Durability of the Effect of Proximal Intestinal Bypass Surgery on Glucose Tolerance Improvement: A Pilot Study in Zucker Diabetic Fatty Rats

ORIGINAL ARTICLE

JMBS

투고일: 2012년 3월 12일, 심사일: 2012년 5월 4일, 게재확정일: 2012년 5월 7일 책임저자： 안수민, 경기도 안양시 동안구 평촌동 896번지

한림대학교 성심병원 외과 우: 431-070

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근위부소장우회술의 당내성 개선 효과의 지속성: 제2형당뇨비만쥐 (Zucker Diabetic Fatty Rat)를 이용한 Pilot 연구

한림대학교 의과대학 외과학교실

김영미, 안수민

Durability of the Effect of Proximal Intestinal Bypass Surgery on Glucose Tolerance Improvement: A Pilot Study in Zucker Diabetic Fatty Rats

Young Mi Kim, Soo Min Ahn

Department of Surgery, Hallym University College of Medicine, Seoul, Korea

Purpose: DJB has been shown to ameliorate type2 diabetes in rodents and in short-term clinical studies. We sought to characterize the effect of DJB on glycaemia control and its durability in longitudinal study. Materials and Methods:ZDF rats aged 18 weeks randomly underwent DJB, sham-operation with pair-feeding (PF) and sham operation with ad-libitum feeding (AL). Body weight (BW) and food intake (FI) were measured daily. Longitudinal sequential tests of fasting glycemia and oral glucose tolerance test (OGTT) were performed periodically up to 12 weeks after surgery. Results: DJB animals decreased in FI immediate postoperatively and recovered to preoperative level 4 weeks after surgery. There were no differences in BW among groups throughout the study period. DJB animals showed greater GT than PF and AL groups at 2 weeks after surgery (AUC-OGTT2wk; 39,736±1,100 vs. 50,501.±1,171 vs. 44,602±829 mg/dl*min, respectively; P=0.012).

However, 4 weeks after surgery GT deteriorated in DJB rats and became similar to controls. At 12 weeks after surgery GT in DJB rats became similar to baseline (P>0.05) and better than controls (AUC-OGTT, 45,790±1,987 vs. 52,250±1,416 vs. 54,311±2,918, respectively; P=0.041). Fasting glycemia and glucose challenge-2hr glycaemia in DJB were significantly lower than in controls at 2 and 12 weeks after surgery. Conclusion: DJB leads to early improvement of glycemia in ZDF rats, an effect which appears to be weight-independent. This longitudinal study, however, showed an attenuation of the glucose lowering effect over time in ZDF rats.

Key Words: Type2diabetes, Duodenojejunal bypass, Glucose tolerance, Duarability

서론

르와이위우회술(Roux-en-Y gastric bypass, RYGB)의 제2 형당뇨조절 효과의 기전에 대해서는 전장관가설(foregut hypothesis)과 후장관가설(hindgut hypothesis)이 두 축을 이

루고 있다.(1,2) RYGB는 위섭취제한(gastric restriction)과 근 위부소장우회(proximal intestinal bypass)의 두 가지 술식의 조합으로 이루어지지만, 혈당조절에 관여하는 중요한 부분은 근 위부소장으로부터 음식물의 통과를 배제시키는 것이라는 foregut 가설에 대한 연구 결과가 동물실험과 단기적인 임상보

고를 통해 증명되고 있다.(3-5) 근위부소장우회의 당뇨조절 효 과를 증명하기 위해 실험동물에서 디자인 된 위공장합술의 고무 적인 결과를 바탕으로, 이 효과를 임상에 구현하기 위한 시도가 있었지만, 최근까지는 단지 1년 미만의 단기 보고가 있을 뿐이 다.(6-9) 당뇨조절효과의 장기적인 지속성에 대한 동물실험 및 임상연구는 현재까지 보고된 바가 없다.

ZDF (Zucker Diabetes Fatty) rat은 leptin receptor 결핍에 의하여 비만과 제2형당뇨병을 동반하는 모델로서, 비만대사수 술의 효과의 연구에 널리쓰이고 있다.(10-14) 본 연구는 제2형 당뇨가 동반된 비만환자에서의 DJB 수술의 장기적인 혈당강하 효과를 예측해 보기 위하여, 제2형당뇨를 동반한 비만쥐를 이용 하여 DJB 수술을 시행한 후 공복혈당(fasting glycaemia, FG)과 당내성(glucose tolerance, GT)의 변화를 평가하려한다.

대상 및 방법

1. 연구 프로토콜 요약

생후 18주 된 ZDF rat를 DJB, PF (sham-operation and paired feeding with same amount of food consumed by DJB animals) 및 AL (sham-operation and ad libitum feeding) 그 룹에 무작위 배분하였다. 수술 후 FI (food intake, 섭취량)과 BW (body weight, 체중)의 변화를 제어하고 비교하기 위하여 PF 그룹을 포함시켰다. FI와 BW는 매일 측정하였다. FG (fasting glucose, 공복혈당)을 측정하고 OGTT (oral glucose tolerance test, 경구혈당부하검사)를 이용하여 GT (glucose tolerance, 당내성)를 수술 전과 수술 후 12주간 일정 간격으로 측정하였다.

2. 수술 전 평가와 실험쥐 관리

16주령의 ZDF (male; fa/fa) rat를 구매하여 습도와 온도가 일정한 실험동물실에서 12시간 간격의 밤낮 주기를 유지하며 1 주간의 적응기를 부여하였다(Charles River Laboratory, Tokyo, Japan). 실험동물은 식수와 사료(Purina Lab diet

#5008, Purina Mills, St. Louis, MO)를 자유롭게 공급받았다.

제2형당뇨병의 완전히 발현된 실험동물만을 실험에 포함시키 기위하여, 수술 1주일 전에 OGTT를 시행한 후 당뇨전단계 (pre-diabetic glucose intolerance) 동물을 제외하였다. 최초 구입된 26마리의 쥐 중에서 6마리가 제외되었으며, 수술 후 생 존률을 고려하여 세 그 룹에 무작위로 배분되었다(DJB, n=10;

PF, n=5; AL, n=5).

3. 수술방법

실험동물은 수술 전 12시간 금식시킨 후 흡입마취를 이용하

여 마취하였다(2% isoflurane and oxygen, 2 L/min). DJB는 위 장의 해부학적 구조와 기능을 보존하면서, 사람의 standard RYGB시행시에 적용되는 25%의 근위부소장우회술을 적용하였 다. 유문부 직하방의 십이지장을 절단하고 원위부를 봉합하였 다. Treitz ligament로부터 10 cm 하방의 공장을 절제하고 원위 부를 절제된 십이지장 근위부에 단문합하여 alimentary limb를 만들었다. 절단된 공장근위부를 십이지장공장문합부위로부터 15 cm 하방에 단측문합하여 bilio-pancreatic limb를 르와이 형태로 재건하였다. Sham 수술은 DJB수술시와 동일한 소장 부 위의 anti-mesenteric border에 횡절개를 가한 후 일차봉합하 는 것을 원칙으로 하였으며, 마취시간을 DJB와 동일하게 유지한 후 폐복하여 수술 및 마취에 따른 편향(bias)을 제거하였다.

4. 섭취량과 체중 측정

섭취량과 체중은 매일 오전 8시에 측정하였다. PF 그룹의 실 험동물 각각에게는 DJB 그룹의 실험동물이 전날 섭취한 평균량 과 동일한 사료를 매일 계산하여 제공하였다.

5. 경구혈당부하검사(oral glucose tolerance test, OGTT) OGTT는 수술 전 1주, 수술 후 2, 4, 6, 12주에 시행하였다. 12 시간 금식한 후 의식이 명료한 상태에서 하루 중 일정한 시간에 시행하였다(08:00 am). 2 g/kg 50% dextrose를 사용하여 oral gavage (Hospira, Lake Forest, IL, USA)를 시행했으며, 0, 30, 60, 120, 180분에 tail vein cutting method로 채혈한 후 SI2700 SELECT^TM Biochemistry Analyzer (Biocompare, San Francisco, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 당내성(glucose tolerance, GT)은 AUC-OGTT (area under the curve of OGTT)로 표현하였으며, 0분부터 180분까지의 OGTT excur- sion 곡선 상에서 혈당측정 간격에 따라 이등변사각형면적측정 법(trapezoidal rule)을 이용하여 계산하였다.

6. 통계적 유의성 검정

측정치는 means±S.E.M로 표시하였으며, 동일 시점에서 세 그룹의 변수의 평균값 비교는 one-way ANOVA를 이용하였고, 세 그룹 간의 측정치 변화 양상의 비교는 RMANOVA (repeated measure of ANOVA)를 이용하였다. 그룹 내 변수의 평균값의 변화는 paired-Student’s t-test를 이용하였다. 필요한 경우 비 모수적 검정(Mann-Whitney, Kruskal-Wallis)을 사용하였고, 통계적 유의성은 P＜0.05로 채택하였다.

Fig. 2. There was no difference in weight gain between DJB and PF animals throughout the study period.

Fig. 4. Only DJB animals tended to ameliorate glucose tolerance 2 weeks after surgery (*P=0.063 by paired t-test). The glucose tolerance in DJB animals deteriorated again, however maintained at baseline levels (**P=0.032 by RMANOVA with Turkey’s post hoc test).

Fig. 1. DJB rats had reduced food intake compared to AL controls at 2 weeks postoperatively and blunted over time (*P＜0.05 by ANOVA).

Fig. 3. DJB animals showed greater glucose tolerance 2 weeks after surgery compared to sham-operated controls (*P＜0.05 by ANOVA). The effect attenuated at 4 and 6 weeks after surgery, however, it was recovered at 12 weeks postoperatively.

결과

1. 섭취량과 체중

수술 전 세 그룹간의 섭취량(DJB vs. PF vs. AL=36.8±1.8 g vs. 36.8±2.8 g vs. 36.5±2.5 g; P＞0.05), 체중(381.8±16.0 g vs. 378.8±25.7 g vs. 376.8±11.1 g; P＞0.05), 공복혈당 (154.5±6.8 mg/dl vs. 151.4±10.0 mg/dl vs. 149.0±13.4 mg/dl; P＞0.05), 및 경구혈당부하검사 상 당내성(AUC-OGTT, 43,155±1,028 mg/dl*min vs. 41,912±902 mg/dl*min vs.

43,436±1,443 mg/dl*min; P＞0.05)의 차이는 없었다. 수술 후 전 기간동안 DJB그룹의 섭취량은 PF그룹과 동일하게 유지하 였다. DJB 그룹의 섭취량은 AL그룹과 비교해서는 4주까지 적게

유지되었으나(2, 4 week; DJB vs. AL; 27.3±5.6 vs. 36.3±

6.6, 30.6±3.3 vs. 37.5±1.9; P=0.03, P=0.00, respectively), 6주 이후에는 통계적 유의성이 소실되었다(Fig. 1). 수술 후 전 기간동안 세 그룹간의 체중의 차이는 없었다(Fig. 2).

2. 당내성(Glucose tolerance)

DJB 그룹은 수술 2주후 PF 및 AL그룹과 비교하여 우세한 내 당능을 보였다(AUC-OGTT2wk, 39,736±1,100, 44,602±

829.2, 50,501.3±1,171.8 mg/dl*min; P＜0.01) (Fig. 3). 세 그룹 간 내당능의 차이는 4주와 6주째 소실되었다(Fig. 3). DJB 그룹의 우세한 내당능 효과는 수술 후 12주에 다시 유의하게 회

Fig. 5. PF animals showed better fasting glycaemia (A) and glucose challenge-2 hr glycaemia (B) compared with AL animals at 2 weeks postoperatively. However, this effect disappeared completely over time (*P＜0.05).

복되었다(AUC-OGTT, 45,790±1,987 vs. 52,250±1,416 vs.

54,311±2,918 mg/dl*min, respectively; P=0.041) (Fig. 3).

오직 DJB 그룹만이 수술 전과 비교하여 수술 후 2주째에 당내성 이 개선되는 경향(Δ AUC-OGTT2wks=－7.9±2.5%, AUC- OGTTsubstract (2 week-preop)=－3,418±1,767 mg/dl*min; P=

0.063)을 보였다(Fig. 4). 수술 후 기간의 경과에 따라서 PF과 AL 그룹의 당내성은 지속적인 악화를 보이는 반면, DJB 그룹의 내 당능 악화 정도는 다른 두 대조군과는 다르게 더 이상 진행하지 않았고(P=0.021 by RMANOVA, P=0.032 by Turkey’s post hoc test), 12주째부터는 수술 전과 통계적으로 유의한 차이를 보 이지 않았다(Δ AUC-OGTT12 week=6.1±2.1%; P=0.091) (Fig. 4).

3. 공복 및 당부하 2시간 후 혈당(Fasting glycaemia and glucose challenge-2 hr glycaemia)

수술 2주째 DJB와PF그룹 간의 공복혈당의 차이는 없었으나 (P=0.19), AL과 비교하여 두 그룹 모두 유의하게 낮았다(139±

7.7 vs. 156±9.0 vs. 187±7.6 mg/dl, respectively; P=0.037, P=0.021 by ANOVA with post hoc, Fig. 5A). 수술 후 12주째 DJB의 공복혈당은 PF및 AL과 비교하여 유의하게 낮았다(173±

13.9 vs. 212±8.8 vs. 219±23.3 mg/dl, respectively; P＜

0.05 by ANOVA with post hoc, Fig. 5A). 수술 2주째 DJB의 당 부하 2시간 후 혈당은 PF와 비교하여 낮은 경향을 보였으나 통계 적 유의성은 없었고(224±6.8 vs. 245±7.5 mg/d; P=0.071), 두 그룹 모두 AL과 비교하여 유의하게 낮았다(vs. 277±4.9 mg/dl; P=0.000, P=0.012 by ANOVA with post hoc) (Fig.

5B). 수술 후 12주째 DJB의 당부하 2시간 후 혈당은 PF 및 AL과 비교하여 유의하게 낮았다(249±10.9 vs. 280±8.2 vs. 284±

10.3 mg/dl, respectively; P=0.041 by ANOVA) (Fig. 5B).

고찰

ZDF (Zucker Diabetes Fatty) rat은 leptin receptor (fa/fa) 결핍에 의해서 비만과 제2형 당뇨가 유도되어 비만과 이와 동반 된 insulin resistance를 기본 병태생리로 가진 사람의 제2형 당 뇨병 연구에 널리 이용되고 있다.(15,16) 당뇨가 발현된 ZDF rat 의 생애주기(life span) 1개월은 사람의 생애주기 약 1.5년에 해 당하여, 본 연구에서의 수술 후 추적관찰기간은 사람의 경우 수 술 후 최소 5년 이상의 기간에 해당한다. 따라서 본 연구에서 ZDF rat을 이용한 수술 후 장기간의 섭취량, 체중, 당내성 변화 의 관찰을 통해서, 현재까지 연구 보고가 없는 임상에서의 DJB 수술 후 장기 추적 검사 결과를 예측하고, DJB의 임상 적용 가능 성을 타진하는 데에 유용한 자료로 활용될 수 있다.

예측했던대로 수술 직후 오직 DJB만이 뚜렷한 당내성의 개선 을 보여주었다. 이 기간 동안 DJB의 섭취량이 AL 또는 수술 전의 그것과 비교해서 일시적으로 감소했으므로, 섭취량 감소에 의한 혈당강하 효과를 완전히 배제할 수는 없었다. 그러나 섭취량을 DJB와 완벽하게 일치시킨 PF보다도 현저한 당내성의 개선을 보 였고, 반면 PF는 DJB그룹과 동일한 섭취량을 공급받았음에도 불구하고, 초기 혈당 개선 효과를 전혀 유도하지 못하고 AL과 유 사하게 오히려 혈당이 악화되는 경향을 보였다. 체중 역시 DJB 는 수술 직후 일시적인 감소가 있었으나 2주 이후 빠르게 회복되 었고, 세 그룹 간에는 수술 전 기간에 걸쳐서 체중의 차이가 나타 나지 않았다. 또한 수술 후 전 기간 동안 PF는 DJB그룹과 체중의 변화에 있어서 동일한 변화 양상을 보였다. 그럼에도 불구하고 DJB만이 수술 전에 비하여 현저한 혈당강하 효과를 나타냄으로 써 근위부소장우회술 자체가 비만대사수술 후 초기 혈당조절에 중요한 역할을 함을 알 수 있다. 또한 이러한 초기 혈당 조절 효과

는 섭취량 및 체중의 변화와 무관함을 증명할 수 있었다.

DJB 수술이 단기적으로 현저한 혈당개선 효과를 유도하고, 초기에 대조군에 비해 월등한 내당능을 보였으나, 기간의 경과 에 따라서 혈당강하 효과가 약화되는 경향을 보였다. 흥미로운 것은 장기 관찰 결과, PF 및 AL그룹과의 섭취량 및 체중 변화의 차이가 소실되었음에도 불구하고, 두 대조군과 비교하여 당내성 이 우세한 결과를 다시 보여주었다는 점이다. 특히 PF과 AL과 함 께 점진적으로 악화되던 DJB 그룹의 당내성이 12주에 이르러서 는 두 대조군과는 확연히 다른 변화를 보이면서 수술 전 수준으 로 다시 회귀하는 양상을 보였다. ZDF rat의 profiling data에 따 르면, ZDF rat는 생후 10-12주령에 완전한 당뇨를 발현한 이후, 혈당의 증가 속도가 매우 빠르게 진행하고 췌장의 인슐린 분비기 능이 지속적으로 감소하는 특징이 있다. 이는 유전적으로 미리 프로그래밍되어 형질 발현되므로 빠르고 지속적인 제2형 당뇨 병의 악화를 특징으로 한다. 이런 점을 감안한다면 비록 초기 혈 당개선 효과가 소실되는 시기가 나타나지만 장기 추적 관찰 결과 에서 대조군의 악화정도와는 차별되는 양상을 보인다는 것은 매 우 고무적인 결과이다. DJB수술이 근위부소장으로부터의 음식 물의 우회에 의해서 유도되는 고유한 기전에 의해서 장기적으로 는 ZDF rat에서 혈당 악화를 막아줄 수 있는 근거가 된다고 추측 할 수 있다.

DJB수술 후 2주와 12주에 나타난 혈당 개선 효과는 공통적으 로 공복혈당개선과 동시에 당부하 2시간 후 혈당 개선이 동반됨 으로써 유도되었음을 알 수 있었다. 그러나 장기간 동일한 DJB 와 동일한 칼로리를 섭취한 PF그룹은 초기에 보였던 공복혈당 및 당부하 혈당개선 효과를 4주 이후부터는 급격히 소실한 후 회 복하지 못하였다. 근위부소장우회술은 공복혈당 강하 및 식후 혈당 조절에 효과를 동시에 나타냄을 알 수 있었다.

결론

ZDF rat에서 근위부소장우회술은 수술 초기에 공복혈당과 당내성을 호전시키며, 이 효과는 체중의 감소 및 섭취량 감소와 는 무관한 것으로 보인다. ZDF rat에서 위공장우회술의 초기 당 내성 개선 효과는 기간의 경과에 따라 약화되지만, 계속 진행하 는 당내성의 악화를 예방할 수 있는 것으로 보인다.

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