자를 발굴하고 라이브러리를 만드는 성과를 이루었다(40). 당사 슬 제어를 위한 당전이 효소 반응 공정 기술의 개발을 위해서 는 활성 및 입체 특이성이 뛰어난 다양한 신규 당전이 효소들 의 확보하고, 이들을 생산하기 위한 시스템 구축 및 GMP 수 준의 in vitro 공정 개발 등이 필요하다.
3. 탄수화물 의약품
탄수화물 의약품은 합성 의약품에 비하여 독성이 매우 낮고,
외래 단백질이나 펩타이드 의약품과는 달리 면역 부작용을 일 으킬 우려가 없어서 개발 시 성공 가능성이 매우 높다는 장점 을 가지고 있다. 또한, 최근에 유전공학과 효소공학 분야에서 새 로운 기술들이 등장하여 탄수화물 소재의 조작이 더욱 용이해 지면서 이를 활용한 의약품들의 잠재력이 점점 더 현실화되고 있다.
헤
헤파파린린: 헤파린은 황산화 다당체로서 약 60년 전부터 항응고 제로 널리 사용되어져 왔으며, glucosamine과 iduronic acid의 alpha-1,4 결합으로 연결된 평균 분자량 5,000 - 30,000 Da인 고분자 탄수화물이다. 천연 헤파린은 종류가 다른 선형 다당류 의 혼합물로서 항응고 효과 외에 많은 부작용이 보고 되어 왔 다. 이를 해결하기 위해서 비분획 천연 헤파린으로부터 항응고 작용에 필요 없는 부위들을 제거해서 부작용을 획기적으로 줄 인 고성능의 저분자 헤파린(Aventis사의 Lovenox , Pfizer사 의 Frgmin , DuPont사의 Innohep ) 제품들이 개발되었고, 더 나아가 항응고 작용 메카니즘에 대한 이해를 바탕으로 합성 헤 파린(Sanofi사의 Arixtra ) 제품이 개발되었다(41). 최근에는 헤 파린이 항응고 활성 이외에 항염증 및 항암 작용을 비롯한 다 양한 활성을 갖는다는 사실이 밝혀지고 있어서 글라이코믹스 활 용 기술을 이용해서 새로운 적응증을 갖는 헤파린 제품의 개발 이 기대되고 있다(21).
히
히알알우우론론산산 : 히알우론산은 글리코사미노글리칸(GAG, Gly- cosaminoglycan)의 일종으로 글루쿠론산(glucuronic acid)과 GlcNAc이 순차적으로 결합되어 분자량이 수만에서 수천만 달 톤에 이르는 매우 큰 생체 고분자이다. 주로 생체 내에서 extra- cellular matrix가 주 구성 성분인 연결 조직에 고농도로 분포 해 있으며, 동공, 연골, 관절의 활액 및 피부에 널리 존재하며 생체의 항상성을 유지하는데 반드시 필요한 구성 성분이다. 닭 벼슬에 많이 존재하나 최근에는 대부분 미생물 배양을 이용하 여 제조하며, 히알우론산 유도체를 만들어서 원하는 물성을 가 진 차세대 제품을 개발하려는 시도가 활발히 이루어지고 있다.
기존 히알우론산 제품은 안과 수술보조제, 안구 건조증 치료용 인공 누액 및 관절기능 개선제로 주로 사용되고 있으며, 차세대 유도체들은 이러한 적응증들에 더하여 주름살 및 흉터 제거용 filler, 가슴 확대용 보형물, 피부 이식용 scaffold, 서방형 제형 을 위한 matrix 등으로 적응증 확대를 목표로 개발되고 있다.
미국 Genzyme 사는 1990년 초 히알우론산과 카르복실 메틸 셀룰로오즈를 결합한 히알우론산 유도체 제조 방법을 개발하였 고, 이탈리아 Fidia 사는 히알우론산의 카르복실 산과 알킬할라 이드를 이용한 에스테르 반응을 통해서 유도체를 개발하였다. 국 내에서는 현재 히알우론산을 제조, 판매하는 LG 생명과학이 2003년부터 당사슬 변형 기술을 이용한 히알우론산 유도체 개 발을 시도하여 괄목할만한 연구 결과들을 얻고 있다.
탄
탄수수화화물물 백백신신: 병원성 세균의 표면에 존재하는 다당류를 이 용하여 인체 질병을 예방하는 백신 후보 물질들이 개발되고 있 으며 몇몇 제품들은 이미 시장에 출시되었다(42). 그러나, 다당 류가 가지는 thymus 비의존적 특성 때문에 2세 미만의 유아들 에게는 효력이 없고 전반적으로도 면역성이 약하다는 단점을 가 지고 있다. 때문에 이러한 문제를 해결하기 위해서 다당류에 단 백질을 결합한 형태인 복합다당류 (conjugated polysaccharide) 의 개발에 연구가 집중되고 있다.
4. 배당체 의약품
배당체 (glycoside)는 당이 아닌 물질 (비당류)의 OH기에 당 을 부가하는 배당화 반응을 이용하여 합성된 유도체들을 일컫 는 말로, 기존의 비당류 물질보다 개선된 생리활성, 안정성, 수 용성 및 기타 물리화학적 특성을 보인다. 배당화 기술을 이용하 면 항생제, 항암제, 항염제, 면역증강제, 알칼로이드 및 비타민 류 등의 광범위한 의약품들을 대상으로 새로운 고성능 제품을 개발할 수 있다 (43, 44).
항
항 생생 물물 질질: Aminoglycoside계 항생제들로는 대부분 aminosugar와 aminocyclitol 또는 cyclitol이 부착된 strepto- mycin, dihydrosterptomycin, gentamycin 등이 이 범주에 들 어간다. Glycopeptides 계 항생제들은 mono-, di- 또는 tetrasac- chrides로 배당화된 복잡한 폴리펩타이드로 구성되어 있으며, 이 계열에는 vancomycin, teicoplanin, bleomycin, ristocetin 등 을 포함해서 약 100 여개의 항생제들이 개발되어 있다. 특히, vancomycin의 배당체인 epivancomycin은 기존 제품보다 크게 성능이 향상된 대표적인 성공 사례로 손꼽힌다 (그림 7).
알
알칼칼로로이이드드류류: Ergot alkaloids(EA)는 자궁이완, 산후출혈, 편두통 등에 효과적인 의약품으로 최근 효소적 방법을 사용하 여 다양한 배당체가 합성되고 있으며, 대표적인 예인 EA gly- coside elymoclavine-O-β-D-fructofuranoside는 곰팡이 (Clav- iceps sp.)의 invertase를 이용한 효소 반응에 의해서 제조되 었다.
비
비타타민민류류: 배당화된 비타민은 특히 수용액에서의 용해도가 크 게 증가되고 안정성이 증가하여 기존 비당류 제품에 비하여 많 은 장점을 가지고 있다. Pyridoxine (비타민 B6)의 배당체인 pyridoxine-α-glucoside는 기존 제품보다 자외선과 열에 대하 여 더 안정하며, Rutin (비타민 B2)과 토코페롤 (비타민 E)의 배당체 제품들은 기존 물질들의 용해도를 크게 개선하여 생리 활성을 증가시킨 제품들이다. Ascorbic 산 (비타민 C)은 의약 품 뿐만 아니라, 식품 및 화장품 등의 광범위한 생물산업 분야 에서 수요가 폭발적으로 증가하고 있는 매력적인 상품이나 화 그림 7. Vancomycin의 배당체인 epivancomycin
학적으로 불완전하여 과량 투여를 요하며, 효능 저하가 문제시 되었다. 그러나 이러한 문제점을 극복한 배당체 (2-O-α-glu- copyranosyl-L-ascorbic acid) 제품이 개발되면서 그 용도와 시 장이 더욱 크게 확장되고 있다.
결론 및 전망
생체내 당복합체에 결합되어 있는 당사슬이 다양한 생명 현 상에 관여하고 있으며, 또한, 지면상 다 소개하지 못하였지만 당 화 대사 이상으로 인한 CDG도 현재 약 16가지 이상이 밝혀지 면서 당화가 생명 유지에 중요한 인자로 부각되었다. 그동안 기 능성 유전체학과 단백질체학 연구로 밝힐 수 없었던 생명현상 들을 글라이코믹스 연구로 규명하고자 하는 연구가 전 세계적 으로 활발히 진행되고 있다. 오늘날 생체내 당복합체는 핵산 및 단백질과 함께 제3의 생체정보 고분자 (informational bio- macromolecules)로서 인식되기에 이르렀다. 이들 생체 복합당 질의 구조와 그 정보 즉, 기능을 해석하고자 하는 연구분야가 바로 functional glycomics이며, 미국 NIH는 분야의 중요성을 인식하여 James Paulson 박사를 책임자로 한 Consortium for Functional Glycomics 프로그램을 구성하여 막대한 연구비를 지원하였고 이제 2007년부터 새로운 글라이코믹스 연구를 위한 연구비 확보에 관련 연구자들이 노력하고 있다.
생체 당복합체의 구조와 기능 해석은 생명현상의 규명이라는 기초과학의 발전 뿐 만 아니라, 이를 응용한 생명공학의 발전에 도 크게 기여하고 있다. 미국, 영국, 일본 등 과학 선진국에서 는 지난 20여 년 동안 축적된 지식과 발전된 연구 기법을 산업 에 응용하기 시작하여, 당생물공학 기술 발전에 집중 투자하고 있다. 이미 이를 통해 블록버스터급 탄수화물 유도체나 재조합 당단백질 의약품들 및 생체내 당복합체 대사 관련 질환 치료제 들을 개발하여 의료보건 분야에의 기여뿐 만 아니라, 대단한 경 제적 성과를 거둠으로써 글라이코믹스 연구의 중요성을 입증하 고 있다. 2003년 MIT는 21세기를 선도할, 새롭게 부상하는 10 대 기술 중 하나로 BT 중에서는 바로 글라이코믹스 기술을 지 목함으로서 그 중요성을 강조하였다.
단백질, 탄수화물, 항생제 등을 비롯한 각종 의약품 소재에 부착된 당사슬의 성분 및 구조는 치료 효능과 인체 내 체류시 간, 약리 활성 및 면역 반응 등에 큰 영향을 미친다. 이에 따라 당사슬을 리모델링하여 보다 우수한 성능을 지닌 차세대 버전
을 개발하려는 시도가 선진국을 중심으로 본격화하고 있다. 현 재 국내 제약 및 바이오 업계의 자금력 및 기술력을 감안하면, 다가오는 바이오 제네릭 시대에 대비한“개량형 바이오 신약 (수퍼 바이오 제네릭)”개발 전략으로 글라이코믹스 활용 기술 을 이용한 의약품 개발 기술을 집중 육성할 필요가 있다.
기존 의약품보다 성능이 크게 향상된 고성능의 개량형 신약 을 만들기 위한 글라이코믹스 활용 기술은 최근에 급부상한 태 동기 기술로서 선진국과의 기술 격차도 비교적 적기 때문에 현 시점에서 기술 개발이 집중적으로 이루어질 경우 향후 세계적 으로 바이오 의약 시장을 선도할 수 있는 분야이다. 최적의 당 사슬이 부착된 새로운 형태의 빌트인 (built-in) 의약품 개발, 성 능 향상 및 대량 생산 등의 원천기술 개발은 차세대 의약품 창 출을 위한 지름길로서 국내 바이오 의약품의 국제 경쟁력을 극 대화할 것이다. 차세대 의약품 소재로서 그 중요성이 더욱 부각 되고 있는 당사슬을 자유자재로 리모델링하고 대량 생산할 수 있는 원천 기술 개발은 매우 도전적이지만 그 만큼 산업적 수 요와 파급 효과가 큰 연구 분야이다.
구조와 기능은 따로 떼어놓고 생각할 수 없는 불가분의 관계 이다. 필자의 실험실에서도 이루어지는 결과를 보면 당화가 잘 이루어진 당단백질은 그렇지 못한 산물에 비해 항상 더 달콤한 활성을 나타냈다. 목표가 있고 열정이 있을 때 이는 충분히 가 능한 것임을 먼저 그 길을 가본 선배로서 감히 말할 수 있기에 젊은 후배들이 그 달콤한 열매를 맛볼 수 있기를 기대한다.
참고문헌
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2. Kim S, Westphal V, Srikrishna G, Mehta DP, Peter- son S, Filiano J, Karnes PS, Patterson MC, Freeze HH. Dolichol phosphate mannose synthase (DPM1) mutations define congenital disorder of glycosylation Ie (CDG-Ie). J Clin Invest. 105, 191-8. (2000) 3. Jung HI, Kim YH, Kim S. Structural basis for the
presence of a monoglucosylated oligosaccharide in mature glycoproteins. Biochem Biophys Res Commun.
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4. Miura Y, Kim S, Etchison JR, Ding Y, Hindsgaul O,
