임상약동학특론 #1

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임상약동학특론 #1

PUSAN NATIONAL UNIVERSITY

Biopharmaceutics & Pharmacokinetics Laboratory Prof. In-Soo Yoon

참고문헌: Molecules 2017, 22, 1489; doi:10.3390/molecules22091489

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Cudrania tricuspidata

• Cudrania tricuspidata Bureau (Moraceae): 수많은 약리학 적 효과를 나타내며 염증, 위염, 종양 및 간 질환에 대한 전통적인 약 초 요법에 사용되는 다년생 허브

• 잎, 과일 및 뿌리의 사용은 동의보감에도 보고되었으며, 한국을 포

함한 많은 국가에서 연중 내내 이용 가능하며 민간 요법으로 널리

사용

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Cudrania tricuspidata

• 뿌리, 잎: 항암 활성, 항산화 활성, 혈당 저하 활성 물질

• 뿌리 껍질: 항동맥경화, 항염증, 항산화, 신경보호, 간 보호, 세포 독성 활성

• 열매: 신경 보호, 항염증, 췌장 lipase 억제, 비만 세포 활성화, monoamine oxidase 억제, 항비만 효과

• 의약 및 기능성 식품 재료 개발 시도가 있었으며 아직 생물학적 특성 표준화 및 최적화를 위한 검증 된 분석 방법이 확립되지 않음

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Limit of Detection (LOD)

and Limit of Quantification (LOQ)

• Limit of Detection (LOD): 검출 할 수 있지만 정량화 할 필요는 정도

• Chlorogenic acid, Rutin, kaempferol LOD: 0.88, 0.32, 0.05 (μg/mL)

• Limit of Quantification (LOQ): 적합한 정밀도와 정확도로 정량화 할 수 있 는 시료의 최소 양

• Chlorogenic acid LOQ: 6.25 (μg/mL)

허용 가능한 정밀도와 정확도를 가진 선형 농도 범위 중 최저값

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Preparation of Standards and Sample Solutions

• Sample solutions

적정량의 기준 화합물 (chlorogenic acid, rutin, kaempferol) 을 100mL 부피 플라스크에 혼합하고 용해시켜 100 g/mL 저장 용액 수득 후, 용액을 3.125 g/mL로 연속 2배 희석

• Method validation

C. tricuspidata 잎과 열매의 에탄올 추출물에서 chlorogenic acid, rutin,

kaempferol 의 정량에 사용 된 분석 방법은 이전에 설명한대로 특이성, 선형성, 민감도, 정확성, 정밀성 및 회복 성 측면에서 검증

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Preparation of Standards and Sample Solutions

• Specificity

• 연구 분석 물질과 시료의 다른 성분을 구별하는 방법의 능력

• HPLC 방법의 특이성은 불순물, 분해제 또는 부형제와 같은 다른 잠재적 성분으로부터 분석 물질을 분리하여 입증

• Sensitivity

• LOD 는 chlorogenic acid, rutin, kaempferol standard curve 로 판단

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Preparation of Standards and Sample Solutions

• Accuracy and Precision

• 샘플의 3가지 (12.5, 25, 50 g/mL) 농도에 표준 물질을 샘플에 첨가, 회수 분석하여 정확성 및 정밀도 평가

• 각 용액을 1 일 또는 연속 3 일 이내에 3 회 주사

• Recovery

• 3 가지 상이한 농도 12.5, 25, 50 g/mL 로 회수율 평가

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Linearity

• Calibration curve range: 6.25 ~ 100 μg/mL

• Calibration curve: Linear regressions

Analyte Retention

Time (min) R2 Linear Range

(μg/mL) LOQ (μg/mL) LOD (μg/mL) Chlorogenic

acid 6.0 0.9999 6.25–100 6.25 0.88

Rutin 11.8 0.9999 6.25–100 6.25 0.32

Kaempferol 18.1 0.9999 6.25–100 6.25 0.05

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Precision and Accuracy

Analyte Conc. (μg/mL) Intraday (n = 3) Interday (n = 3)

RSD (%) Accuracy (%) RSD (%) Accuracy (%) Chlorogenic

acid 12.5 1.7 105.6 6.1 102.6

25 3.4 106.9 4.0 99.2

50 0.3 106.2 4.1 102.5

Rutin 12.5 0.5 106.6 2.8 108.3

25 1.3 103.6 2.3 105.3

50 0.2 107.1 1.0 107.0

Kaempferol 12.5 2.8 107.6 3.0 107.7

25 2.5 103.7 2.4 104.3

50 1.0 107.2 1.0 106.0

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Repeatability

Analyte Added (μg/mL) Recovery (%) RSD (%)

Chlorogenic acid 12.5 103.6 ± 1.7 1.7

25 101.0 ± 1.6 1.6

50 101.4 ± 1.4 1.4

Rutin 12.5 104.0 ± 1.6 1.6

25 99.2 ± 0.1 0.1

50 101.4 ± 0.6 0.6

Kaempferol 12.5 104.4 ± 1.2 1.2

25 99.2 ± 0.2 0.2

50 101 ± 0.2 0.2

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Contents of Marker Compounds from C. tricuspidata Extracts

• 식물 샘플을 6가지 상이한 용매 조성물: 물, 에탄올 20 %, 에탄올 40 %, 에탄올 60 %, 에탄올 80 %, 에탄올 100 % (v/v) 최상의 조 건 탐색

• 80 % 에탄올 추출물에서 두 화합물의 함량이 다른 에탄올 추출물

보다 많음 → 80 % 에탄올이 가장 효과적인 추출 용매로 선택

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Contents of Marker Compounds from C. tricuspidata Extracts

C. tricuspidata

잎과 열매를 수집하여 공기 중에서 건조 된 분말 형태 의 잎 및 과일 (10 g) 을 실온에서 3일 간 20~100 % 에탄올 (100 mL) 2 회 추출

• 에탄올 0 % 추출은 열수 추출 (100 ℃, 4 시간)

• 여과 후, 생성 된 에탄올 용액을 증발, 동결 건조, 약 50 ℃ 에서 저장

• 추출물을 에탄올에 재현탁시키고, 0.4 μm 막을 사용하여 여과

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Antioxidant Activity, Total Phenolic Contents,

and Total Flavonoids of C. tricuspidata Extracts

• C. tricuspidata 추출물의 항산화 능력 확인: 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) 와 환원력 분석

• 식물 제제의 항산화 특성: 폴리 페놀 및 플라보노이드와 같은 주요 활성 성분의 함량과 상관 관계

• 따라서, C. tricuspidata 로부터 수득 된 다양한 추출물의 총 페놀

함량 및 플라보노이드 결정

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DPPH Free Radical Assay

• 추출물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거법으로 평가

• DPPH 라디칼의 최대 흡수파장은 517 nm 이며, 항산화제 화합물에 의 한 환원으로 소거

• 1-20mg 의 추출물을 함유 한 에탄올 용액 (1mL) 을 0.4mM DPPH 에 탄올 용액 (1mL) 에 첨가, 혼합, 암실에서 10 분 동안 실온에서 반응

• 마이크로 플레이트 판독기로 517 nm 에서의 흡광도 측정

• 라디칼 소거 활성은 다음 방정식을 사용하여 백분율로 계산

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Reducing Power

• 샘플의 환원력은 변형 된 환원력 분석법으로 측정

• 샘플 (0.1mL) 을 1% potassium ferricyanide (0.5mL) 와 함께 0.2M

sodium phosphate buffer (0.5mL) 에 첨가하고, 50 ℃ 에서 20분 동안 반응

• 배양 후, 10% trichloroacetic acid solution (0.5mL) 을 반응 혼합물에 첨가 하고, 2000 g 에서 10분 동안 원심분리

• 상청액을 증류수 (0.5 mL) 및 0.1 % 염화철 (III) 용액 (0.1 mL) 과 혼합하고, 생성된 용액을 700 nm 에서 흡광도 측정

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Determination of Total Phenolic Content

• 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 분석으로 측정

• 5mg 의 동결 건조된 추출물 또는 표준물을 함유하는 수용액 (1mL) 을 2% sodium arbonate solution 1mL 및 10 % Folin–Ciocalteu phenol reagent 1mL 과 혼합

• 10분 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 750 nm 에서 흡광

도 측정

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Determination of Total Flavonoids

• 총 플라보노이드 함량은 비색법으로 측정

• 샘플 용액의 0.5 mL 분취액을 증류수 (2mL) 와 5 % NaNO2 용액 (0.15mL) 과 혼합

• 5분 간 배양 후, 10 % AlCl3 용액 0.15 mL 을 혼합물에 첨가하고, 5분 후,

4 % NaOH 용액 (2 mL) 첨가 후, 물을 첨가하여 최종 부피를 5 mL 로 만들고, 완전히 혼합하여 15분간 안정화

• 생성 된 혼합물의 흡광도를 415 nm에서 측정

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Determination of In Vitro Xanthine Oxidase (XO) Inhibitory Activity

• XO 시스템에서 요산 형성을 모니터링하여 XO 억제 활성 측정

• 분석 시스템: phosphate buffer (100 mM; pH 7.4) 0.6 mL, 샘플 0.1 mL, XO (0.2 U/mL) 0.1 mL, xanthine (1 mM; 0.1 M NaOH 에 용해 됨) 0.2 mL

• 억제제와 함께 또는 억제제 없이 효소를 첨가하여 반응을 개시하고, 290 nm 에서 15분 후 흡광도 변화를 시약 blank 에 대해 측정

• 1 M HCl 0.2 mL 을 사용하여 효소 반응을 중지

• ALP: 양성 대조군

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Xanthine Oxidase Inhibitory Activity of C. tricuspidata Extracts

C. tricuspidata 잎 에탄올 추출물의 크산틴 산화 효소 (XO) 억제 활성에 대한 에탄올 농 도의 효과

• 50 g / mL의 농도에서 알로퓨리놀 (ALP; 양 성 대조군) 이 XO 활성을 유의하게 억제 함

• 에탄올 추출물의 XO 억제 활성은 에탄올 농 도를 0에서 100 % (75.4 ± 0.9 %) 로 증가 시킴으로써 유의하게 증가

0 20 40 60 80 100 120

Xanthine oxidase (XO) inhibitory activites of ethanolic extract

ALP 0 20 40 60 80 100

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Antioxidant Activity, Total Phenolic Contents,

and Total Flavonoids of C. tricuspidata Extracts

• DPPH 분석: 자유 라디칼 소거 능력 평가

• 라디칼의 항산화 활성: 80 % 에탄올 추출물 (72.3 ± 0.7 %) >

60 % 에탄올 추출물 (66.8 ± 1.1 %) > 온수 추출물 (65.1 ±

0.9 %) > 40 % 에탄올 추출물 (60.1) ± 0.9 %) > 100 % 에탄올 추

출물 (52.4 ± 0.9 %) > 20 % 에탄올 추출물 (48.7 ± 0.9 %) 의 순

서로 감소

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Antioxidant Activity, Total Phenolic Contents,

and Total Flavonoids of C. tricuspidata Extracts

• 추출물의 존재 하에서 Fe 3+ 를 Fe 2+ 로 환원시켜 환원 능력 측정

• 80 % 에탄올 추출물이 6 가지 추출물 중 가장 높은 활성

• 비타민 C 당량으로 표현 된 환원 활성: 80 % 에탄올 추출물 (28.3 ± 0.5 μg / mL) > 60 % 에탄올 추출물 (27.5 ± 0.3 μg / mL) > 40 % 에탄올 추출물 (26.7 ± 0.3 μg / mL) > 온수 추출물 (26.3 ± 0.6 μg / mL) >

100 % 에탄올 추출물 (25.8 ± 0.3 μg / mL) > 20 % 에탄올 추출물 (24.9 ± 0.6 μg / mL) 순서로 감소

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Concusion

• C. tricuspidata 잎의 추출물은 에탄올을 이용해 성공적으로 제조 되었고, 화학적 프로파일 및 생물학적 활성에 대해 평가

• 80 % 에탄올 추출물이 항산화 활성과 페놀 함량이 가장 높은 반면,

100 % 에탄올 추출물은 총 플라보노이드 수가 가장 많고 XO 억제

율이 가장 높았음

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Concusion

• HPLC 분석법을 개발하고 적용하여 chlorogenic acid, rutin, kaempferol 성 분이 C. tricuspidata 잎 추출물에 존재함을 확인

C. tricuspidata 추출물의 항산화 및 항고혈압, 통풍 효과가 적어도 부분적으 로 해당 화합물들에 의한 것으로 보임

C. tricuspidata 추출물과 3 가지 성분의 생체 내 약리학적 활성 확인, 안전성 을 평가하여 효과적인 항산화제 및 항고혈압 / 통풍제로서의 잠재적 개발을 위한 추가 연구가 필요

수치

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참조

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