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변이가 있는 췌장암세포주에서

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대한소화기학회지 2000;36:372 - 382

K - ras 변이가 있는 췌장암세포주에서 M it og e n A c t iv a t e d P rotein K in a s e와 PI 3- kin a s e가 세포증식에 미치는 역할

분당제생병원 내과*, 서울대학교 의과대학 내과학교실, 간연구소

류지곤*・김 진・장유현・이우진・김용태・윤용범・김정룡

R o l e o f Mi t o g e n Ac t i v a t e d P ro t e i n Ki n a s e a n d P I 3 -k i n a s e o n Ce ll P r o li fe r a t i o n i n P a n c r e a t i c Ca n c e r Ce ll Li n e s w i t h K-r a s Mu t a t i o n

J i Kon R y u , M.D.*, J in Ki m , M.D., Yo o H yu n Ch a n g , M.D., Wo o J i n Le e , M.D., Yo n g -Ta e Ki m , M.D., Yo n g B u m Yo o n , M.D. a n d Ch u n g Yo n g Ki m , M.D.

Department of Internal Medicine*, Pundang Jesaeng General Hospital, Sungnam;

Department of Internal Medicine, Liver Research Institute, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea

Background/Aims: K-ras mutation is considered to be important for the development and prolifera- tion of pancreatic cancer. After activation of Ras protein, several cytoplasmic protein kinases, such as the mitogen activated protein kinase (MAPK) signaling cascade and PI 3-kinase, are sequentially stimulated. The aim of this study was to examine the role of MAPK and PI 3-kinase on cellular proliferation of pancreatic cancer cell lines with K-ras mutation. Methods: MiaPaCa-2 and Panc-1 cell lines were cultured and stimulated with growth factors such as fetal bovine serum (FBS) and epidermal growth factor (EGF). The cell proliferation was measured by 3H thymidine incorporation assay. MAPK/extracellular signal regulated kinase (ERK) activating kinase (MEK) inhibitor (PD098059) or PI 3- kinase inhibitor (wortmannin) was added in media and their effects on proliferation were examined. The activity of ERK was measured by immunoblotting assay. Results:

FBS stimulated cell proliferation dose-dependently in both cell lines but EGF did not. PD098059 blocked dose-dependently the cell proliferation but wortmannin did not. The activities of ERK were increased by both FBS and EGF and blocked only by PD098059. Conclusions: MAPK kinase signal transduction pathway from MEK to ERK plays an important role in the stimulation of proliferation in pancreatic cancer cell lines with K-ras mutation. (Kor J Gastroenterol 2000;36:372 - 382)

Key Words: K-ras, MAP kinase, MEK, Pancreatic cancer, PI 3-kinase

접수: 2000년 8월 5일, 승인: 2000년 9월 5일

연락처: 김용태, 110-744, 서울시 종로구 연건동 28, 서울대학교병원 내과학교실 Tel: (02) 760-2944, Fax: (02) 762-9662

※ 본 연구는 서울대학교병원 02-1997-0340 연구비 보조로 이루어졌음.

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류지곤 외 6인. 췌장암 세포주에서 MAP Kinase와 PI 3-Kinase가 세포증식에 미치는 역할 373

서 론

췌장암은 진단 당시 수술을 할 수 있는 경우는 5% 이하로 극히 드물고 수술을 하더라도 5년 생존 율이 5% 이하로 매우 낮다. 수술을 못할 경우는 90%가 1년 내에 사망하는 예후가 나쁜 종양이다.

또한 췌장암은 다른 종류의 암과는 달리 항암제나 방사선치료 등 비수술적 치료에 반응을 하지 않아 새로운 치료법의 개발이 필요한 실정이다. 췌장암의 비수술적 치료 방법을 연구하려면 췌장암세포의 증 식기전을 아는 것이 중요한데, 췌장암의 80-90%에 서 K-ras 유전자 변이가 발견되어,1 췌장암의 발생 및 증식에 매우 중요한 역할을 함을 알 수 있다. 최 근 들어 Ras의 발암기전에 관한 많은 연구가 있었 는데, 특히 Ras가 어떠한 과정을 통해서 이러한 기 능을 수행하는지에 대해 연구의 초점이 맞추어지고 있다. 즉 Ras에 의해 활성화되는 단백이나 이후의 신호전달과정을 규명하는 것이 췌장암의 증식기전 을 밝히는 데 매우 중요하다고 할 수 있다. 현재까 지 알려진 Ras 다음 단계로 활성화되는 단백으로 Raf, PI 3-kinase, Rin 1, AF-6, PKC, Nore 1, GAP 등이 있다.2,3 췌장암세포에서는 Raf가 관여하는 것 으로 알려지고 있으나 PI 3-kinase의 역할에 관하여 는 아직 잘 알려진 바가 없다.

MAP kinase 신호전달경로는 세포가 성장인자, 싸이토카인(cytokine), 호르몬 그리고 각종 스트레스 등에 의해 자극을 받았을 때 작동하고 세포의 성장, 분화, 면역, 염증반응 등을 조절하는 중요한 통로로 알려져 있다. 포유동물 세포에서는 extracellular signal regulated kinase (ERK), Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase (JNK/SAPK), p38 등 3가지 MAP kinase 신호전달체계가 알려졌다. 이중 ERK- MAP kinase는 Ras를 중요한 신호전달물질로 사용 한다고 알려졌는데, 활성화된 Ras는 Raf, mitogen activated ERK activating kinase (MEK), ERK 들을 차례로 활성화시킨다.4,5 PD98059는 MEK를 특이적 으로 억제하는 물질인데,6 대장상피세포주, 대동맥 평활근세포주, 섬유아세포주 등에서 PD98059는 세포 의 증식을 억제한다는 보고가 있으며,7-9 최근 췌장

암세포주에서도 증식을 억제한다는 일부 보고가 있 다.10

PI 3-kinase는 인슐린에 의한 포도당의 수송에 중 요한 역할을 하는 효소로 처음 알려졌으며,11 이후 세포증식에도 중요한 역할을 한다고 알려졌다.12 이 후 일부 세포에서는 Ras에 의해 활성화된다는 것이 밝혀졌고,3 PI 3-kinase는 세포증식 이외에도 세포고 사의 억제, actin과 integrin의 조절, 소낭(vesicle)의 분비 등에 관여한다고 알려져 있다.13,14 PI 3-kinase 는 serine-threonine kinase Akt/protein kinase B (PKB)를 통하여 신호전달을 한다고 최근 밝혀졌 다.13,15 그런데 췌장암에서 Akt2 유전자의 증폭이 약 10-20%에서 발견된다고 보고되고 있어,16 췌장암세 포에서도 증식에 관여할 가능성이 제기되고 있다.

대장암세포에서 PI 3-kinase의 활성도가 높다는 보 고가 있으나,17 췌장암세포주에서의 역할은 아직 알 려진 바가 없다. Wortmannin은 PI 3-kinase를 특이 적으로 억제하는 물질인데 암세포의 증식을 억제한 다는 일부 보고가 있으나,18 췌장암세포주에서 세포 증식에 미치는 역할에 관하여는 보고된 바가 없다.

본 연구에서는 K-ras 변이가 있는 췌장암세포주 에서 MEK 억제제와 PI 3-kinase 억제제가 세포증식 을 억제할 수 있는지를 알아보고, 또한 MEK 억제 제와 PI 3-kinase 억제제에 의한 세포증식의 변화가 ERK 활성도와 관련이 있는지를 알아보고자 하였다.

즉 K-ras 변이가 있는 췌장암세포주에서 MEK 또는 PI 3-kinase를 통한 신호전달체계 중 어느 경로가 세 포증식에 영향을 미치는가를 알아보고, 그 기전으로 서 ERK 경로의 역할을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

1. 췌장암세포의 배양

K-ras 유전자 변이가 있는 췌장암세포주로 MiaPaCa- 219와 Panc-120 세포주를 서울대학교 암연구소에서 구입하였다. 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco-BRL, USA)을 포함한 Dulbecco`s modified Eagle`s medium (DMEM; Gibco-BRL, USA) 배양액 10 ml를 배양용기에(10 cm culture dish, Falcon) 넣 고 37℃, 5% CO2에서 3일간 배양하였다. 배양용기

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374 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 36, No. 3, 2000

의 배양액을 버리고 PBS로 세척 후 trypsin-EDTA 용액 2 ml를 넣고 세포가 배양용기에서 떨어진 것 을 육안으로 확인 후 Falcon tube에 넣고 원심분리 하여 상층액을 버리고 pellet에 10% 우태아혈청을 포함한 DMEM 배양액 2 ml를 넣었다. 세포의 농도 를 측정하여 적당한 농도로 희석하고 이를 24 well plate에 1 ml씩 각각 분주하였다. 이 때 세포의 밀도 가 well의 50%를 넘지 않도록 적절한 농도를 맞추 고 2일간 배양하였다.

2. 성장인자의 자극

성장촉진인자로는 우태아혈청과 epidermal growth factor (EGF; Sigma)를 이용하였다. 2일간 24 well plate에서 배양된 세포주의 밀도가 각각의 well마다 유사한지 육안으로 확인한 후 배양액을 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)으로 2회 세척한 후 우태아혈청이 함유되지 않은 DMEM 배양액을 넣고 24시간 배양하여 성장을 정지시켰다. 24시간 후 성 장인자를 첨가하여 성장을 촉진시켰는데 대조군은 성장인자를 넣지 않고 우태아혈청군은 배양액 내 혈청의 최종 농도가 각각 1%, 5%, 10%, 20%가 되 도록 우태아혈청을 첨가하였다. EGF군은 배양액의 최종 농도가 각각 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml가 되도록 EGF를 첨가하였다. 성장인자를 첨 가한 후 48시간 동안 배양하였다.

3. 세포증식의 측정

세포증식의 정도는 3H thymidine 섭취율을 측정 하여 간접적으로 평가하였다. 24 well plate에 배양 된 세포주에 3H thymidine (Amersham)을 2 μCi 첨 가하고 2시간 동안 배양하였다. 배양액을 버리고 PBS로 3회 세척하고 trypsin-EDTA를 200 μl 첨가 하여 세포를 배양용기에서 완전히 분리한 후 Eppen- dorf tube에 각각 담았다. Cocktail 용액 300 μl를 넣 고 automatic microBeta counter (Packard Tricarb)를 이용하여 radioactivity를 측정하였다. 세포증식의 정 도는 대조군을 100%로 하고 상대적인 비율을 %로 표시하였다.

4. M E K 억제제와 P I 3- kin a s e 억제제 및 성장인자의 첨가 배양

앞서의 실험 결과를 토대로 세포성장을 자극하는 우태아혈청과 EGF의 적정 농도를 구하여 그 농도 로 성장을 촉진시켰다. 우태아혈청은 10%, EFG는 20 ng/ml를 적정 농도로 하였다. 2일간 24 well plate 에서 배양된 세포주의 밀도가 각각의 well마다 유사 한지 육안으로 확인한 후 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 우태아혈청이 함유되지 않은 DMEM 배양액을 넣고 24시간 배양하여 성장을 정지시켰다.

대조군은 아무것도 첨가하지 않고, 나머지는 PD98059 (#9900S; New England Biolabs)를 각각의 최종 농도가 10 μM, 20 μM, 50 μM이 되도록 배양 액에 첨가하였다. Wortmannin (Sigma)은 최종 농도 가 각각 50 nM, 100 nM, 150 nM이 되도록 배양액 에 첨가하였다. 2시간 동안 배양한 후 우태아혈청 (최종 농도 10%) 또는 EGF(최종 농도 20 ng/ml)를 첨가하고 48시간 배양하였다.

5. E RK 활성도의 측정

앞서와 같은 방법으로 PD98059와 wortmannin을 첨가하고 2시간 배양한 후 성장인자를 첨가하고 15 분 후에 세포를 수확하여 ERK 활성도를 측정하였다.

1) 세포융해(c ell ly s is ) 및 단백의 전이 배양액을 제거한 후 PBS로 세척하고 융해 완충 액을 200 μl 첨가한 다음 4℃ 얼음 위에서 scraper를 이용하여 세포를 긁어냈다. 긁어 낸 세포를 Eppen- dorf tube에 담아 vortex 후에 원심분리하여 상청액 을 취하여 보관하였고, 일부를 취하여 Lowry 방법 으로 단백 농도를 측정하였다. 측정된 단백 농도에 따라서 동량의 단백을 함유한 검체와 부하 완충액 (loading buffer)을 4:1로 섞고 100℃로 5분간 끓인 후 얼음에 냉각시키고 4℃에서 5분간 원심분리하였 다. 처리된 검체를 12.5% SDS PAGE에 부하하고 10℃에서 30 mA로 전기영동하였다. 젤을 떼어내고 nitrocellulose 막을 부착하여 20 volt, 4℃에서 하루 밤 동안 전기영동하여 단백을 젤로부터 nitrocellu- lose막으로 전이시켰다.

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Ryu, et al. Role of MAP Kinase and PI 3-Kinase on Cell Proliferation in Pancreatic Cancer 375

2) Im m u n oblot t in g

차단 완충액(blocking buffer; 1×TBS, 0.1%

Tween-20, 5%w/v non-fat dry milk)에 nitrocellulose 막을 담그고 실온에서 1시간 흔들면서 방치하였다.

ERK 활성도의 측정은 anti-phosphorylated ERK rabbit antibody (#9100; New England Biolabs)를 일 차항체로 사용하였다. 차단 완충액을 버리고 1×

TBS, 0.1% Tween-20, 1%w/v non-fat dry milk에 일 차항체를 1:1,000 희석한 용액에 nitrocellulose막을 담그고 실온에서 1시간 흔들면서 방치한 후 세척하 였다. 이차항체로 HRP (hoarse radish peroxidase) conjugated anti-rabbit antibody (Becton Dickinson)를 이용하였는데, 이차항체를 1×TBS, 0.1% Tween- 20, 1×%w/v non-fat dry milk에 1:2,000 희석한 용 액에 nitrocellulose막을 담그고 실온에서 1시간 흔들 면서 방치한 후 1×TBS, 0.1% Tween-20 용액으로 4회 5분간 세척하였다.

3) Re pr obin g

총 ERK 농도의 측정은 anti-ERK rabbit antibody (sc-93; Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 측정 하였다. Immunodetection을 시행한 nitrocellulose 막 을 stripping buffer (100 mM mercaptoethanol, 2%

SDS, Tris-HCl)에 담그고 50℃에서 30분간 방치하

여 항체를 모두 제거하였다. 이후 anti-ERK rabbit antibody를 일차항체로 이용하여 같은 방법으로 im- munoblotting과 immunodetection을 시행하여 각 lane 에 같은 양의 ERK가 부하되었는지를 확인하였다.

6. 통계적 분석

3H thymidine 섭취율 측정 결과는 대조군을 100%

로 하고 이에 대한 상대적 비율을 mean±SE로 제시 하였으며, 통계적 분석을 위하여 Student`s t-test를 사용하였다. P<0.05 이하일 때를 통계적으로 유의한 것으로 평가하였다.

결 과

1. 우태아혈청과 E G F 가 췌장암세포주의 증식에 미치는 영향

우태아혈청을 1%, 5%, 10%, 20%로 첨가하였을 때 세포에서의 3H thymidine 섭취율은 대조군에 비 하여 MiaPaCa-2 세포주에서는 각각 160±25%, 170

±30%, 250±32%, 307±35% 증가하였고, Panc-1 세포주에서는 각각 140±22%, 150±25%, 180±

30%, 250±32% 증가하였다(p<0.05)(Fig. 1A). 그러 나 EGF를 1 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml가 되도록 첨가하였을 때 세포에서의 3H thymidine 섭취율은 대조군에 비하여 MiaPaCa-2 세

Fig. 1. Effects of FBS and EGF on pancreatic cell proliferation. The cells were incubated for 48 hrs with FBS or EGF and the proliferation was measured by 3H thymidine incorporation. FBS stimulates cell proliferation dose dependently in MiaPaCa-2 and Panc-1 cell lines (A). But EGF does not in both cell lines (B). Results are expressed as the percentage increase from control value (serum free medium) and are the mean±SEM of three separate experiments.

* p<0.05 compared with controls.

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376 대한소화기학회지 : 제 36 권 제 3 호 2000

포주에서는 각각 95±20%, 90±15%, 110±12%, 120±18%, 115±20%를 보였고, Panc-1 세포주에서 는 각각 95±15%, 80±12%, 95±18%, 100±20%, 110±15%로 두 세포주 모두에서 의미 있는 증가를 보이지 못하였다(p>0.05)(Fig. 1B).

2. M E K 억제제가 췌장암세포주의 증식에 미치는 영향

무혈청 배양액에서 PD98059를 5 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM 첨가하였을 때 세포에서의 3H thy- midine 섭취율은 대조군에 비하여 MiaPaCa-2 세포 주에서는 각각 91±15%, 65±18%, 52±12%, 40±

10%로 감소하였고, Panc-1 세포주에서는 각각 89±

12%, 60±15%, 55±10%, 35±12%로 감소하였다 (p<0.05)(Fig. 2A). PD98059를 5 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM 첨가하고 우태아혈청 10%를 첨가하였을 때 세포에서의 3H thymidine 섭취율은 대조군에 비하 여 MiaPaCa-2 세포주에서는 각각 80±20%, 65±

15%, 38±12%, 30±10%로 감소하였고, Panc-1 세 포주에서는 각각 95±15%, 64±12%, 45±12%, 35

±10%로 감소하였다(p<0.05)(Fig. 2B). PD98059를 5 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM 첨가하고 EGF를 20 ng/ml로 첨가하였을 때 세포에서의 3H thymidine 섭 취율은 대조군에 비하여 MiaPaCa-2 세포주에서는 각각 5410%, 358%, 387%, 255%로 감소하였고, Panc-1 세포주에서는 각각 6415%, 4510%, 4012%, 3511%로 감소하였다(p<0.05)(Fig. 2C).

3. P I 3- kin a s e 억제제가 췌장암세포주의 증식에 미치는 영향

무혈청 배양액에서 wortmannin을 50 nM, 100 nM, 200 nM 첨가하였을 때 세포에서의 3H thy- midine 섭취율은 대조군에 비하여 MiaPaCa-2 세포 주에서는 각각 110±15%, 82±18%, 100±12%로 세포증식에 영향을 주지 못하였고, Panc-1 세포주에 서도 각각 105±20%, 95±18%, 90±12%로 세포증 식에 영향을 주지 못하였다(p>0.05)(Fig. 3A). Wort- mannin을 50 nM, 100 nM, 200 nM 첨가하고 우태 아혈청 10%를 첨가하였을 때 세포에서의 3H thy- midine 섭취율은 대조군에 비하여 MiaPaCa-2 세포

주에서는 95±20%, 98±18%, 105±15%로 역시 세 포증식에 영향을 주지 못하였고, Panc-1 세포주에서 도 각각 92±15%, 88±18%, 95±12%로 세포증식

Fig. 2. Effects of PD98059 on pancreatic cell proliferation.

The cells were treated with PD98059 for 2 hrs and incubated for 48 hrs in serum free media or in 10% FBS media or in 20 ng/ml EGF supplemented serum free media and the proliferation was measured by 3H thymidine incorporation. PD98059 dose dependently suppress cell proliferation in MiaPaCa-2 and Panc-1 cell lines which were cultured in serum free media (A), in 10% FBS media (B) and in 20 ng/ml EFG supplemented serum free media (C). Results are expressed as the percentage increase from control value and are the mean±SEM of three separate experiments.

* p<0.05 compared with controls.

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류지곤 외 6인. 췌장암 세포주에서 MAP Kinase와 PI 3-Kinase가 세포증식에 미치는 역할 377

에 영향을 주지 못하였다(p>0.05)(Fig. 3B). Wort- mannin을 50 nM, 100 nM, 200 nM 첨가하고 EGF 를 20 ng/ml로 첨가하였을 때 세포에서의 3H thymi- dine 섭취율은 대조군에 비하여 MiaPaCa-2 세포주 에서는 각각 95±20%, 97±15%, 100±18%로 역시

세포증식에 영향을 주지 못하였고, Panc-1 세포주에 서도 각각 100±20%, 95±18%, 90±22%로 세포증 식에 영향을 주지 못하였다(p>0.05)(Fig. 3C).

4. M E K 억제제와 P I 3- kin a s e 억제제가 췌장암세포주의 E RK 활성도에 미치는 영향 우태아혈청이나 EGF 두 가지로 세포주를 자극 시 모두 ERK 활성도가 대조군에 비하여 증가되었 다(Fig. 4, 5). 무혈청 세포주에 PD98059 20 μM를 첨가하였을 때 ERK 활성이 억제되었으며, PD98059 20 μM를 첨가하고 우태아혈청이나 EGF로 세포주 를 자극하였을 때도 역시 ERK 활성이 억제되었다 (Fig. 4, 5). 그러나 무혈청 세포주에 wortmannin을 150 nM 첨가하였을 때는 ERK 활성이 억제되지 않 았으며, wortmannin을 150 nM 첨가하고 우태아혈 청이나 EGF로 세포주를 자극하였을 때도 역시 ERK 활성이 억제되지 않았다(Fig. 6).

고 찰

아직까지 췌장암세포주의 증식기전은 잘 알려져 있 지 않았는데 췌장암의 약 80-90%에서 K-ras 유전자 변이가 있다고 알려지고 K-ras 이후의 신호전달체 계가 밝혀짐에 따라 증식기전을 밝힐 수 있는 가능 성이 제기되었다. Ras는 GTP와 결합하는 작은 G 단백의 일종으로 farnesyl 지질에 의해 세포막에 항 상 붙어있다. 외부의 자극을 받아 Ras에서 GDP가 떨어지고 GTP가 부착하게 되면 Ras가 활성화되는 데 활성화된 Ras에 의해 그 다음 단계의 신호전달 물질들이 차례로 활성화된다. Ras가 활성화되면 Ras 자체가 GTPase의 기능을 갖고 있어 활성화되면 서 부착되었던 GTP를 GDP로 다시 변화시켜 비활 성화 된다. 그런데 췌장암에서 흔히 발견되는 Ras 유전자 변이는 제12번째 codon에 변이가 생겨서 glycine이 aspartic acid나 valine, arginine 등으로 변 이가 된 것인데 이러한 변이형은 Ras의 GTPase 기 능이 없어져 Ras에 부착된 GTP를 GDP로 변화시키 지 못하여 오랜 동안 활성화 상태로 남아있게 된다.

따라서 Ras에 GTP가 결합된 상태로 존재하는 세포 는 외부의 신호가 없이 계속적으로 다음 단계의 신 Fig. 3. Effects of wortmannin on pancreatic cell prolifera-

tion. The cells were treated with wortmannin and incuba- ted for 48hrs in serum free media or in 10% FBS media or in 20 ng/ml EGF supplemented serum free media and the proliferation was measured by 3H thymidine incorpora- tion. Wortmannin does not suppress cell proliferation in MiaPaCa-2 and Panc-1 cell lines which were cultured in serum free media (A), in 10% FBS media (B) and in 20 ng/ml EFG supplemented serum free media (C). Results are expressed as the percentage increase from control value and are the mean±SEM of three separate experiments.

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378 The Korean Journal of Gastroenterology : Vol. 36, No. 3, 2000

호전달물질들에 신호를 보내어 세포의 분열과 증식 을 촉진시키게 된다. 이런 비정상적인 세포의 분열 과 성장은 암화반응에 필수적인 요소이다. 그러나 아직까지 췌장암세포주에서 K-ras 유전자 변이의

역할 및 신호전달체계의 역할에 관한 연구는 별로 없는 실정이다.

EGF는 K-ras 수용체를 자극하는 성장인자이며 혈청 없이 배양된 정상 췌장세포주의 생명을 유지 Fig. 4. Effects of PD98059 on ERK activity in MiaPaCa-2 cell line. The

cells were treated with PD98059 for 2 hrs before addition of 10% FBS or 20 ng/ml EGF and incubated for 15 min. The cell lysates were subjected to SDS-PAGE followed by immunoblotting with anti-phosphorylated ERK antibody and anti-ERK antibody. PD98059 suppressed phosphorylation of ERK in MiaPaCa-2 cell line incubated in serum free, 10% FBS, EGF media (upper panel). Total ERK amounts were the same in each lane (lower panel).

Fig. 5. Effects of PD98059 on ERK activity in Panc-1 cell line.

Panc-1 cells were treated with the same methods as described in Figure 4. PD98059 suppressed phosphorylation of ERK in Panc-1 cell line incubated in 10% FBS, EGF media (upper panel). Total ERK amounts were the same in each lane (lower panel).

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Ryu, et al. Role of MAP Kinase and PI 3-Kinase on Cell Proliferation in Pancreatic Cancer 379

한다고 알려져 있다.21 췌장암세포주 및 췌장암세포 조직에서 EGF 수용체가 과발현되어 EGF가 췌장암 세포 성장에도 어떤 역할을 한다고 시사되었다.22,23 Panc-1과 MiaPaCa-2 세포주에서 EGF는 단백과 DNA의 함량을 증가시킴을 보고하였으며,24 이후 3H thymidine 방법으로 측정한 결과 MiaPaCa-2에서는 5-6배의 증식을 유도하였으나 Panc-1에서는 효과가 없다고 하여 세포주마다 효과가 다르다고 보고하였 다.25 그러나 EGF의 농도에 따른 증식의 촉진 정도 에 차이는 없다고 하였다.26 또 다른 보고에 의하면 Panc-1 세포주에서 EGF는 증식을 촉진하는 효과가 없으며 이는 아마도 K-ras 유전자 변이로 인하여 이 미 신호전달체계가 활성화 되어 있어 EGF가 더 이 상의 역할을 하지 못하는 것으로 설명하였다.27 본 연구에서는 Gillespie 등25의 연구와 같은 방법으로 실험을 하였지만 EGF는 췌장암 세포주의 증식에 영향을 미치지 못한 것으로 나타나 상반된 결과를 보인다. 최근의 실험 결과에 의하면,28 MiaPaCa-2와 Panc-1 등 췌장암세포주를 장기간 배양을 하면 EGF 수용체가 이미 과량으로 세포막에 발현되어 있어 외부의 EGF에 반응을 잘 하지 않는다는 사실을 보 고하여 EGF에 대한 상반된 실험 결과를 설명하였

다. 본 연구에서도 실험을 반복하면서 세포주를 비 교적 장기간 배양하였으므로 EGF가 세포증식에 미 치는 영향이 사라졌을 가능성이 있다. 그러나 본 연 구에서 EGF 투여시 ERK의 활성도가 증가됨에도 불구하고 세포성장은 촉진시키지 못한 점으로 미루 어 볼 때 EGF가 ERK의 활성화에는 어느 정도 기여 하지만 세포성장을 위하여는 아마도 ERK 활성화 이외의 또 다른 경로가 필요할 가능성이 있음을 시 사한다. EGF 이외에 fibroblast growth factor와 transforming growth factor가 췌장암세포주의 성장 을 촉진시키며 ERK를 활성화시켜 증식에 중요한 역할을 하며 이들의 수용체를 차단하였을 때 세포 증식이 억제된다는 보고가28,29 있어서 이들 성장인 자와 췌장암 증식에 대해서는 향후 더 많은 연구가 필요하다.

MAP kinase 신호전달체계가 밝혀지고 MEK의 특이억제제인 PD98059가 발견됨에 따라 MEK 억제 제가 세포증식에 미치는 역할에 관한 여러 연구가 있어 왔다. PD98059는 세포의 종류에 따라 영향이 다른데 증식을 억제하기도 하고, 분화에만 영향을 주기도 한다.6,7,30-32 췌장암세포주인 MiaPaCa-2 세포 주를 phospholipase A2로 자극하였을 때 PD98059는 Fig. 6. Effects of wortmannin on ERK activity in MiaPaCa-2 cell line. MiaPaCa-2

cells were treated with wortmannin for 2 hrs before addition of 10% FBS or 20 ng/ml EGF and incubated for 15 min. The cell lysates were subjected to SDS-PAGE followed by immunoblotting with anti-phosphorylated ERK antibody, anti-ERK antibody. Wortmannin did not suppress phosphorylation of ERK in MiaPaCa-2 cell line incubated in serum free, 10% FBS, EGF media (upper panel).

Total ERK amounts were the same in each lane (lower panel).

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380 대한소화기학회지 : 제 36 권 제 3 호 2000

용량에 비례하여 증식을 억제하고 MAP kinase의 활성도를 억제한다는 보고가 있다.10 최근의 결과에 서도 역시 PD98059는 농도에 비례하여 췌장암세포 주의 증식을 현저히 억제하고 ERK 활성도도 억제 됨을 보고하였다.28 본 연구에서도 PD98059는 성장 인자의 유무에 관계없이 세포증식을 억제하였으며 ERK의 활성도도 저하되는 점으로 보아 ERK를 통 한 신호전달체계가 세포증식에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

PI 3-kinase는 어떤 세포에서는 Ras의 영향을 받 으나 MAP kinase와 다른 경로로 세포의 증식을 촉 진한다고 알려져 있다.33 PI 3-kinase 이후의 신호전 달체계는 아직까지 정확하게 밝혀져 있지 않지만 MAP kinase 경로에도 일부 관여하고,34 serine- threonine kinase Akt를 통하여 신호전달을 한다고 밝혀졌다.35 Panc-1과 ASPC-1 등 췌장암세포주에서 Akt 2가 증폭되어 있음이 밝혀졌고,16 췌장암 조직 에서도 20%에서 Akt2 단백 농도가 증가되어 있다 는 보고가 있어,36 Akt가 췌장암에서도 중요한 역할 을 할 것이라고 시사되고 있다. PI 3-kinase 억제제 인 wortmaninn은 인슐린에 의한 세포증식을 억제하 는 것으로 알려져 있으며 암세포주에서는 노화현상 과 유사한 성장의 정지를 일으킨다는 보고가 있다.18 그러나 췌장암세포주에서의 역할은 아직 알려진 바 가 없는데 본 연구에서 PI 3-kinase 억제제가 췌장암 세포주의 증식에 영향을 주지 못한 점으로 보아 PI 3-kinase, Akt2 경로는 MAP kinase 경로에 비하여 세포증식에 있어서 그 중요성이 떨어진다고 볼 수 있다.

최근에는 MAP kinase 신호전달체계가 세포고사 에도 관여한다는 보고가 있는데 세포고사를 유도하 는 경로에도 관여하고 반대로 세포고사를 억제하는 경로에도 관여하는 상반된 결과를 보이고 있다. 그 러나 췌장암세포에서 MAP kinase 신호전달체계가 세포고사에 미치는 역할에 관한 연구는 아직까지 미미한 실정으로 향후 이에 대한 연구가 병행된다 면 췌장암세포의 발암기전을 밝히는 데 도움이 되 리라 생각한다.

요 약

목적: 췌장암의 80-90%에서 K-ras 유전자 변이 가 발견되어 췌장암의 발생 및 증식에 매우 중요한 역할을 함을 추측할 수 있다. Ras는 일련의 신호전 달과정을 거쳐 핵내의 유전자에 영향을 주는데, 현 재까지 알려진 과정 중 대표적인 것이 mitogen activated protein kinase (MAP kinase) 신호전달체계 이다. 또 다른 신호전달경로로 phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase)가 있는데 대장암에서 PI 3-kinase 활성도가 높다는 보고가 있으나 췌장암세 포주에서의 역할은 알려져 있지 않아 어떤 경로가 중요한 역할을 하는지 아직 잘 알려져 있지 않다.

본 연구에서는 K-ras 변이가 있는 췌장암세포주에 서 MAP kinase 경로인 mitogen activated ERK activating kinase (MEK), extracellular signal re- gulated kinase (ERK) 신호전달체계와 또 다른 경로 인 PI 3-kinase를 통한 신호전달체계 중 어느 경로가 세포증식에 중요한 역할을 하는가를 알아보고자 하 였다. 대상 및 방법: 췌장암세포주로는 MiaPaCa2 와 Panc-1을 사용하였다. 세포증식의 정도는 3H thymidine을 이용하여 측정하였다. 우태아혈청이나 epidermal growth factor (EGF)로 세포가 증식되는지 를 알아보았고, MEK 억제제인 PD98059와 PI 3-kinase 억제제인 wortmannin으로 세포의 증식이 억제되는가를 확인하였다. ERK의 활성도는 immu- noblot 방법으로 측정하였다. 결과: 우태아혈청은 농도에 비례하여 췌장암세포주의 증식을 초래하였 으나 EGF는 세포증식에 영향을 미치지 못하였다.

PD98059는 무혈청 배지의 세포주에서 세포증식을 농도에 비례하여 의미 있게 억제하였으며, 우태아혈 청에 의해 유발된 세포의 증식도 역시 억제하였다.

그러나 wortmannin은 세포의 증식에 영향을 미치지 못하였다. EGF와 우태아혈청은 모두 ERK 활성도 를 증가시켰으며 이는 PD98059에 의해서는 억제되 었으나 wortmannin에 의해서는 억제되지 않았다. 결 론: K-ras 변이가 있는 췌장암세포주에서 PI 3-kinase가 아닌 MEK-ERK 신호전달체계가 세포증 식에 중요한 역할을 한다. 즉 Ras-MEK-ERK 신호

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류지곤 외 6인. 췌장암 세포주에서 MAP Kinase와 PI 3-Kinase가 세포증식에 미치는 역할 381

전달체계는 세포의 증식을 촉진시켜 발암기전에 관 여한다고 여겨진다.

색인단어: MAP kinase, MEK, PI 3-kinase, 췌장암

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수치

Fig. 1. Effects of FBS and EGF on pancreatic cell proliferation. The cells were incubated for 48 hrs with FBS or EGF and the proliferation was measured by 3H thymidine incorporation
Fig. 2. Effects of PD98059 on pancreatic cell proliferation.
Fig. 5. Effects of PD98059 on ERK activity in Panc-1 cell line.

참조

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