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책임저자：유재형, 서울시 동작구 흑석동 221
156-756, 중앙대학교 의과대학 병리학교실 Tel: 02-820-5657, Fax: 02-813-5387
E-mail: [email protected]
접수일：2007년 11월 8일, 게재승인일：2008년 3월 6일 이 논문은 2007년도 중앙대학교 학술연구비 지원에 의한 것임.
중심 단어: C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53, 혈관내피성장인자, 간담 도계, 췌장, 샘암종
간담도계와 췌장 샘암종의 C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF 발현에 대한 면역조직화학적 연구
중앙대학교 의과대학 외과학교실, 1병리학교실
김용석ㆍ최재영1ㆍ차성재ㆍ유재형1
Immunohistochemical Study of the C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 and VEGF Expressions in Hepatobiliary and Pancreatic Adenocarcinoma
Yong Seok Kim, M.D., Jae Young Choi, M.D.1, Seong Jae Cha, M.D. and Jae Hyung Yoo, M.D.1
Departments of Surgery and 1Pathology, College of Medicine, Chung-Ang University, Seoul, Korea
Purpose: Researching the inhibitors of the gene products that participate in the multistep carcinogenetic events of hu- man cancer is important for chemoprevention or adjuvant cancer therapy. This study was performed to search for basic data for the chemoprevention or adjuvant therapy of human hepatobiliary and pancreatic adenocarcinoma, and we want- ed to evaluate the coexpression of each gene product and the relationship between the expression of each gene prod- uct and the clinocopathologic factors and the prognosis.
Methods: The following formalin-fixed paraffin embedded surgical specimens were immunohistochemically stained by the avidin-biotin complex method for C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 and VEGF. There were 15 cases of intrahepatic cholangiocarcinoma, 12 cases of metastatic adenocarcinoma in the liver, 15 cases of gallbladder adenocarcinoma, 25 cas- es of extrahepatic bile duct adnocarcinoma involving the am- pullary region and 20 cases of pancreatic ductal adenocar- cinoma.
Results: Varying frequencies of the overexpressions of the five gene products in the hepatobiliary and pancreatic adenocarcinomas were noted. Although the coexpression of the five gene products was observed to various degrees, the VEGF expression was statistically correlated with the ex-
pressions of COX-2 (in the intrahepatic cholangiocarcinoma) MMP-9 (in the glalbladder adenocarcinoma) and p53 (in the extrahepatic bile duct and pancreatic duct adenocarcinoma) (P＜0.05). There was also statistical correlation between the C-erbB-2 and COX-2 expressions and the clinical stage of adenocarcinoma of the extrahepatic bile ducts (P＜0.05).
Conclusion: These results suggest that the overexpression of the five gene products was one of the important multistep carcinogenetic events, and the VEGF expression might play an important role in the coexpression of other gene products of hepatobiliary and pancreatic adenocarcinoma. (J Korean Surg Soc 2008;74:352-360)
Key Words: C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53, VEGF, Hepato- biliary, Pancreas, Adenocarcinoma
서 론
최근 분자병리학적 기법의 발달로 정상적인 상태에서는 세포의 분화 및 증식과정에 관여하는 유전자 산물들이 발 암인자의 영향에 의해 단백의 이상발현을 초래하여 암의 발생, 암의 표현형 유지 및 진행에 관여하게 된다는 사실이 알려지고 있다.
인체암의 발생에 대한 분자생물학적 기전은 아직도 완전 히 밝혀지지 않았으나 다양한 발암원인에 의한 종양억제 유전자의 불활성화, 암유전자의 과발현, 세포주기 조절유전 자 및 세포자멸사 조절유전자에 변화를 초래하여 정상세포 의 변형과 성장을 유발하는 다단계 암발생과정(multistep carcinogenesis)을 거치는 것으로 알려지고 있다.
암의 발생과 진행과정에 관여하는 다양한 암관련 유전자 단백의 발현에 대한 연구는 암의 발생기전 및 임상적 예후 를 추정하는 데 널리 이용되고 있다. 이러한 과정에 관여하 는 다양한 유전자 산물을 억제할 수 있는 약물이나 천연물 질을 규명하는 것이 암발생의 예방 및 억제 그리고 진행과 정을 차단할 수 있는 화학예방효과에 대한 연구를 활성화 시키는 계기가 되었다.(1) 이에 대표적인 연구대상이 되고 있는 것이 COX-2, C-erbB-2, 혈관내피성장인자(vascular en-
Fig. 1. Immunohistochemical staining for C-erbB-2 in adenocar- cinoma of common bile duct shows positive reaction with membranous pattern (ABC, ×400).
dothelial growth factor, VEGF)이며, 이러한 유전자산물의 상 호관련성 및 억제물질에 대한 연구들이 발표되었다.(2-4) 이뿐만 아니라, 이러한 물질들과 실제 인체암의 50% 이상 에서 비활성화 현상을 초래하는 p53과의 연관성(5)과 암세 포로부터 분비되는 당단백질 분해효소의 하나인 기질 금속 단백분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 암의 진행 및 전이에 관련한 부분에 대한 연구가 이루어지고 있다.(6,7) 신생혈관형성은 종양의 성장에 필수적인 현상이며 이와 같은 혈관형성은 종양세포나 종양 내에 침투한 염증세포에 서 분비되는 여러 가지 단백질과 효소의 복합적인 경로에 의해 조절될 것이라는 가능성이 제시되었다.(8) 즉, 아라키 돈산으로부터 프로스타글란딘 합성에 관여하는 촉매제인 COX-2와 혈관성장인자들과의 상호작용, MMP-9 및 C- erbB-2와 혈관성장인자와의 연관성이 암의 침윤성 성장과 전이에 중요한 역할을 할 수 있다는 연구결과가 발표되었 다.(9,10) 이러한 연구가 유방암, 대장암 및 폐암에 대해서는 활발히 연구가 되고 있으나, 간담도계와 췌장의 샘암종에 대한 연구는 아직 미미한 실정이다.
이에 본 연구자는 간의 전이성 샘암종을 포함한 간담도 계 및 췌장에 발생한 원발성 샘암종인 간내 담관샘암종, 담 낭의 샘암종, 간외 담관을 포함한 Vater 팽대부에 이르는 담 관의 샘암종, 췌장의 관샘암종의 진행과정에 있어서의 C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF의 발현빈도 및 이 러한 유전자 산물의 동시발현성과 상호관련성, 암의 발생 부위에 따른 발현양상의 차이점 그리고 임상병기 및 종양 병기에 따른 유전자 단백의 발현양상에 대한 면역조직화학 적 연구를 시행하였다.
방 법
1) 재료
중앙대학교 의과대학 부속병원에서 생검이나 근치수술 을 시행하여 병리조직학적으로 확진된 간담도계와 췌장의 샘암종 조직 중 보관상태가 양호한 87예의 파라핀 포매조 직을 이용하였다. 발생부위별로 분류하면, 간샘암종 12예이 며, 담낭에 발생한 샘암종 15예, 간외담관에서 Vater 팽대부 에 이르는 담관에서 발생한 샘암종 25예 그리고 췌장 관샘 암종이 20예였다. 이 중 근치수술을 시행한 68예에 대해서 는 임상기록과 병리보고서를 재검색하여 AJCC법(2001)에 의해 임상병기 및 종양병기를 구분하여 유전자산물의 발현 양상을 비교하였다.
2) 면역조직화학 염색
간담도계와 췌장에 발생한 샘암종의 파라핀 포매조직을 4∼5μm 두께로 박절하고 자일렌으로 탈파라핀 과정을 거 친 후 무수알코올, 90%, 75% 50% 에탄올에 각각 2분씩 처 리하여 함수시켰다. 내인성 과산화수소의 활성을 억제하기
위해 0.3% hydrogen peroxide-methanol에 10분간 처리하고 증류수로 세척한 후 50 mMol Tris 완충용액(TBS, pH 7.5)으 로 수세하였다. 그리고 비특이적 반응을 제거하기 위해 30 분간 항염소혈청으로 처리하고 슬라이드에 남아있는 여분 의 용액을 제거한 후 일차항체인 COX-2 (1：50, Zymed, USA), C-erbB-2 (1：50, Neomarker, USA), MMP-9 (1：50, Neomarker, USA), p53 (1：50, Zymed, USA) 및 VEGF (1：
50, Santa Cruz, USA)를 실온에서 2시간 동안 작용시켰다.
일차항체의 반응 후 TBS로 5분간 3회 수세한 후 biotin이 부착된 항체(labelled streptavidin biotin kit, Zymed, USA)에 20분간 작용시킨 후 통상적인 avidin-biotin complex (ABC) 법으로 염색을 시행하였다. 발색제로는 3-amino-9-ethylcar- bazole (AEC)을 사용하고 Mayer's hematoxylin으로 대조염 색을 하여 광학현미경으로 관찰하였다.
3) 연구결과의 판정
다섯 가지 종류의 유전자 산물에 대한 면역조직화학적 염색을 시행한 후 발현정도의 판정은 p53은 종양세포의 핵 내, 그리고 COX-2, C-erbB-2, MMP-9과 VEGF는 종양세포의 세포막 또는 세포질 내 과립성으로 염색된 세포의 수가 10% 이상이면 양성으로 간주하였다. 발현정도와 임상병기 와의 연관성을 보기 위한 통계분석은 통계프로그램 Epi in- fo version 3,3,2를 이용하여 χ2 검정을 시행하여 P 값이 0.05 이하인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
결 과
1) 간담도계와 췌장 샘암종의 C-erbB-2, COX-2, MMP- 9, p53과 VEGF의 발현양상
간담도계와 췌장 샘암종의 여러 가지 표지자들의 발현양
Fig. 2. Immunohistochemical staining for COX-9 in adenocarcino- ma of shows strong positive reaction in the cytoplasm (ABC, ×400).
Fig. 4. Immunohistochemical staining for p53 in cholangiocarcino- ma shows nuclear positive reaction (ABC, ×400).
Fig. 3. Immunohistochemical staining for MMP-9 in adenocarcino- ma of gallbladder shows diffuse, positive reaction in the cytoplasm (ABC, ×400).
Fig. 5. Immunohistochemical staining for VEGF in pancreatic duc- tal adenocarcinoma shows positive reaction in the cyto- plasm (ABC, ×400).
상에 대한 면역조직화학 염색을 시행한 결과 다음과 같은 성적을 얻었다. C-erbB-2, COX-2, MMP-9과 VEGF는 세포표 면이나 세포질 내 갈색의 과립성물질이 관찰되었으며, p53 은 핵내에서 양성반응이 관찰되었다(Fig. 1∼5). C-erbB- 2 는 모든 부위에 생긴 샘암종에서 발현되었으나, 간외담관 을 포함한 Vater 팽대부에 이르는 담관에 발생한 샘암종에 서 가장 잘 발현되었다. COX-2의 발현은 간에 발생한 전이 성 샘암종에서 가장 높게 발현되었으며, MMP-9의 발현은 발생부위에 따른 유의한 차이점 없이 나타났으며 p53은 간 에 발생한 샘암종보다 담낭, 간외 담관 및 췌장에 발생한 샘암종에서 더 높게 발현되었다. VEGF의 발현은 췌장을 제 외하고는 다른 유전자 단백보다 더 높게 양성반응을 나타 냈다. 그러나 발생부위에 따른 유전자 단백의 발현빈도 차 이에서는 통계학적 유의성은 없었다(P＞0.05)(Table 1).
2) 간의 담관샘암종과 전이성 샘암종의 C-erbB-2, COX- 2, MMP-9, p53 및 VEGF의 동시발현도
담관세포암종 15예 중 모든 유전자 단백이 발현된 예가 13.1% (2/15), 4가지가 발현된 예가 6.7% (1/15), 3가지가 발 현된 예가 33.3% (5/15), 2가지가 발현된 예가 26.7% (4/15), 한 가지만 발현된 예가 6.7% (1/15) 그리고 13.1% (2/15)에서 는 어느 것에도 발현되지 않았다. 동시 발현된 예 중에서 VEGF와 COX-2의 발현은 통계학적으로 서로 유의성을 나 타내었으나(P＜0.05), VEGF와 C-erbB-2, MMP-9, p53 간에 는 통계학적 유의성이 없었다(P＞0.05). 전이성 샘암종 12예 중에서 4가지의 유전자 단백이 발현된 예가 25% (3/12), 2가 지가 발현된 예가 58.3% (7/15), 그리고 COX-2와 p53이 각 각 8.3% (1/12)에서 발현되었다(Table 2).
Table 1. Immunohistochemical expression of C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 and VEGF in the hepatobiliary and pancreatic ductal ad- enocarcinoma
Organ Number of
cases
C-erb-2 COX-2 MMP-9 p53 VEGF
(−) (＋) (−) (＋) (−) (＋) (−) (＋) (−) (＋)
Liver Intrahepatic Metastatic Gallbladder
Extrahepatic bile duct Pancreas
15 12 15 25 20
13 11 12 17 19
2 1 3 8 1
7 2 5 9 10
8 10 10 16 10
5 6 6 11 9
10 6 9 14 11
9 8 6 10 8
6 4 9 15 12
6 6 4 6 10
9 6 11 19 10
P-value NS NS NS NS NS
Total 87 72 15 33 54 37 50 41 46 32 55
NS = statistically not significant (P＞0.05).
Table 2. Synchronous expression of C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 and VEGF of adenocarcinoma in liver
Pattern of expression Number of cases
Frequency (%) Cholangiocarcinoma (15)
C-erbB-2＋COX-2＋MMP-9＋
p53＋VEGF
COX-2＋MMP-9＋p53＋VEGF COX-2＋MMP-9＋VEGF MMP-9＋p53＋VEGF COX-2＋VEGF MMP-9＋VEGF MMP-9＋p53 COX-2 only All negative
Metastatic adenocarcinoma (12) COX-2＋MMP-9＋p53＋VEGF COX-2＋MMP-9
COX-2＋VEGF C-erbB-2＋COX-2 COX-2 only p53 only
2 1 3 2 2 1 1 1 2 3 3 3 1 1 1
13.1 6.7 20 13.1 13.1 6.7 6.7 6.7 13.1 25 25 25 8.3 8.3 8.3
Total 27 100 (99.9)
Table 3. Synchronous expression of C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 and VEGF in adenocarcinoma of gallbladder
Pattern of expression Number of cases
Frequency (%) C-erbB-2＋COX-2＋MMP-9＋p53＋VEGF
C-erbB-2＋COX-2＋MMP-9＋VEGF COX-2＋MMP-9＋p53＋VEGF COX-2＋MMP-9＋VEGF COX-2＋p53＋VEGF MMP-9＋p53＋VEGF COX-2＋p53 MMP-9＋VEGF p53＋VEGF p53 only
2 1 1 2 1 1 3 2 1 1
13.3 6.7 6.7 13.3 6.7 6.7 20 13.3 6.7 6.7
Total 15 100
3) 담낭샘암종의 C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF의 동시발현도
담낭 샘암종 15예 중 모든 증례에서 1가지 이상의 유전자 단백의 발현이 관찰되었다(Table 3). 모든 유전자 단백이 발 현된 예는 13.3% (2/15), 4가지 유전자 단백이 발현된 예는 13.3% (2/15), 3가지 유전자 단백이 발현된 예는 33.3% (5/
15), 2가지 유전자 단백이 발현된 예는 40% (6/15)였으며,
VEGF와 MMP-9의 발현은 통계학적으로 서로 유의성을 나 타내었으나(P＜0.05), VEGF와 C-erbB-2, COX-2, p53 간에는 통계학적 유의성은 없었다(P＞0.05).
4) 간외담관에서 발생한 샘암종의 C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF의 동시발현도
간외 담관에서 발생한 샘암종은 1예를 제외하고는 1가지 이상의 유전자 단백의 발현이 관찰되었다. 총 25예 중 16%
(4/25)에서 5가지의 유전자 단백의 발현이, 28% (7/25)에서 4가지 유전자 단백의 발현이, 16%에서 3가지 유전자 단백 의 발현이, 24% (6/25)에서는 2가지의 유전자 단백의 발현 이, 그리고 8% (2/25)에서는 p53만, 그리고 4% (1/25)에서는 VEGF만 발현되었다(Table 4). 유전자 단백이 동시 발현된 예 중 VEGF와 p53의 발현은 통계학적으로 서로 유의성이 있었으나, VEGF와 C-erbB-2, COX-2, MMP-9 간에는 통계학
Table 4. Synchronous expression of C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 and VEGF in adenocarcinoma of extrahepatic bile duct
Pattern of expression Number of cases
Frequency (%) C-erbB-2＋COX-2＋MMP-9＋p53＋VEGF
C-erbB-2＋COX-2＋MMP-9＋VEGF COX-2＋MMP-9＋p53＋VEGF COX-2＋p53＋VEGF
C-erbB-2＋MMP-9＋VEGF MMP-9＋p53＋VEGF p53＋VEGF
COX-2＋MMP-9 COX-2 only p53 only VEGF only All negative
4 3 4 2 1 1 3 2 1 2 1 1
16 12 16 8 4 4 12 8 4 8 4 4
Total 25 100
Table 5. Synchronous expression of C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 and VEGF in pancreatic ductal adenocarcinoma
Pattern of expression Number of cases
Frequency (%) C-erbB-2＋COX-2＋MMP-9＋p53＋VEGF
COX-2＋MMP-9＋p53＋VEGF MMP-9＋p53＋VEGF
COX-2＋MMP-9 COX-2＋VEGF MMP-9＋p53 p53 only VEGF only
1 3 2 3 3 2 4 2
5 15 10 15 15 10 20 10
Total 20 100
Table 6. Immunohistochemical expression of C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 and VEGF by clinical stage in hepatobiliary and pancretic adenocarcinoma
C-erbB-2 COX-2 MMP-9 p53 VEGF
Organ Clinical stage
(−) (＋) (−) (＋) (−) (＋) (−) (＋) (−) (＋)
Liver
Intrahepatic (6) IV (6) 5 1 2 4 2 4 3 3 2 4
Metastatic (12) IV (12) 11 1 2 10 6 6 8 4 6 6
P-value NS NS NS NS NS
Extrhepatic bile II (7) 7 0 5 2 4 3 2 5 2 5
duct IV (13) 6 7 3 10 4 9 5 8 1 12
P-value P＜0.05 P＜0.05 NS NS NS
Gallbladder I (12) 10 2 4 8 4 8 4 8 3 9
II (2) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
III (1) 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1
P-value NS NS NS NS NS
Pancreas I (4) 4 0 1 3 1 3 2 2 3 1
II (6) 5 1 4 2 4 2 2 4 4 2
III (3) 3 0 1 2 1 2 1 2 1 2
IV (2) 2 0 2 0 0 2 0 2 1 1
P-value NS NS NS NS NS
Total 68 55 13 25 43 27 41 28 40 24 44
적 유의성은 없었다(P＞0.05).
5) 췌장 관샘암종의 C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF의 동시발현도
췌장에 발생한 관샘암종 모두에서 1가지 이상의 유전자
단백의 발현이 관찰되었다. 5가지의 유전자단백이 발현된 예는 5% (1/20), 4가지의 유전자 단백이 발현된 예는 15%
(3/20), 3가지의 유전자 단백이 발현된 예는 10% (2/20), 2가 지의 유전자 단백이 발현된 예는 40% (8/20), 그리고 20%
(4/20)에서는 p53만, 그리고 10% (2/10)에서는 VEGF만 발현 되었다(Table 5). 유전자 단백이 동시 발현된 증례 중에서 VEGF와 p53은 통계학적으로 서로 유의성이 있었으나(P
＜0.05), VEGF와 C-erbB-2, COX-2, MMP-9 간에는 통계학 적 유의성은 없었다(P＞0.05).
Table 7. Immunohistochemical expression of C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 and VEGF of T-stage in hepatobiliary and pancreatic ad- enocarcinoma
C-erbB-2 COX-2 MMP-9 p53 VEGF
Organ Tumor stage
(−) (＋) (−) (＋) (−) (＋) (−) (＋) (−) (＋)
Liver
Intrahepatic T3 (1) 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1
T4 (5) 4 1 2 3 1 4 2 3 2 3
Extrahepatic bile T2 (2) 2 0 2 0 1 1 0 2 0 2
duct T3 (5) 5 0 3 2 2 3 2 3 2 3
T4 (13) 6 7 3 10 4 9 5 8 1 12
Gallbladder T1 (2) 2 0 2 0 1 1 1 1 1 1
T2 (10) 9 1 2 8 3 7 3 7 2 8
T3 (3) 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
Pancreas T2 (4) 4 0 1 3 1 3 2 2 3 1
T3 (9) 8 1 5 4 5 4 3 6 5 4
T4 (2) 2 0 2 0 0 2 0 2 1 1
Total 56 44 12 23 33 20 36 20 36 18 38
( ) = number of cases.
6) 간담도계와 췌장 샘암종의 임상병기에 따른 C- erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF 발현도 간담도계와 췌장 관샘암종의 임상병기에 따른 COX-2, C- erbB-2, MMP-9, p53 및 VEGF의 발현도는 암의 침범부위 및 임상병기에 따라 다양한 성적을 나타내었다. 간내 담관 샘암종에서는 COX-2, MMP-9과 VEGF의 발현이 높게 관찰 되었으며, 전이성 샘암종에서는 특히 COX-2의 발현이 가장 높게 관찰되었다. 간외 담관의 샘암종에서는 임상병기가 높을수록 모든 유전자 단백의 발현이 높게 관찰되었으며, 담관과 췌장의 샘암종에서는 발현도가 다양하게 관찰되었 다. 간외 담관 샘암종에서는 C-erbB-2의 발현이 현저하게 높게 나타났으며, 췌장 샘암종에서는 다른 유전자 단백과 비교했을 때 p53의 발현이 높게 나타나는 경향을 보였다.
그러나 임상병기에 따른 유전자단백의 발현도의 통계학적 유의성을 검정한 결과, 간외담관에서 기원한 샘암종에서 C-erbB-2와 COX-2의 발현은 임상병기가 높을수록 발현도 가 유의성 있게 증가하였으나(P＜0.05), 다른 부위에 생긴 암에서는 통계학적 유의성은 없었다(Table 6).
7) 간담도계와 취장 샘암종의 종양병기에 따른 C- erbB-2, COX-2, MMP-9, p53 및 VEGF 발현도 간담도계와 췌장의 원발성 샘암종에 대한 종양병기에 따 른 COX-2, C-erbB-2, MMP-9, p53 및 VEGF의 발현도는 대 부분 종양병기가 높을수록 유전자 단백의 발현도가 높아지 는 경향을 나타내었다. COX-2의 발현도는 췌장을 제외하고 는 침범부위에 상관없이 종양병기가 높아질수록 현저히 관
찰되는 경향을 보였다. C-erbB-2는 모든 부위에서 발현되었 으나 간외 담관의 샘암종에서 가장 높게 나타났으며, MMP-9 은 침범부위에 상관없이 발현되었다. p53은 특히 췌장 샘암 종에서 현저하게 발현되었으며, VEGF는 다른 유전자 단백 보다 발현도가 높게 관찰되었다(Table 7).
고 찰
간담도계와 췌장의 샘암종은 실제적으로 조기진단이 어 려울 뿐만 아니라 진행암의 경우에도 효과적인 치료방법이 확립되지 않아 예후가 불량한 대표적인 암 중의 하나이다.
정상세포가 다양한 환경적 요인들에 의해 비정상적인 자극 을 받아 암세포로 형질변화가 일어나기까지는 지금까지 알 려진 100여 종의 종양 관련 유전자들의 상호작용이 암의 발 생과 진행의 각 단계에 영향을 미치는 것으로 알려지고 있 다.(11)
최근의 실험적 연구에 의해 cytokines, mitogens 및 성장인 자 등에 의해 유도되는 cyclooxygense-2가 다양한 암의 발생 과 진행에 관여한다는 것이 알려졌다.(12-16) 최근 Hayashi 등(18)은 인체의 담관샘암종에서 COX-2의 과발현이 현저 하게 나타나며, COX-2 억제제를 투여했을 때 담관암의 성 장이 억제되는 점을 미루어보아 담관암종뿐만 아니라 다른 간담도계의 암종에서도 COX-2 억제제의 치료효과에 대한 가능성을 시사하였다. 본 연구에 있어서 간담도계와 췌장 의 샘암종에서 COX-2의 과발현은 침범부위에 따라 정도의 차이는 있었지만 50∼80%까지 증가되었으며, 특히 간에 전 이한 암종에서 가장 높게 관찰되었다. 또한 임상병기에 따
른 유전자 단백의 발현을 관찰한 결과 간외담관에서 발생 한 샘암종에서는 임상병기가 높을수록 COX-2의 발현이 통 계학적으로 유의하게 증가한다는 것을 알 수 있었다. 이러 한 성적은 암에서 COX-2 과발현이 암의 침윤성 성장과 전 이에 관여한다는 다른 연구자들의 성적과 유사하였다.(19) C-erbB-2 종양유전자는 염색체 17q21에 존재하는 종양유 전자로 tyrosine kinase의 활성을 가지고 있으며, 표피성장인 자 수용체와 구조적으로 상동성을 나타내며,(20) 유방암, 폐 암, 위암 등에서 과발현되는 것으로 알려져있다.(21-23) C- erbB-2 종양유전자는 HER-2/neu라고 불리기도 하며 시험관 연구에서는 소량으로도 상피세포의 성장과 증식효과를 나 타내는 것으로 알려져 있다. 이 유전자의 산물인 단백발현 은 유전자의 증폭을 반영하는 것으로 증명되어 암의 불량 한 예후를 판정하는 지표의 하나로 사용되고 있으며, 특히 호르몬 치료에 대한 저항성을 나타낸다.(21,24) 간담도계 샘 암종에서도 C-erbB-2 과발현의 의미는 다른 암에서와 유사 하게 암의 진행과 전이에 관여한다는 보고가 있으며,(25) 췌장암의 경우에는 암의 초기단계에 관여하여 종양세포의 표현형을 변화시키는 역할을 한다는 주장도 있다.(26) 본 연구에서 간담도계 및 췌장 샘암종에서 C-erbB-2 과발현은 17.2% (15/87)에서 관찰되었으며, 그 중에서도 간외담관에 서 Vater 팽대부에 이르는 담관에서 기원한 샘암종에서 32%
(8/25)로 가장 높게 발현되었으며 임상병기에 따른 유전자 단백의 발현양상을 관찰한 결과 임상병기가 높을수록 C- erbB-2 발현도가 통계학적으로 유의하게 증가한다는 것을 알 수 있었다. 간담도계의 C-erbB-2의 발현은 10% 이하에서 73%까지 다양하게 발표되고 있다. 이러한 차이는 인종의 차이, 발생지역의 차이, 연구재료수집의 취약성, 연구방법 및 연구성적의 판독방법 등에 따라 다르게 나타날 수 있다 고 한다.(27-29) 또한 이러한 성적의 다양성은 C-erbB-2가 표피 성장인자 수용체와 상동성을 가지므로 발현 유무를 판정할 때 교차반응의 가능성을 배제할 수 없는 세포질 내 양성반응을 제외하고 세포막에 선상으로 양성반응을 나타 내는 것만 발현한 것으로 판정하는 것이 타당하다고 생각 된다. 이러한 기준으로 성적을 판독하면 연구자들의 성적 이 일관성을 가질 것으로 생각된다. 본 연구에서도 C-erbB-2의 발현빈도가 높지 않은 것은 세포막에 양성반응 을 나타낸 것만을 발현한 것으로 판정하였기 때문이다. 또 한 본 연구에서 연구증례 중 근치수술을 시행하여 임상병 기를 알 수 있었던 예에 있어서는 간외담관 샘암종에서 병 기가 높을수록 C-erbB-2의 발현이 통계학적으로 유의하게 증가된다는 것을 알 수 있었다. 그러나 간담도계 및 췌장의 샘암종이 대부분 진행된 후에 발견되므로, 근치수술을 하 는 증례가 흔하지 않다는 어려움이 있으나, 좀 더 많은 증례 를 수집하여 계속적으로 연구하여 이 유전자 단백의 예후 인자로서의 유용성 및 억제제에 의한 암 치료와 예방을 위 한 기초자료를 얻고자 한다.
암의 침윤성 성장과 전이를 위해서는 종양세포를 둘러싸 고 있는 기저막과 세포외기질을 분해시킬 수 있는 물질이 필요한데, 이러한 역할을 하는 대표적인 효소가 MMP이다.
인체에 존재하는 MMP은 적어도 20여 종의 아형이 있는데 각각 작용하는 기전이 다른 것으로 알려져 있다.(30) 이 중 에서 matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)은 기저막의 주성분 인 collagen IV를 분해시키는 92 kda의 효소로 유방암, 결장 암, 위암 등에서 과발현될 수 있다는 보고들이 있으 며,(31-33) MMP- 9의 과발현은 암세포의 전이와 밀접한 연 관성이 있음이 알려지고 있다.(6,7) 본 연구에서 간담도계와 췌장의 샘암종에서 MMP-9의 과발현은 50∼66.7%까지 다 양하게 양성반응을 나타내었으며, 종양병기가 높아질수록 발현빈도가 증가하는 경향이 있다는 것을 알 수 있었다.
p53 유전자는 세포의 성장과 형질변화를 억제하는 중요 한 역할을 하며, 세포자연사를 억제하는 작용을 한다. 이러 한 p53이 변이 등에 의해 비활성화되면 세포주기 및 DNA 복제의 조절기능이 상실되고 정상세포의 형질변화를 초래 하는데 중요한 역할을 하며, 실제적으로 인체암의 50% 이 상에서 p53의 비활성화가 보고되고 있다.(34) 본 연구에서 간담도계와 췌장 샘암종에서 p53의 과발현은 33.3∼66.7%
까지 다양하게 양성반응을 나타내었으나 종양병기가 높을 수록 발현도가 증가하는 경향을 보였다.
VEGF는 분자량이 32∼42 kd인 당단백질로 조직허혈에 의해 유도되는 성장인자로 혈관내피세포에 특이성을 나타 내어 내피세포의 증식과 화학주성을 초래하며, 부수적으로 단백분해효소와 MMP 등이 분비되어 기저막의 파괴와 간 질의 융해가 일어나고 궁극적으로 모세혈관의 발아와 더불 어 관상구조로 팽창되어 신생혈관을 형성하는 데 주된 역 활을 한다.(3) 본 연구의 간담도계와 췌장 샘암종에서 VEGF의 과발현은 50∼76%까지 양성반응을 나타내었다.
간담도계와 췌장의 샘암종은 다른 암과 마찬가지로 분자 생물학적 기전이 아직 밝혀지지 않았지만 암의 발생, 진행 및 전이과정에 관한 암관련유전자들의 상호작용에 의한 다 단계 암발생과정에 대한 연구가 진행되고 있다.
본 연구에서는 간담도계와 췌장 샘암종에서 COX-2, C- erbB-2, MMP-9, p53 및 VEGF의 동시발현도를 관찰한 결과, 암발생의 부위와 상관없이 2가지 이상의 유전자 단백이 동 시발현된다는 것을 알 수 있었다. 이 중 C-erbB-2가 발현되 는 증례에서는 COX-2의 동시발현이 관찰되었는데 이러한 성적은 Endo 등(35)의 연구결과와 같이 두 유전자의 동시발 현이 담관 샘암종 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 생각 된다. 암의 침윤성 성장에 있어서 필수적인 것이 신생혈관 생성능인데, COX-2, C-erbB-2, MMP-9, p53 유전자 단백과 대표적인 혈관성장인자인 VEGF와의 상호작용이 암조직에 영양과 산소 공급을 위한 신생혈관 형성에 중요한 역할을 한다.(10,36-38)
본 연구에서 간담도계와 췌장의 샘암종의 진행과정 단계
에 유전자 단백발현의 상호관련성에 대한 연구를 위해 암 세포의 신생혈관생성능을 평가하는 데 중요한 지표 중의 하나인 VEGF 발현과 C-erbB-2, COX-2, MMP-9, p53과의 연 관성을 조사한 결과 간내 담관 샘암종에서는 VEGF와 COX-2, 담낭 샘암종에서는 VEGF와 MMP-9, 간외담관과 췌 장의 관샘암종에서는 VEGF와 p53이 통계학적으로 서로 유 의성 있게 동시 발현된다는 것을 알 수 있었다. 본 연구자는 향후 간 담도계과 췌장암의 진행과정에 대한 연구로서 조 기발견의 어려움과 근치수술에 의한 연구재료의 수집에 대 한 취약점이 있으나, 보다 많은 연구재료를 확보하여 유전 자단백의 상호관련성에 대해 지속적인 연구를 통하여 분자 생물학적 방법에 의한 암의 치료 및 예방을 위한 체계적인 기초 자료를 확립하고자 한다.
결 론
간담도계와 췌장 샘암종 87예를 대상으로 면역조직화학 적 방법을 이용하여 C-erbB-2, COX-2 MMP-9, p53과 VEGF 의 과발현, 유전자 단백의 동시발현성과 상호관련성, 암발 생 부위에 따른 발형양상의 차이점 그리고 임상병기에 따 른 유전자 단백의 발현양상에 대한 연구를 한 결과 다음과 같은 성적을 얻었다.
1. C-erbB-2, COX-2, MMP-9, P53과 VEGF의 발현은 다양 하게 관찰되었으나 발생부위에 따른 유전자 단백의 발현도 의 차이는 통계학적 유의성이 없었다(P＞0.05).
2. 유전자 단백의 동시발현능이 다양하게 관찰되었으나, 간내 담관세포암종은 VEGF와 COX-2, 담낭샘암종은 VEGF 와 MMP-9, 간외 담관과 췌장의 샘암종은 VEGF와 p53이 통 계학적으로 서로 유의성있게 동시발현되었다(P＜0.05).
3. 임상병기와 유전자 단백발현의 연관성에 있어서 간외 담관에서 기원한 샘암종은 C-erbB-2와 COX-2의 발현이 임상 병기가 높을수록 발현도가 유의하게 증가하였다(P＜0.05).
이상과 같은 성적을 종합해 볼 때, 간담도계와 췌장의 샘 암종은 다단계 암발생과정에서 여러 가지 관련 암유전자들 이 관여한다는 것을 알 수 있었고, 이러한 과정 중 VEGF가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 그리고 C-erbB-2 와 COX-2의 예후인자로서의 유용성에 대해서는 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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