Vol. 7, No. 4, December, 2000
제 2형 콜라겐에 의해 경구관용 유도된 DBA/1 mice에서의 세포면역반응
경희대학교 의과대학 내과학교실*, 가톨릭대학교 의과대학 내과학교실
양형인*・김완욱・민도준・박성환・홍연식・이상헌・조철수・김호연
─A b s t r a c t─
Tolerogenic Effect of Orally Administrated Type II Collagen in CIA Animal (DBA/1 mice)
Hyung-In Yang, M.D.*, Wan-Uk Kim, M.D., Do-Jun Min, M.D., Sung-Hwan Park, M.D., Yeon-Sik Hong, M.D., Sang-Heon Lee, M.D., Chul-Soo Cho, M.D., Ho-Youn Kim, M.D.
Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, School of Medicine, Kyunghee University, Division of Rheumatology*
Department of Internal Medicine, School of Medicine, Catholic University of Korea, Institute of Immunobiology in Catholic Research Institutes of Mediacl Science
O b j e c t i v e: To investigate the dosage of bovine type II collagen (BnCII) for the induction of oral tolerance in CIA animals, and to verify the changes of immune response and TGF-βproduction of mesenteric lymph node cells in toler- ized CIA animals.
M e t h o d s: Oral tolerance was induced by feeding of variable doses (5μg, 10μg , 2 0μg and 40μg) of BnCII to DBA/1 mice 4 times per week during 2 weeks, and control mice were given ovalbumin (1000μg), before immunization. We examed clinical assessment ; incidence of arthritis, severity of arthritis, arthritic limb by visual analysis. IgG antibodies to BnCII were measured by ELISA, T cell responses to BnCII and PHA were quantified by antigen (CII)-induced 3H - t h y m i- dine incorporation into lymphocytes of mesenteric lymph node, draining lymph
＜접수일 : 2000년 7월 24일, 심사통과일 : 2000년 10월 31일＞
※통신저자 : 양 형 인
서울특별시 동대문구 회기동 1 경희대학교 의과대학 내과학교실
Tel : 02) 958-8219, Fax : 02) 968-1848, E-mail : [email protected]
서 론
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)의 유발 가능한 원인항원으로는 관절의 주요 구성성분 인 제 2형 콜라겐(type II collagen, CII)이 잘 알 려져 있다1 , 2 ). 제2형 콜라겐을 DBA/1 마우스에 주 사하면 R A와 유사한 관절염(Collagen Induced Arthritis: CIA)이 유발된다3 , 4 ). 또한 C I I에 대해 반응하는 T림프구 및 B림프구가 RA 환자의 말초 혈액과 활액에서 존재하며 C I I에 대한 항체가 환자 의 혈청, 활액, 연골 등에서 흔히 발견된다5 - 7 ). 이는 제 2형 콜라겐이 RA 발생의 병인에 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다.
경구관용이란 원인 항원을 반복적으로 경구로 투 여할 경우 항원에 특이면역 반응이 억제되어 질병관
해를 일으키는 현상을 말한다. 실험동물모델에서 다 발성 경화증8 - 1 0 ), 제 1형 당뇨병1 1 ), 특발성 홍채염1 2 ) 의 치료에 항원의 경구투여가 효과적임이 보고되었 다. RA에서는 Thomson 등1 3 )에 의해 C I A에서 2형 콜라겐을 반복적으로 경구투여하여 관절염이 호전되 었음이 보고되어 C I I의 경구투여가 R A의 치료에 적 용될 수 있음이 시사되었다. 그러나 경구 관용유도 에서 CII 경구 투여 농도나 그 기전에 대한 연구는 실험자에 따라 아직 이견이 많다.
경구관용의 기전은 투여되는 항원의 양에 따라 클 론결손/무반응을 일으키거나 T G F -β, IL-4, IL-10 등의 억제성 싸이토킨을 분비하여 병적인 면역반응이
억제된다1 4 ). 경구로 투여된 특정항원에 의해 점막 면
역계의 Th2 및 T h 3 ( T G F -βproducing T cell) 세 포가 유도되고 이들 세포가 병소로 이동하여 억제성 싸이토킨을 분비함으로써 질병을 유발하는 병적 T node, and spleen. TGF-βin supernatants obtained from lymph node culture medium was measured by ELISA.
R e s u l t s: Arthritis limbs were observed in 100% of control at 5 weeks after subcutaneous BnCII injection. The incidences of CIA in all tolerized group were significantly lower than that in control 5 weeks after immunization (control 100
% vs. 5μg feeding group: 50%, 10μg feeding group: 50%, 20μg feeding group:
50%, 40μg feeding group: 55.5%, P<0.01). In comparison to control, mean artic- ular indices were lower in all tolerized groups (control 5.13 : 5μg feeding group 3.50, 10μg feeding group 2.75, 20μg feeding group 2.87, 40μg feeding group 2.63, P<0.05). Arthritic limbs were also significantly lower in tolerized groups (control 58.3 : 5μg feeding group 20.8, 10μg feeding group 16.7, 20μg feeding group 20.8, 4 0μg feeding group 20.8, P<0.05). The titers of IgG antibody to CII were lower in tolerized group than that in control [tolerized group ; median 10 (min. 0, max. 48), control ; median 33 (min. 8.6, max. 101), P<0.05]. The proliferative responses to BnCII were significantly suppressed in tolerized (control 8010±
2319cpm, tolerized group 4500±2060cpm, P<0.01). High TGF-βproduction was noted in tolerized group (control ; 28pg/ml, BnCII feeding group ; 73pg/ml).
C o n c l u s i o n: Oral tolerance in DBA/1 mice was successfully induced from low doses of BnCII (5μg) and suppressed T and B cell function in conjunction with increased TGF-βproduction may play an important role for the induction of CII induced oral tolerance in DBA/1 mice.
Key Words : Collagen-induced arthritis, Oral tolerance, Anti-type II collagen antibody, TGF-β
세포를 억제한다고 생각되고 있으나 아직까지 R A에 서 소장의 점막면역계 혹은 장간막 림프절이 경구관 용에서 어떤 역할을 하는지 직접적인 증거는 없다.
T G F -β는 면역세포에 대해 억제기능을 갖는 싸이 토킨이다. 경구관용이 유도된 자가면역성 뇌척수염 의 실험동물모델에서 T G F -β를 생성하는 r e g u l a t o- ry T림프구가 발견되고1 5 ), CIA에서 T G F -β와 T N F -α와 같은 싸이토킨의 내인성 분비가 관절염의 경과에 중요한 영향을 준다고 알려져 있다8 , 9 , 1 5 , 1 6 )
. 따 라서 T G F -β가 경구관용에서도 중요한 역할을 할 것 으로 생각되나 아직까지 CIA 경구관용유도 실험동 물에서 T G F -β의 역할은 명확히 알려져 있지 않다.
저자는 CIA 실험동물에서 C I I의 경구투여시 관절 염이 어느 농도부터 억제되는지를 확인하고 경구관 용유도 시 장간막 림프구의 B n C I I에 대한 면역반응 과 T G F -β의 형성능을 알아보고자 하였다.
대상 및 방법
1. 항원제조와 콜라겐 유도 관절염( C o l l a g e n induced arthritis ;CIA) 유도
Andrew H Kang 교수(University of Ten- nessee, Memphis, TN)로부터 기증받은 동결건조 된 우형 제 2형 콜라겐(native Bovine type II col- lagen; BnCII)을 10mM acetic acid에 4 m g / m l의 농도로 녹인 후 4 C에서 1 2시간 이상 교반하였다.
B n C I I와 4 m g / m l의 complete Freund adjuvant (CFA) (Difco, Detroit, MA)를 1 : 1로 섞은 후 균 질기( h o m o g e n i z e r )를 이용하여 1 0 0 0 r p m의 속도로 3 0분간 혼합하였다. 실험동물은 주령이 8 ~ 1 2주(약 1 5 0 g m )의 DBA/1 mice (Jackson Lab, West- grove, PN)를 대상으로 하였으며 성별에 따른 오차 를 줄이기위해 교배 및 양산후 수컷 쥐만 선정하였다.
실험동물의 양육과 증산은 모두 specific pathogen free (SPF) 조건( 2 2 C±1 C 항온, 55%±5% 항 습, hepafiltrated air 공급)에서 시행하여 외부 항 원의 감염에 의한 영향을 최소화 시켰다. CIA의 유발 을 위해 B n C I I와 CFA 혼합액 5 0㎕ (CII 100μg＋
CFA 100μg )을 26G 주사바늘과 3 way가 부착된 주 사기를 이용하여 쥐의 꼬리에 피내주사 하였다. 1차 접종후 2주후에 B n C I I와 CFA 혼합액을 1 0 m M acetic acid에 1 : 1로 희석한후 5 0㎕ (BnCII 50μg＋
CFA 50μg )을 발바닥에 추가 접종하여 C I A를 유발 시켰다.
2. 관절염의 임상적 관찰과 평가
관절염의 발생유무와 정도는 추가접종한 다리를 제 외한 나머지 세 다리에서 부종과 발적의 유무 및 정도 로서 평가하였다. 관절염의 관찰은 실험군과 대조군을 알고있지 않은 2명의 관찰자가 수행하여 관찰자에 따 른 오차를 최소화 시켰다. 1차 주사후 3주까지는 주 1 회, 3주부터는 주 3회의 빈도로 관찰하였고 관찰 시기 마다 관절염의 중증도를 기록하였다. 관절염의 중등도 는 아래와 같은 방법에 의해 점수화하였다(Ito 등1 7 )) .
・중증도 0: 부종이나 종창이 없는 경우
・중증도 1: 족근골(mid foot 혹은 tarsal bone) 이나 발목 관절에 국한된 경한 부종과 발적
・중증도 2: 발목 관절에서 족근골에 걸친 경한 부종과 발적
・중증도 3: 발복관절에서 중족골( m e t a t a r s a l b o n e )에 걸친 중등도의 부종과 발적
・중증도 4: 발목에서 발가락 전체에 걸쳐 부종과 발적
중증도 평가 결과를 기초로 하여 관절염의 발생 율, 평균 관절염 지수(Mean arthritis index), 관 절염이 생긴 평균다리의 수(Number of arthritc limb, %)를 아래와 같은 방법으로 구하였다.
・발생율( % )＝중증도 2이상의 관절염을 가진 m i c e의 수/전체 mice 수×1 0 0
・평균 관절지수＝3다리의 중등도의 합을 전체 m i c e에서 합산한 점수/전체 mice 수
・관절염이 생긴 다리의 평균 다리수( % )＝중중도 2 이상의 관절염을 가진 다리의 수/전체 다리의 수×1 0 0 3. 경구 관용 유도(induction of oral tolerance) B n C I I의 경구투여에 의해 관절염의 발생이 억제되 는 지를 확인하기위해 대조군(제 1군)과 실험군(제 2군 에서 5군까지)을 아래와 같은 5개의 군으로 나누었다.
제 1군 : 대조군, ovalbumin 1000μg 또는 acetic acid를 8회 경구투여한 8마리
제 2군 : BnCII 5μg을 8회 경구투여한 8마리 제 3군 : BnII 10μg을 8회 경구투여한 8마리 제 4군 : BnII 20μg을 8회 경구투여한 8마리 제 5군 : BnII 40μg을 8회 경구투여한 8마리
경구관용 유도에 음식에 의한 영향을 최소화하기 위하여 실험동물의 사료는 방사선멸균사료를 사용하 였고 물은 고압증기멸균기로 멸균하여 투여하였다.
항원의 경구투여는 위 세척 주사바늘(ball tipped gastric lavage needle)을 사용하여 1차 주사하기 1 7 일 전부터 주 4회의 빈도로 2주 동안 투여하였다. 경 구 투여 최종일로부터 3일 후에 B n C I I와 CFA 혼합 액을 1차 접종하였고 추가접종하여 관절염을 유발시킨 후 각 군에서 관절염의 발생율, 평균 관절염 지수, 관 절염이 생긴 평균 다리의 수를 관찰하였다(그림 1 ) .
4. 항 IgG 제 2형 콜라겐 항체(anti IgG CII antibody; anti CII Ab) 측정
대조군과 실험군에서 1차 접종후 4주후에 쥐의 혈청 을 분리하여 혈청내 anti CII Ab의 농도를 e n z y m e linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Chondrex, Redmond, WA)를 사용하여 측정하였 다. 혈청은 분리후 측정시까지 - 7 0 C 냉동고에 보관 하였고 4 0 0 0배 희석한 후 희석된 혈청내 항체농도를 표준혈청에 대한 상대값으로 표시하였다. 표준혈청을 100 arbitray unit로 하여 2배씩 연속 희석한 후 측 정된 흡광도들 사이에 직선형의 상관관계가 있음을 확 인하였다(r=0.99, data not shown).
5. BnCII에 대한 림프구 증식반응
림프구 증식반응은 Salomon 등1 8 )의 방법을 수정하
여 다음과 같이 측정하였다. 1차 접종후 4주 후에 대 조군 3마리와 실험군 3마리의 림프절과 비장으로 부 터 세포를 분리하여 세포배양액(10% fetal calf serum, RPMI 1640 supplemented with peni- cillin 100 IU/ml, streptomycin 100mg/ml, 2mM L-glutamine) (GIBCO BRL, Grand Island, NY)에 재부유한 다음 F i c o l l - H y p a q u e으 로 침전분리하여 단핵구층을 분리하였다. 이렇게 분 리된 단핵구를 동일한 배양액에 재부유한 후 9 6 round bottom microtiter well plates (Nunc, Roskilde, Denmark)에 t r i p l i c a t e로 2×1 05/ w e l l 씩 분주하였고 1 0 0μg / w e l l의 B n C I I를 첨가하여 5 % C O2, 37 C에서 5일간 배양하였다. BnCII에 대한 양성 대조항원으로는 1μg/ml PHA (GIBCO BRL) 를 사용하였고 음성 대조항원으로는 1 0 0μg/well 난 알부민을 사용하었다. 배양종료 1 6시간 전에 3H - thymidine (NEN, Boston, MA) 0.5 uCi/well을 넣은 후 cell harvester로 세포를 수집하였고 세포내 결합된 3H - t h y m i d i n e의 양을 베타카운터( P a c k a r d Instrument Co, Downers Groves, IL)로 계측하 여 자극지수(stimulation index; SI)로 표현하였다.
SI= mean cpm in the presence of BnCII / mean cpm in the absence of BnCII
6. TGF-β의 측정
대조군 3마리와 실험군 3마리의 장간막 림프절 세 Fig. 1. Scheme for oral tolerance induction in CIA DBA/1 mice
포를 배양후 7 2시간에 상층액을 수집하였고, 상층액 1 0 0㎕에 1M HCl 10㎕를 처리하여 1시간 동안 얼음 에서 반응시킨후 1M NaOH 10㎕를 처리하여 중화시 켰다. 상층액내 T G F -β의 농도를 E L I S A로 측정하였 다. 약술하면 T G F -β1,2,3 단일클론항체( G e n z y m e , Cambridge, MA) 6.7μg / m l을 5 0㎕/ w e l l씩 9 6 well plate (Nunc Inc)에 넣은 후 4 C에서 1 2시간 배양시켰다. PBS-0.05% Tween 20으로 3회 세척후 PBS-1% BSA-0.05% Tween 20을 1 0 0㎕/ w e l l을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 세척후 T G F -β의 표준항원과 2배 희석된 배양 상층액을 96 well palte 에 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 3회 세척후 1 0 0 n g / m l의 chicken α-hv TGF-β1 (R&D, Min- neapolis, MN)을 5 0㎕/ w e l l씩 넣고 2시간 동안 실 온에서 반응시킨 후 세척후 1:2000 streptavidin- alkaline-phosphate (Dako, Glostrup, Denmark) 5 0㎕/ w e l l씩 넣고 실온에서 다시 1시간 동안 반응시 켰다. 4회 세척후 Diethanolamine (Sigma Bio- science, St Louis, MO)에 녹인 p - n i t r o p h e n y l - phosphate (Sigma Bioscience) 1mg/ml을 5 0㎕
/ w e l l씩 넣어 발색반응을 일으켰고 3 0분 후 a u t o- mated microplate reader (Vmax, Molecular Devices, Palo Alto, CA)로 4 5 0 n m에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 한 개의 표본당 3회씩 측정 하여 평균을 구하였다.
7. 통계처리
대조군과 실험군들의 관절염의 발생율, 평균관절 지수, 관절염이 발생한 평균 다리수의 비교는 S P S S 를 이용한 A N O V A로 분석하였고, IgG 제 2형 콜 라겐 항체는 Mann-Whitney test로 분석하였다.
유의성 판정은 P 값이 5% 미만으로 하였다.
결 과
1. 콜라겐 유도성 관절염 유도(collagen induced arthritis, CIA)
DBA/1 마우스에 B n C I I와 C F A혼합액을 접종후 1 1주 동안 관절염의 발생경과를 관찰하였다. 관절염 은 전예에서 접종후 3주부터 발생되기 시작하여 5주 째는 대조군 8마리 모두에서 생겼으며 이후에는 점 차 감소하여 1 0주까지 지속하였다(그림 2 ) .
Fig. 2. Collagen induce arthritis in DBA/1 mice.
Mice were immunized with 100μg of BnCII and booster injection of 50μg of BnCII was given after 14 days. Upper pannel is the non-tolerized animal (CIA) with joint swelling and redness at 5 weeks after pri- mary immunization: Lower is the tolerized animal with normal appearance. BnCII;
bovine native type II collagen
2. BnCII에 의한 경구관용유도
실험군과 대조군에서 C I A의 발생빈도와 중증도를 평가하였다. 관절염의 발생이 최고를 보인 5주째 관절 염의 발생율을 비교한 결과 대조군은 1 0 0 %에서 관절 염이 발생한 반면, 실험군은 5μg 투여군이 50%, 10μ g 투여군이 50%, 20μg 투여군이 50%, 40μg 투여군 이 5 5 . 5 %에서만 관절염이 발생하여 대조군보다 실험 군에서 관절염 발생율이 의미있게 낮았다( P < 0 . 0 1 ) . 그러나 실험군 네 군간의 차이는 없었다(그림 3 A ) .
관절염의 중증도를 반영하는 평균관절지수( m e a n
articular index)는 모든 군에서 1차 접종후 5주째 가장 높았고 이후 감소하는 경향을 보였다. 5주째 각 군간의 평균관절지수를 비교한 결과 대조군과 비 해 실험군에서 평균관절지수가 의미있게 낮았다 (대 조군 5.13, 5μg 투여군 3.50, 10μg 투여군 2 . 7 5 , 2 0μg 투여군 2.87, 40μg 투여군 2.63, P<0.05).
그러나 실험군 네 군간의 차이는 없었다(그림 3 B ) . 관절염이 생긴 평균 다리수(arthritic limb) 역시 1차 접종후 5주째 가장 높았으며 대조군 58.3%, 5μ g 투여군 20.8%, 10μg 투여군 16.7%, 20μg 투여군 이 20.8%, 40μg 투여군이 2 0 . 8 %로서 대조군에 비
Table 1. Immunological effects in tolerized and non-tolerized (CIA) animals
t o l e r i z e d n o n - t o l e r i z s e d
s t i m u l a t i o n mesenteric LN 2 . 0 4 . 4 1 *
index (SI) inguinal LN 2 . 1 3 . 0 0 *
s p l e e n 1 . 5 2 . 5 8 *
IgG antibodies to BnCII 1 0 ( 0 , 4 8 ) 33(8.6, 101)*
median (min., max.)
Samples were obtained 4 weeks after first immunization.
Stimulation index was calculated by cpm with antigen (CII)/cpm without antigen (CII).
LN ; lymph node * p<0.05
Fig. 3. Clinical assessment of the effects of oral tolerance induction in DBA/1 mice. The incidences of arthritis (CIA) were peak 5 weeks after immu- nization, all tolerized aniamls had lower incidence than control (P<0.01). Mean articular indices were significantly lower in tolerized groups than controls (CIA) (P<0.05). The percent of arthritic limbs were presented more than grade 2. The percent of arthritic limb was significantly lower in tolerized animals than control (P<0.05).
Fig. 3.Dose of BnCII ; ◆0μg ■5μg ▲1 0μg ×2 0㎍ *4 0μg
해 실험군에서 평균다리수가 의미있게 낮았다 (P<0.05, 그림 3 B ) .
3. IgG 제 2형 콜라겐 항체 측정
대조군과 2 0μg 투여군 모두에서 1차 접종후 4주 후에 혈청내 IgG 제 2형 콜라겐 항체를 측정하였다.
결과 실험군의 IgG 제 2형 콜라겐 항체역가의 중앙 값은 1 0 (최소값 0, 최고값 48 arbitray unit)으로 대조군의 항체역가의 중앙값 3 3 (최소값 8.6, 최고값 101) 보다 의미있게 낮았다(P<0.05, 표 1 ) .
4. 제 2형 콜라겐에 대한 림프구 증식반응 B n C I I를 1차 접종후 4주 후에 림프절 세포를 B n C I I와 함께 배양후 5일에 림프구 증식반응을 측정 하였다. 실험군에서 제 2형 콜라겐에 대한 림프구증식 이 억제되었고(대조군 중앙값 7 7 8 2 c p m [ 5 8 4 , 12333], 실험군 중앙값 4380cpm[2296, 6625], P
<0.05), PHA에 대해서는 정상적인 림프구증식을 보 였다(그림 4). 림프절세포와 비장세포의 P H A에 대한 세포증식은 장간막림프절의 자극지수(대조군 4 . 4 1 , 실험군 2.0), 유출림프절의 자극지수(대조군이 3, 실 험군 2.1), 비장세포의 자극지수(대조군 2.58, 실험군 1 . 5 )가 모두 실험군에서 대조군 보다 낮게 나타났고 이러한 세포증식의 차이는 장간막 림프절 세포에서 가 장 뚜렷하였다(표 1 ) .
5. TGF-β의 생성
B n C I I를 1차 접종후 4주 후에 장간막 림프절 세 포를 배양하여 그 상층액으로부터 T G F -β를 측정하 였다. 제 2형 콜라겐으로 자극하였을 때 대조군과 비교하여 실험군에서 높은 T G F -β평균분비양을 보 였다(대조군 28pg/ml, 실험군 73pg/ml, 그림 5 ) .
고 찰
C I A는 T r e n t h a m이 백서에 human type, chicken type, rat type 제 2형 콜라겐을 피내주 사하여 3 3 % ~ 5 0 %의 관절염을 유발시킨다고 보고한
3 ) 이래 인체 류마티스 관절염의 중요한 실험모델로 받아들여지고 있다. 백서와 생쥐에서 CIA 발생 빈 도가 다르게 보고되고 있는 것은 주조직적합성 유전 자(major histocompatibility complex class II) 와 연관이 있다1 9 ). H-2q h a p l o t y p e을 가진 D B A / 1 m i c e에는 5 0 % ~ 7 5 %의 발생율을 보이며 우형, 유 형, 인형 2형 콜라겐에 감수성을 보인다2 0 ). 본 실험 에서 DBA/1 mice에 B n C I I을 피내 주사하여 전 예 에서 5주 후 관절염이 유도되었고, 실험군에서도 용 량에 상관없이 모두에서 5주째 최고 발생율울 보였 다. 이와 같은 결과는 제 2형 콜라겐이 관절염을 유 도한 것으로써 이 항원이 C I A의 발생과정에 관여하 는 중요한 항원임을 암시하고 있다.
Fig. 4. Proliferative response to BnCII in mesenteric lymph node cells obtained from CIA and tolerized mice. Lymphocyte proliferative responses against CII were suppressed in tolerized animals. Acetic acid was negative control. CII ; type II collegen, PHA; phyto- hemagglutinin, cpm; count per minute
Fig. 5. The production of TGFβfrom mesenteric lymph node cells : cells were cultured with CII. Superantant were collected at 72 hour of culture. Repeated measure (×2) showed similar results. CII; type II collagen
경구관용의 유도는 실험군 모두에서 대조군 보다 의미있게 낮은 관절염 발생을 보여 경구관용이 성공 적으로 이루어진 것을 알 수 있었다. 관절염이 절정 에 도달했던 5주째 실험군간의 차이는 뚜렷하지 않 았다. 평균관절지수로 나타낸 관절염의 중증도도 발 생율과 같이 대조군과 비교하여 실험군 모두에서 의 미있게 낮았으며, 관절염이 절정에 이른 5주째 모든 실험군에서 최고 관절지수를 보였다. 이시기의 실험 군간의 차이는 뚜렷하지 않았다. CIA의 실험동물에 서 경구관용을 일으키는 용량은 대개 1 0 ~ 2 0μg으로 보고되고 있으며 사람을 대상으로 경구관용 유도를 일으키기 위해서는 이 보다 더 많은 양이 요구된다 고 알려져있다2 1 - 2 3 ). 저자의 결과는 5μg부터 의미있게 경구 관용유도가 관찰되었다. 통계학적인 유의성은 없었지만 저자의 결과는 경구 투여 CII 용량을 증가 시킴에 따라 관용유도가 더 잘 일어나는 현상을 관 찰하였다.
경구관용의 육안적 임상평가를 면역학적 실험방법 으로 증명하기 위하여 체액성면역반응과 세포성면역 반응을 조사하였다. 체액성 면역반응을 조사하기 위 해 IgG 제 2형 콜라겐 항체를 E L I S A로 측정하였 다. RA 환자에서 제 2형 콜라겐 항체의 빈도는 3 % ~ 8 8 %로 다양하게 보고되고 있다2 4 - 2 7 ). 이 항체를 순수분리하여 실험동물에 주사하면 관절염을 유발하 여 이 항체가 R A의 발병기전에 중요한 역할을 할 것으로 생각되고 있다. 이 항체는 R A의 골미란 발 생과 연관성이 있는 것으로 보고되어 있고, 일부 보 고에서는 경구관용을 유도하면 항체가가 감소하여 관절염의 임상경과를 반영할 수 있다고 한다2 8 ). 저자 의 결과는 실험군에서 제 2형 콜라겐이 대조군과 비 교하여 의미있게 낮은 항체가를 보여 CII 항원 특이 T세포 의존 B세포 반응이 억제되었음을 의미하는 것으로 생각된다.
C I A는 nude 쥐에서는 발생하지 않으며, 제 2형 콜라겐을 주사전에 CD4 및 T 세포수용체에 대한 단 일클론 항체를 전처치하는 경우 관절염발생이 억제 되고, 제 2형 콜라겐에 반응하는 T세포주( C I I - reactive T cell line)를 정상 생쥐에 면역전달 (adoptive transfer)하면 관절염 유도가 가능하다 는 것이 보고되어있다2 9 - 3 1 ). 이는 C I A의 발생이 T세 포 의존성으로 제 2형 콜라겐에 반응하는 T임파구가 관절염의 발생에 중요한 역할을 시사하는 소견이다.
저자의 결과에서 대조군인 C I A의 림프절세포는 C I I 에 대하여 증식반응을 보여 CIA 실험동물내에 C I I 에 대해 반응하는 T세포가 있음을 의미하고, 경구관 용을 일으킨 실험군의 림프절세포가 C I I에 대해 세 포증식이 억제된 것은 경구관용이 T세포억제를 통하 여 일어남을 시사한다고 생각된다. 장간막림프절, 유출림프절과 비장세포를 미토겐으로 자극하였을 때 실험군에서 의미있게 낮은 자극지수를 보였고 말초 면역계를 반영하는 비장에서도 T세포반응이 장간막 과 같이 억제되어있어 이는 경구관용이 유도되면 장 간막림프절의 T세포가 억제되고 이 세포가 말초로 이동하여 표적기관에 면역억제효과를 나타낸다는 가 설을 뒷받침한다.
T G F -β의 면역계에 대한 기능은 세포의 종류에 따 라 상반되게 나타난다. T세포와 B세포의 성장을 억 제하고 B세포의 M면역글로블린과 G면역글로블린의 생산을 억제하는 것으로 알려져 있다3 2 , 3 3 ). 반면 단핵 구에 대해서는 화학주성효과를 나타내게 하고 이들 세포로 부터 인터루킨- 1 ( I L - 1 )이나 인터루킨- 6 ( I L - 6 )와 T N F -α같은 염증매개인자를 분비하게 한다3 4 ). T G F -β의 경구관용에서의 역할은 항원특이 T세포와 B세포의 성장을 억제하여 면역반응을 억제시키는 것
3 5 , 3 6 )으로 생각되고 있다. Friedman 등3 7 )은 실험자
가면역성 뇌척수염을 일으킨 백서와 쥐에 기니피그 수초기본단백질(myeline basic protein ; MBP)을 경구투여하여 경구관용을 유도할 수있었고 림프절세 포 배양에서 T G Fβ와 I L - 4의 분비가 증가되어있어 이 싸이토킨이 경구관용을 일으키는데 중요한 역할 을 할 것으로 보고하였다. 이외에도 많은 연구자들 에 의해서 T G F -β가 C I A와 R A에서 면역세포를 억 제하여 염증을 감소시키는 것으로 보고하여 T G F -β 가 경구관용의 면역억제효과를 매게하는 중요 기능 을 하는 것으로 생각된다. 본 연구에서도 실험군에 서 T G F -β생성능의 증가를 보여 경구관용이 유도된 동물에서 장간막 림프구가 반응하고 이들 세포들이 면역억제기능을 가진 T G F -β를 분비하여 면역반응을 억제시킨다는 가설을 뒷받침하고 있다.
결 론
콜라겐유도성 관절염의 실험동물에 우형 제 2형 콜 라겐을 경구투여하여 경구관용을 유도할 수 있는지
관찰하고, 이를 면역학적인 실험방법으로 증명하고자 하였다. 관절염의 임상경과를 육안적으로 관찰하여 발생빈도, 중증도, 관절염이 발생한 평균다리수를 조 사하였고 면역학적인 방법으로는 제 2형 콜라겐 항체 를 측정하여 B세포 반응을, 제 2형 콜라겐에 대한 림프절세포와 비장세포 증식반응을 측정하여 T세포 반응을 조사하였다. 결과는 모든 실험군과 대조군에 서 콜라겐주사후 5주째 관절염의 발생과 중증도가 절 정에 도달하였다. 대조군에서는 전 예에서 관절염이 발생하였다. 모든 실험군( 5μg 이상)에서 5주째 대조 군과 비교하여 관절염발생율, 평균관절지수, 관절염 이 발생한 평균다리수가 의미있게 낮았다. 제 2형 콜 라겐 항체는 대조군과 비교하여 실험군이 의미있게 낮은 역가를 보였다. 경구관용이 유도된 실험군에서 대조군과 비교하여 장간막림프절, 유출림프절세포, 비장세포의 제 2형 콜라겐에 대한 세포반응이 억제되 었다. TGF-β는 실험군에서 대조군에 비하여 높은 역가를 보였다. 결론적으로 DBA/1 mice에서 우형 제 2형 콜라겐을 경구로 반복투여하여 콜라겐유도성 관절염의 발생이 억제 됨으로서 경구관용유도를 확인 하였다. 경구관용이 유도된 쥐의 림프절과 비장세포 에서 우형 제 2형 콜라겐에 대한 림프구 증식반응은 콜라겐유도성 관절염에 비해 억제되었고 T G F -β생 성능은 증가되었다. 본 연구 결과는 콜라겐유도성 관 절염의 실험동물에서 제 2형 콜라겐에 의한 경구관용 유도를 일으키는데 T세포와 B세포의 기능억제와 T G F -β의 생성능증가가 관여함을 뒷받침하는 것으로 생각된다.
R E F E R E N C E S
11 ) Postlethwaite AE, Kang AH. Collagen and collagen peptide-induced chemotaxis of human blood monocytes. J Exp Med 1976;143:1299- 1 3 0 7
12 ) Krco CJ, Pawelski J, Harders J, McCormick D, Griffiths M, Luthra HS, David CS. Characteri- zation of the antigenic structure of human type II collagen. J Immunol 1996 ;156:2761-9 13 ) Trentham DE, Townes AS, Kang AH.
Autoimmunity to type II collagen: An exprei- mental model of arthritis. J Exp Med 1977;
1 4 6 : 8 5 7 - 6 8
14 ) Trentham DE, Townes AS, Kang AH, David
JR. Humoral and cellular sensitivity to colla- gen in type II collagen-induced arthritis in rats. J Clin Invest 1978;61:89-96
15 ) Stuart JM, Huffstutter EH, Townes AS, Kang AH. Incidence and specificity of antibodies to type I, II, III, IV, and V collagen in rheuma- toid arthritis and other rheumatic disease as measured by 125I-radioimmunoassay. Arthritis Rheum. 1983; 26:1157-63
16 ) Choi EKK, Gatenby PA, Mcgill NW, Bateman JF, Cole WG, York JR. Autoantibodies to type II collagen : occurrence in rheumatoid arthri- tis, other arthritides, autoimmune connective tissue disease and chronic inflammatory syn- dromes. Ann. Rheum. Dis 1988 ;47:313-6 17 ) Ronnelid J, Lysholm Y, Engstrom-Laurent A,
Klareskog L, Heyman B. Local anti-type II collagen antibody production in rheumatoid arthritis synovial fluid. Arthritis Rheum.
1 9 9 4 ; 3 7 : 1 0 2 3 - 9
18 ) Miller A, Lider O, Roberts AB, Sporn MB, Weiner HL. Suppressor T cells generated by oral tolerization to myelin basic protein suppress both in vitro and in vivo immune responses by the relesae of transforming growth factor β after antigen-specific triggering. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:421-5
19 ) Khoury SJ, Hancock WW, Weiner HL. Oral tolerance to myelin basic protein and natural recovery from experimental autoimmune encephalomyelitis are associated with downregu- lation of inflammatory cytokines and differen- tial upregulation of transforming growth factor β.interleukin 4, and prostaglandinnE expression in the brain. J Exp Med 1992;176:1355-64 1 0 ) Weiner HL, Mackin GA, Matusi M, Orav EJ,
Khoury SJ, Dawson DM, Hafler DA. Double blind pilot trial of oral tolerance with myelin antigen in multiple sclerosis. Science. 1993;259:
1 3 2 1 - 4
1 1 ) Zhang ZJ, Davidson L, Eisenbarth G, Weiner HL: suppression of diabetes in non-obese diabet- ic mice by oral administration of porcine insulin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991;88:
1 0 2 5 2 - 6
1 2 ) Nussenblatt RB, Capsi R, Mahdi R, Cahn CC, Roberge F, Lider O, Weiner HL. Inhibition of S-antigen induced experimental autoimmune uveoretinitis by oral inducton of tolerance with
S-antigen. J.Immunol. 1990;144:1689-94 1 3 ) Thompson HSG, Harper N, Bevan DJ, Staines
NA. Gastric administration of type II collagen delays the onset and severity of collagen- induced arthritis in rats. Clin Exp Immunol 1 9 8 6 ; 6 4 : 5 8 1 - 6
1 4 ) Weiner HL, Friedman A, Miller A, Khoury SJ, Al-Sabbagh A, Santos LL, Sayegh M, Nussenblatt RB, Trentham DE, Hafler DA.
Oral tolerance : Immunologic mechanisms and treatment of animal and human organ-specif- ic autoimmune diseases by oral administration of autoantigens. Annu Rev Immunol 1994;
1 2 : 8 0 9 - 3 7
1 5 ) Kuruvilla AP, Shah R, Hochwald M, Liggitt HD, Paliiadino MA, Thorebecke GJ. Protec- tive effect of transforming growth factor β1 on experimental autoimmune diseases in mice.
Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:2918-21 1 6 ) Brandes ME, Allen JB, Ogawa Y, Wahl SM.
Transforming growth factor 1 suppress acute and chronic arthritis in experimental animals.
J Clin Invest 1991;87:1108-13
1 7 ) Ito HO, So T, Ueda T, Imoto T, Koga T. Pre- vention of collagen-induced arthritis (CIA) by treatment with polyethylene glycol-conjugated type II collagen; distinct tolerogenic property of the conjugated collagen from the native one.
Clin Exp Immunol 1997;108:213-9
1 8 ) Salmon AR, Cohen DJ, Carpenter CB, T cell synergy in the primary MLP : proliferative kinetics, effector cell generation, and IL-2 pro- duction. Immunology 1984;133:3075-9
1 9 ) Wooley PH, Luthra HS, Stuart JM, David CS.
Type II collagen-induced arthritis in mice. I.
Major histocompatibility complex (I region) link- age and antibody correlates. J Exp Med 1981;
1 5 4 : 6 8 8 - 7 0 0
2 0 ) Brand DD, Meyers LK, Whittington KB, Stu- art JM, Kang AH, Rosloniec EF. Characteriza- tion of the T cell determinants in the induction of autoimmune arthritis by bovine α1 ( I I ) - C B 1 1 in H-2qmice. J Immunol 1994;152:3088-97 2 1 ) Trentham DE, Roselynn A,Dynesius-Trentham,
Orav EJ, Combitchi D, Lorenzo C, Sewell KL, Hafler DA, Weiner HL. Effects of oral adminis- tration of type II collagen on rheumatoid arthri- tis. Science 1993;261:1727-30
2 2 ) Barnett ML, Kremer JM, St. Clair EW, Clegg
DO, Furst E, Morales A, Le CH, Trentham DE. Treatment of rheumatoid arthritis with oral type II collagen. Arthritis Rheum 1998;
4 1 : 2 9 0 - 7
2 3 ) Sieper J, Kary S, Sorensen H, Alten R, Eggens U, Huge W, Hiepe F, Kuhne A, List- ing J, Ulbrich N. Braun J, Zink A, Mitchi- son NA. Oral type II collagen treatment in early rheumatoid arthritis; a double blind, placebo-controlled, randomized trial. Arthritis Rheum 1996;39:41-51
2 4 ) Greenbury CL, Skingle J. Anti-cartilage anti- body. J Clin Pathol 1979;32:826-31
2 5 ) Stuart JM, Cremer MA, Kang AH, Towne AS. Collagen-induced arthritis in rats: evalu- ation of early immunologic events. Arthritis Rheum. 1979;22:1344-50
2 6 ) Cook AD, Rowley MJ, Mackay IR, Gough A, Emery P. Antibodies to type II collagen in early rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum.
1 9 9 6 ; 3 9 : 1 7 2 0 - 7
2 7 ) Terato K, DeArmey DA, Ye XY, Griffiths MM, Cremer MA. The mechanism of autoanti- body formation to cartilage in rheumatoid arthritis: Possible cross-reaction of antibodies to dietary collagens with autologous type II col- lagen. Clin Immunol Immunopathol. 1997;
7 9 : 1 4 2 - 5 4
2 8 ) Gimsa U, Sieper J, Braun J, Mitchison NA.
Type II collagen serology : a guide to clinical responsiveness to oral tolerance. Rheumatol Int 1997;16:237-40
2 9 ) Ranges G, Sririam S, Cooper SM. Prevention of type II collagen induced arthritis by in vivo treatment with anti-L3T4. J Exp Med 1985;162:
1 1 0 5 - 8
3 0 ) Yoshino S, Cleland LG, Mayrhofer G. Treat- ment of collagen induced arthrits in rat with a monoclonal antibody against alpha/beta T cell antigen receptor. Arthritis Rheum 1991;34:
1 0 3 9 - 4 4
3 1 ) Goldsmidt TJ, Holmdahl R. Anti-Tcell receptor antibody treatment of rats with established autologous collagen induced arthritis: suppres- sion of activity without reduction of anti-type II collagen autoantibodies level. Eur J Immunol 1 9 9 1 ; 2 1 : 1 3 2 7 - 3 1
3 2 ) Kehrl JH, Wakefield LM, Roberts Ab, Jakowlew S, Alvarez-Mon M, Derynck R,
Sporn MB, Fauci AS. production of transform- ing growth factor βby human T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cell growth. J Exp Med 1986;163:1037-50
3 3 ) Lee G, Larry R, Ellingsworth LR, Gillis S,
Wall R, Kincade PW. βtransforming growth factors are potential regulators of B lympho- cytes. J immunol 1987;166:1290-9
3 4 ) Fontana A, Constam DB, Frei K, Malipiero U, Pfister HW. Modulation of immune
