즉석섭취식품 도시락에서 와 의 정량적 미생물 위해 및 관리 평가

즉석섭취식품 도시락에서 Clostridium perfringens와 Bacillus cereus의 정량적 미생물 위해 및 관리 평가

김수진¹․이정연¹․하상도²․이민석³․윤요한⁴․윤기선¹

1경희대학교 식품영양학과, ²중앙대학교 식품공학과

3고려대학교 식품공학과, ⁴숙명여자대학교 위해분석연구센터

Quantitative Microbial Risk Assessment and Control Effects of Clostridium perfringens and Bacillus cereus in Ready-To-Eat Lunch Box

Su Jin Kim¹, Jeong Yeon Lee¹, Sang Do Ha², Min Suk Rhee³, Yo Han Yoon⁴, and Ki Sun Yoon¹

1Department of Food and Nutrition, Kyung Hee National University

2Department of Food Science and Technology, Chung Ang University

3Department of Biotechnology, Korea University

4Risk Analysis Research Center, Sookmyung Women’s University

ABSTRACT Quantitative risk assessment of Clostridium perfringens and diarrheal Bacillus cereus in RTE lunch boxes from convenience stores was performed. The efficacy of control measures using a microwave for B. cereus in RTE lunch boxes was also evaluated using the stochastic food safety objective (FSO) tool. The risk of C. perfringens and B. cereus due to consumption of RTE lunch boxes was estimated with @RISK. The results of the worst-case exposure assessment indicate that the probability of foodborne illness caused by C. perfringens was 1.22×10^-10 per one serving per day from a vacuum-packaged lunch box, while the probability of foodborne illness caused by B.

cereus was zero. Storage time for lunch boxes could be extended up to 6 h at 20°C, 4 h at 25°C, and 2 h at 30°C with microwave heating for 3 min.

Key words: RTE lunch box, microbial risk assessment, C. perfringens, diarrheal B. cereus, food safety objective

Received 1 June 2020; Accepted 9 July 2020

Corresponding author: Ki Sun Yoon, Department of Food and Nutrition, Kyung Hee University, Seoul 02447, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-2-961-0264

Author information: Su Jin Kim (Graduate student), Jeong Yeon Lee (Graduate student), Sang Do Ha (Professor), Min Suk Rhee (Professor), Yo Han Yoon (Professor), Ki Sun Yoon (Professor)

서 론

최근 1인 가구 증가 및 식생활의 편리함을 추구하는 소비 자의 다양한 기호를 반영한 가정간편식, HMR(Home Meal Replacement)의 소비가 증가하고 있다. HMR은 가정식 형 태로 소비할 수 있도록 고안된 완전 조리 또는 반조리 형태 의 제품으로 가정에서 단순한 조리 과정만 거치면 간편하게 먹을 수 있도록 식재료를 가공･조리･포장해 놓은 식품으로 즉석섭취･편의식품류가 포함되어 있다(KAFFTC, 2019).

그중 즉석섭취식품(Read-To-Eat)은 동･식물성 원료를 식 품이나 식품첨가물을 가하여 제조･가공한 것으로써 더 이상 의 가열, 조리 과정 없이 그대로 섭취할 수 있는 도시락, 김밥, 햄버거, 선식 등의 식품으로 정의되고 있다(MFDS, 2019c).

가정 간편식 시장은 2015년부터 성장이 가속화되고 있으 며 그중 즉석섭취식품의 비중은 2017년 기준 54.1%이고, 즉석섭취식품 중 가장 큰 비중을 차지하는 품목은 도시락이 다(KREI, 2018). 도시락은 현재 65종 이상의 다양한 제품들 이 판매되고 있는데 증가하는 시장규모에 비해 미생물학적 안전성에 대한 모니터링 데이터, 위험요인, 유통환경에서의 품질과 안전성을 확보할 방안 등에 대한 연구가 매우 부족한 실정이다.

Clostridium perfringens는 혐기성 균이며 대량으로 식 품을 조리하여 저장하는 집단 급식에서 주로 발생하기 때문 에 다른 식중독에 비해 발생 건수 대비 환자 수가 많다. C. perfringens의 주요 식중독 원인 식품은 육류 및 육류가공 품이 보고되었다. Bacillus cereus 오염의 주요 원인 식품은 쌀밥이나 볶음밥 등의 전분식품, 야채, 곡류, 육류 등 식품 원재료 및 그 재료들로 가공 조리된 식품으로 검출 비율이 높으나 식중독 발생 빈도는 낮은 편이다. 국내에서는 지난 10년간 C. perfringens와 B. cereus에 의한 식중독 발생 건 수가 각각 93건, 77건, 환자 수는 5,115명, 1,254명으로 C. perfringens에 의한 식중독이 더 많이 발생하였다(MFDS,

2019b).

정량적 미생물 위해평가(Quantitative Microbial Risk Assessment, QMRA)는 어떠한 특정 병원성 미생물에 의해 오염된 식품을 섭취했을 때, 병원성 미생물에 의해 감염이나 질병이 일어날 리스크를 과학적으로 분석･평가하는 방법이 다(NIFDS, 2016). QMRA는 유해 미생물의 안전관리 기준 설정 및 관리 방안 등 미생물 기준규격을 설정하는 데 활용 될 수 있다(Ko 등, 2012). Food Safety Objective(FSO)는 식품 내 유해물질의 오염 허용수준 관리를 위해 소비자가 구매하고 섭취하는 단계에서 오염 허용수준을 농도 또는 빈 도로 나타낸 것이다(Hong, 2018). FSO는 세척, 가열, 소독 및 미생물학적 위험을 제거하거나 허용 가능한 수준으로 줄 이는 데 사용되는 다양한 제어 방법의 효과를 평가하는 도구 로 사용될 수 있다(Cole, 2004). 현재 국내에서 도시락과 같은 즉석섭취식품의 미생물 기준규격은 세균수의 경우 멸 균제품만 음성(n=5, c=0, m=0)으로 관리되고 있고 C. per- fringens와 B. cereus는 각각 1 g당 100 이하, 1,000 이하 로 관리되고 있다(MFDS, 2019c). 미생물 기준규격은 미생 물학적 안전성을 확보할 수 있다는 점에서는 매우 중요하나, 제품에서 미생물의 위해도 및 심각성을 고려하지 않은 지나 친 기준규격은 관련 산업체의 발전을 저해할 수 있다는 문제 점이 있다. 따라서 미생물 위해평가를 통해 제품의 공정 또 는 유통 과정 중 관리해야 할 부분을 정확히 판단하여 안전 관리 방안을 개선할 수 있다.

즉석섭취식품 중 도시락 시장이 증가하기 시작한 지 오래 되지 않아 도시락에 관련된 선행연구는 매우 부족하다. 국내 에서는 여러 즉석섭취식품 중 주먹밥에서 Staphylococcus aureus(Oh 등, 2019), 샌드위치와 즉석섭취 신선채소류에 서 Listeria monocytogenes(Tirloni 등, 2018; Oh 등, 2009), 김밥, 샌드위치에서 Staphylococcus aureus의 정량적 위해 평가 연구 등이 진행되었다(Bahk 등, 2006).

본 연구에서는 최근 소비가 증가하고 있는 즉석섭취식품 중 도시락의 미생물학적 안전성을 위해 식육 및 식육 가공품 에서 문제가 되는 C. perfringens와 쌀, 육류 등 다양한 가공 식품에서 문제가 되는 B. cereus에 대한 위해평가를 통해 도시락 제품의 기준규격 적합성을 평가하기 위해 진행되었 다. 추가로 유통 과정에서 보관온도 및 포장 방법이 즉석섭 취식품 도시락에 오염된 C. perfringens에 의한 식중독 발 생 가능성에 미치는 영향을 분석하였다. 또한 즉석섭취식품 도시락의 안전한 섭취를 위한 관리 방안으로 FSO의 개념을 활용하여 섭취 전 B. cereus 저감화를 위한 가열처리 및 보 관시간의 적정성을 평가하였다.

재료 및 방법

도시락에서 C. perfringens와 B. cereus 오염도 실태조사 서울 내의 편의점(GS25, CU, 세븐일레븐, 미니스톱, 이 마트24 등)에서 총 145개의 도시락을 구입하여 일반세균

수, 대장균군, 대장균, C. perfringens와 B. cerues의 모니 터링을 수행하였다. 도시락에서 일반세균수, 대장균군, 대장 균, C. perfringens와 B. cereus의 오염도 조사는 식품공전 (MFDS, 2019a)에 따라 정성 및 정량 분석을 실시하였다.

도시락에서 C. perfringens의 의심집락이 확인되었을 경우 PCR을 이용하여 확인시험을 진행하였고, B. cereus의 의심 집락은 VITEK(Biomerieux, Marcy I'Etoile, France), PCR (Bio-Rad Laboratory Inc., Hercules, CA, USA), 검경법 (Bio-Rad Laboratory Inc.)을 이용하여 조사하였다.

모니터링 결과로서 유병률(PR) 데이터를 위해 즉석섭취 식품 도시락에서 C. perfringens는 uniform distribution을, B. cereus는 beta distribution(α, β) 식을 활용하여 α: 양성 시료수＋1, β: 전체시료수－(양성시료수＋1)을 적용하였다 (Vose, 1998). 도시락에서 초기 B. cereus 수(log CFU/g)는 [Log(-ln(1-PR)/weight)]의 식을 통해 추정하였다(Sanaa 등, 2004). Uniform distribution은 발생 가능성이 동일한 값에 대한 분포로 오염도 조사 시 세균이 검출되지 않았을 경우, 세균수가 검출한계 이하로 존재하는 것으로 가정하여 오염 가능 수준을 추정할 때 사용되는 함수(distribution)이 고 beta distribution은 오염도 조사 시 양성 시료가 검출될 때 이용한다(MFDS, 2019c).

C. perfringens와 B. cereus 행동 예측모델 균 선정 및 균액 제조

실험에 사용된 C. perfringens 균주는 C. perfringens 포 자 혼합액(KCCM 12098, 40946, 40947, KCTC 5101)으로 한국미생물보존센터(KCCM, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였고 Reinforce Clostridial medium(RCM; Oxoid, Basingstoke, UK)으로 각각 계대 배양하여 -80°C에서 보 관하였다. 각각의 C. perfringens는 실험을 위해 해동시킨 후 멸균된 RCM 배지 10 mL에 100 μL를 접종하여 37°C 혐기챔버에서 24시간 동안 전 배양하였다. 전 배양된 균액 3 mL를 멸균된 Duncan and Strong medium 30 mL에 접종 하여 37°C 혐기챔버에서 48시간 동안 배양하였다. DS me- dium은 1.5% proteose peptone(Difco, Detroit, MI, USA), 0.4% yeast extract(Oxoid), 0.1% sodium thioglycolate, 0.4% raffinose(replacing starch), 1% sodium phos- phate, 100 μL caffeine(0.51 mM/mL)을 첨가하여 제조하 였다(Park 등, 2014). 배양된 균을 4,000 rpm으로 10분 동안 원심분리(VS-550, Vision, Daejeon, Korea)하여 상 층액을 제거한 다음 남은 펠렛에 phosphate buffer sal- ine(PBS) 30 mL를 넣어 다시 원심분리하였다(4,000 rpm, 10분). 원심분리 후 상층액을 제거한 다음 남은 펠렛에 각각 3 mL PBS를 넣어준 후 모두 혼합하여 포자 혼합액을 제조 하였다.

본 연구에 사용된 B. cereus 균주는 설사형 B. cereus 영 양세포(vegetative cell) 혼합액(KCTC 1014, 1092, 3624, KCCM 11204)으로 한국종균협회(KFCC, Seoul, Korea)에

서 분양받아 사용하였고 -80°C에서 냉동 보관하였다. 각각 의 B. cereus는 실험을 위해 해동시킨 후 10 μL를 멸균된 Tryptic Soy Broth(TSB; Difco) 배지 10 mL에 접종하여 36°C에서 24시간 동안 140 rpm의 rotary shaker(VS- 8480, Vision)에서 전 배양하였다. 전 배양된 균액을 TSB 에 접종하여 36°C에서 24시간 동안 계대 배양한 후, 배양된 균을 1912 rcf로 15분 동안 원심분리(VS-550, Vision)하 여 상층액을 제거하였다. 상층액을 제거한 후 남은 펠렛에 멸균된 펩톤수 10 mL를 넣어 다시 15분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하여 펩톤수 10 mL를 넣어준 각각의 균주를 혼합하여 영양세포 혼합액을 제조하였다.

모델 시료 준비 및 접종

즉석섭취식품 도시락에서 C. perfringens 포자 혼합액의 행동 예측모델 개발 대상 제품은 판매량, 제품의 형태, HACCP 인증 등을 고려하여 편의점(GS25, Seoul, Korea) 에서 판매되는 즉석섭취식품 도시락 3종을 구입하였다. 모 델 개발 대상식품 선정을 위하여 도시락밥과 주메뉴인 제육 볶음, 간장 불고기, 볶음 닭가슴살의 이화학적 품질을 분석하 고 C. perfringens의 생존 특성을 비교하였다. 분석 결과 C. perfringens가 가장 오랫동안 생존하는 제육볶음이 주메 뉴인 도시락을 선정하여 모델 개발에 이용하였다.

10 g의 제육볶음을 멸균적으로 채취하여 petri dish에 담 고, 약 4~6 log CFU/g 농도의 C. perfringens 포자 혼합액 또는 B. cereus 영양세포 혼합액을 20 μL로 다섯 번씩 총 100 μL를 표면에 분주하였다. C. perfringens가 접종된 제육 볶음은 멸균적으로 신속히 호기포장과 혐기포장(FR-B100 WB, CSE Company, Siheung, Korea)으로 나누어 포장한 뒤 4, 10, 17, 25°C에서 각각 보관하며 C. perfringens 영양 세포와 포자 행동을 관찰하였다. 설사형 B. cereus가 접종 된 도시락은 4, 10, 15, 16, 17, 20, 25, 30, 37°C에서 보관 하며 B. cereus 영양세포의 행동을 관찰하였다.

모델 개발 및 검증

생존 특성을 예측하기 위한 1차 생존 예측모델은 Gina FiT V1.5 프로그램(KU Leuven, Flanders, Belgium)을 사 용하여 Weibull model을 활용했으며(Geeraerd 등, 2005), delta 및 p 값을 산출하였다.

Weibull equation: Log(N0)－(t/delta)^P (1) N₀, 미생물의 초기오염농도; t, 시간; delta, 초기오염농도에 서 1 log CFU/g 감소하는 데 걸리는 시간; p, 그래프 모양 (p>1: concave downward curve, p<1: concave upward curve, p=1: log-linear)

증식 특성을 예측하기 위한 1차 증식 모델은 Graph Pad Prism V4.0(Graph Pad Software, San Diego, CA, USA) 프로그램을 이용해(Gibson 등, 1987) modified Gompertz

model을 사용하였고, 유도기(LT, lag time)와 최대증식속 도(maximum specific growth rate, SGR), 최대개체군밀도 (maximum population density, MPD)를 구하였다.

Modified Gompertz model: N₀+C×exp{-exp[(2.718×

SGR/C)×(LT-X)+1]} (2) N0, 미생물의 초기오염농도; C, 초기 미생물 수와 최종 미생 물 수의 차이; LT, 유도기; SGR, 최대증식속도; X, 샘플링 시간

1차 생존 예측모델에서 얻은 delta와 p를 활용하여 즉석 섭취식품 도시락 중 제육볶음에서 온도에 따른 C. perfrin- gens의 2차 생존 예측모델은 Polynomial second-order model(McMeekin 등, 1993)을 활용하였다.

Polynomial second-order model: Y＝a+(b*T)+(c*T²) (3) Y, delta; a, b, c, 상수; T, 온도

1차 증식 예측모델에서 얻은 LT, SGR, MPD를 활용하여 즉석섭취식품 도시락에서 온도에 따른 B. cereus의 2차 증 식 예측모델은 각각 Davey model, Square root model (McMeekin 등, 1993)을 활용하였다.

Davey model: Y＝a+(b/T)+(c/T²) (4) Y, 유도기; a, b, c, 상수; T, 온도

Square root model: Y＝[b(T-Tmin)]² (5) Y, 최대증식속도(log CFU/h); b, 상수; T, 온도 C. perfringens 포자 혼합액을 제육볶음에 접종하여 개발 한 생존 예측모델이 도시락 위해평가에 활용이 가능한지 검 증하기 위해 모델 개발에 사용된 도시락과 동일한 제육볶음 도시락을 시료로 사용하였다. 10 g의 밥과 모든 메뉴를 섞은 제육볶음 도시락을 멸균적으로 채취하여 페트리 접시에 담 은 후, C. perfringens 포자 혼합액을 20 μL로 다섯 번씩 총 100 μL를 표면에 분주하였다. 호기 상태로 10, 20°C의 저장 온도에서 C. perfringens 포자의 행동을 확인하였다.

도시락의 섭취패턴

도시락의 섭취량 및 섭취자 비율 데이터를 위해 제주지역 을 제외한 전국의 만 19세 이상 성인남녀 1,000명을 대상으 로 진행된 미생물 위해평가를 위한 50대 주요 식품의 섭취 량 및 섭취패턴 실태조사(MFDS, 2012a)와 가공식품 세분 시장(KAFFTC, 2016)의 연구 결과를 활용하였다. 섭취자 비율 조사는 1일 3회 이상, 1일 2회, 1일 1회, 주 4~6회, 주 2~3회, 주 1회, 월 2~3회, 월 1회, 거의 먹지 않음의 9단 계로 조사했으며, @RISK 7.5 프로그램(Palisade Corp., Ithaca, NY, USA)을 활용하여 즉석섭취식품 도시락 섭취량 의 적정 확률분포모델을 결정했다.

C. perfringens와 B. cereus의 용량 반응모델

C. perfringens의 용량 반응모델은 Golden 등(2009)에 의해 개발된 Exponential model이 유일하여 이를 이용하였 다.

P＝1-exp(r*N) (r＝1.82*10^-11)

P, C. perfringens의 질병 발생 가능성; r, 하나의 세포에 의해 질병이 발생할 수 있는 확률; N, C. perfringens의 섭 취로 노출된 세포의 양

B. cereus의 용량 반응모델은 식품의약품안전처에서 수 행된 식중독균의 용량 반응모델 및 최소 감염량 조사 연구 (MFDS, 2012b) 결과를 참고하였다. B. cereus는 용량 반응 모델이 개발되어 있지 않아 최소 감염량을 대체 적용하였으 며, 그 값은 선행연구들에서 대부분 제시하고 있는 10⁵ cells (Valero, 2007; Luning 등, 2006; La Duc 등, 2004; Kotir- anta 등, 2000; Granum과 Lund, 1997)로 적용하였다. 섭 취 시점에서의 위해도 추정은 시뮬레이션 구동 조건을 ‘최종 섭취 세균수> 최소 감염량 ⇒ 1: 식중독에 걸린다’, ‘최종 섭취 세균수< 최소 감염량 ⇒ 0: 식중독에 걸리지 않는다’로 하여 1일 1회 도시락 섭취로 인한 식중독 발생 가능 확률을 계산하였다.

@RISK Excel sheet

즉석섭취식품 도시락의 섭취로 인한 C. perfringens와 B. cereus에 의한 식중독 발생 확률을 추정하기 위해 수식과 입력 변수(input)를 Excel(Microsoft@ Excel 2010, Micro- soft Corp., Redmond, WA, USA) spreadsheet 프로그램에 작성하여 시나리오를 모델화했으며, @RISK 7.5(Palisade Corp.)를 이용해 몬테카를로 시뮬레이션을 활용하여 위해 도를 산출하였다(Table 1, 2). Sampling type은 median latin hypercube sampling, generator seed는 random 방 법을 선택하였고, iteration(반복시행 횟수) 10,000 이상의 결과를 최종 시뮬레이션 결과로 이용하였다. 최종 시뮬레이 션 결과에 대한 영향요인 분석 역시 @RISK에 있는 민감도 분석(sensitivity analysis) 기능을 이용하여 상관계수를 산 출하였다.

도시락에서 B. cereus의 저감화에 대한 가열 효과 편의점 도시락을 섭취하기 전 B. cereus를 저감화하기 위 해서 전자레인지를 활용해 가열하는 방법의 효과를 보기 위 한 연구를 위해 편의점에서 판매량이 가장 높은 제육볶음 도시락을 구입해 사용하였다. B. cereus의 감소에 대한 가 열 효과를 조사하기 위해 즉석섭취식품 도시락의 1일 평균 섭취량인 417 g에 B. cereus 영양세포 혼합액을 접종하여 초기 농도가 약 3.5 log CFU/g이 되도록 하였다. 그 후 접종 된 도시락은 20, 25, 30°C에서 24시간 동안 보관하며 적절 한 시간 간격을 두고 꺼내어 도시락 제조업체의 조리방법을

참고하여 가정용 전자레인지(MW201JW, 700 W, LG Elec- tronics, Seoul, Korea)를 이용해 2분, 2분 30초, 3분 가열 한 다음 25 g의 시료를 채취하여 225 mL의 멸균된 0.1%

펩톤수로 균질화한 후 저감화 효과를 확인하였다.

FSO를 이용한 미생물학적 위해 요소에 대한 제어 효과 검증 FSO를 만족시킬 수 있는 즉석섭취식품 도시락의 미생물 학적 위해성 제어방안의 효과를 평가하기 위해 stochastic FSO tool 1.03을 사용하였다(ICMSF, 2011).

Ho-∑R+∑I≤FSO

Ho＝위해요소의 초기오염 수준

∑R＝관리 방법으로 예측되는 위해요소의 총 감소량

∑I＝공정 과정에서 위해요소의 총 증가량

본 연구에서 FSO, Ho, ∑R, ∑I는 모두 log CFU 값이고 B. cereus의 Ho값은 도시락에 접종한 초기오염농도로 초기 평균값과 표준편차를 FSO tool에 입력하였다. ∑R은 도시락 에서 전자레인지(700 W)를 이용해 2분, 2분 30초, 3분 동안 가열함으로써 B. cereus 영양세포의 총감소량으로 입력되 었다. ∑I는 도시락 섭취 전 보관 시간과 온도에 따른 B. cer- eus 증가의 합으로 입력되었다. 즉석섭취식품 도시락의 B. cereus의 FSO 기준은 3 log CFU/g으로 설정했으며, 이는 식품 공전에서 제시하는 미생물학적 관리기준으로 본 연구 에서 활용하였다(MFDS, 2019a).

통계 분석

본 실험은 SAS Software(ver. 9.4, SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA)를 활용하여 C. perfringens에서 온도별 포장조건(호기/진공)을 달리한 즉석섭취식품 도시락의 델타 값 차이에 대해 t-검정(t-test)을 이용하였고, B. cereus에 서는 온도에 따른 즉석섭취식품 도시락의 델타, p값, 유도 기, 최대증식속도, 최대개체군밀도를 Duncan의 다중검정 (Duncan’s multiple range test)을 이용하여 P<0.05 수준 에서 유의성을 검정하였다.

결과 및 고찰

도시락에서 C. perfringens와 B. cereus의 초기오염도 현재 편의점(GS25)에서 판매되고 있는 즉석섭취식품 도 시락(n=65) 모니터링 연구 결과에 따르면 도시락에서는 C. perfringens가 검출되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 최 소 -2 log CFU/g부터 검출한계(<0.5 log CFU/g)값을 uni- form distribution(-2, 0.5)을 활용하여 초기오염농도를 추 정한 결과 포장방법에 상관없이 모두 초기오염도 값은 -0.74 log CFU/g으로 확인되었다. B. cereus의 경우 편의 점(GS25)에서 80개의 도시락 중 제육볶음 도시락과 불고기 도시락을 포함한 23개의 도시락에서 B. cereus는 양성으로

(A) Contamination level of C. perfringens (B) Contamination level of B. cereus

Minimum Mean Maximum

−3.64

−0.74

−0.30

Minimum Mean Maximum

−2.26

−1.86

−1.53

(Unit: log CFU/g) Fig. 1. Probability distribution of initial contamination level of C. perfringens (A) and B. cereus (B) in lunch box.

나타났다. 따라서 B. cereus의 초기오염 수준은 오염실태 조 사 결과를 반영할 수 있는 beta distribution을 활용하여 추 정한 결과 평균 -1.86 log CFU/g으로 확인되었다(Fig. 1).

제육볶음 도시락에서 C. perfringens와 B. cereus의 생존 예측모델 개발 및 검증

본 연구의 4~25°C 온도에서 호기 또는 진공 포장된 도시 락의 제육볶음에서 C. perfringens가 사멸하여 Weibull model을 활용해 개발한 생존 예측모델은 Fig. 2와 같다. 도 시락 주메뉴인 제육볶음에서 C. perfringens의 델타 값(1 log 감소가 발생하는 데 걸리는 시간)은 호기와 진공 포장에 서 모두 온도가 높아질수록 감소하여 이는 저장 온도가 높을 수록 제육볶음에서 C. perfringens가 빨리 죽는다는 것을 의 미한다. 또한 그래프 모양을 나타내는 p값은 4°C에 저장한 진공포장 도시락을 제외하고 포장방법에 상관없이 모든 온 도에서 1보다 작아 접종 초기 미생물 균수가 급속히 사멸하 는 형태인 concave upward curve로 나타나 제육볶음 도시 락에서 C. perfringens는 오염 직후 급격히 감소했음을 확 인할 수 있었다. 또한, 온도가 낮을수록 진공포장한 제육볶 음 도시락에서 C. perfringens가 더 오래 생존하는 것을 확 인했는데, C. perfringens는 편성혐기성 균이나 약간의 산소 에 견디는 균으로 제육볶음 도시락 경우도 호기포장보다는 혐기포장 상태에서 더 잘 생존했을 것으로 사료된다. 본 연 구 결과, 호기와 진공 포장된 육포에서 C. perfringens가 모두 사멸하고 보관기간이 길어질수록 진공포장에서 더 오 래 생존한 것을 관찰한 연구와 비슷한 경향의 결과를 보였다 (Nam 등, 2018).

본 연구에서는 도시락의 주메뉴인 제육볶음에서 C. per- fringens 포자의 생존 특성을 예측할 수 있는 모델이 도시락

의 밥과 전 메뉴가 포함된 도시락 전체에 적용할 수 있는지 를 검증하였다. 호기 조건에서 10, 20°C에 보관된 도시락에 서 C. perfringens 포자의 델타 값은 각각 23.59, 3.50시간 으로 나타났다. 또한, 도시락의 RMSE(root mean square error)값이 10°C는 0.025, 20°C는 0.950으로 나타났다. 실 험 결과 주메뉴를 포함한 밥과 부메뉴 모두를 혼합한 시료에 서도 C. perfringens 포자의 델타 값은 큰 차이가 없음을 확인하였다(data not shown).

도시락에서 B. cereus의 행동 예측모델의 parameter에 대한 결과는 Table 3과 같다. 도시락에서 B. cereus는 16°C 미만의 보관온도인 4, 10, 15°C에서 사멸되는 경향을 보여 Weibull model을 이용해 생존모델을 개발하였고, 17, 20, 25, 30, 37°C에서는 성장하는 경향을 나타내 modified Gompertz model을 활용해 성장모델을 개발하였다. B. cereus는4~15°C 사이의 온도에서는 도시락의 보관 온도 가 높아질수록 B. cereus가 빨리 감소하여 4°C에서 사멸하 는 속도가 가장 느렸으며, 4, 10, 15°C 사이에 델타 값은 유의적인 차이가 있는 것으로 확인되었다(P<0.05). 이와 같 은 결과는 도시락에 오염된 B. cereus의 경우 냉장 보관온 도에서 더 잘 생존한다는 것을 의미한다. 위 온도에서 모든 p값은 1보다 커 오염 초기에 균이 천천히 감소했음을 확인 할 수 있었다. 16°C에 보관된 도시락에서 B. cereus는 성장 하거나 사멸되지 않아 생장과 사멸의 온도 경계에 있는 것으 로 확인되었다. Lee와 Bae(2015)의 연구에 따르면 도시락 을 구입해 섭취하는 소비자 중 바로 섭취하지 않는 대부분의 소비자가 섭취 전 24시간 이내로 상온 보관하는 것으로 나 타났다. 본 연구에서는 17°C 이상 37°C 사이 온도에서 보관 온도가 높아질수록 도시락에서 B. cereus는 빠르게 증식하 였으나, 유도기는 20°C 이상의 보관 온도에 따른 유의적 차

4°C 10°C

17°C 25°C

Fig. 2. Primary survival models of C. perfringens on lunch box under various storage conditions. *Significantly different by t-test at P<0.05.

Table 3. Survival and Growth kinetic parameters of B. cereus in lunch box as a function of temperature

Temperature (°C) Delta¹⁾ p²⁾ LT³⁾ SGR⁴⁾ MPD⁵⁾

4 10 15 16 17 20 25 30 37

248.66±20.23^a 61.79±10.08^b 49.36±6.66^b

－

－

－

－

－

－

1.94±0.02^a 1.39±0.38^a 1.17±0.40^a

－

－

－

－

－

－

－

－

－

－ 9.08±1.95^a 4.46±0.35^b 3.88±0.61^b 3.02±0.43^b 1.93±0.33^b

－

－

－

－ 0.07±0.18^a 0.11±0.01^a 0.33±0.01^a 0.58±0.08^b 0.83±0.00^b

－

－

－

－ 4.31±0.28^a 4.77±0.07^a 6.97±0.87^b 7.10±0.22^b 8.78±1.11^b

1)Delta: treatment time for the first decimal reduction (h).

2)p: shape.

3)LT: lag time (h).

4)SGR: specific growth rate (log CFU/h).

5)MPD: maximum population density (log CFU/g).

Means values in the same column with different letters (a,b) are significantly different (P<0.05).

이가 없었다. 그러나 최대증식속도는 30°C 이상의 보관온도 에서 유의적 차이를 보였다. 최대개체군밀도는 20°C까지는 4.77 log CFU/g이었으나 25°C에서는 6.97 log CFU/g까지 성장하여 상온 보관 시 20°C 이하로 유지해야만 10⁵ 이하로 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다. B. cereus는 10⁵~10⁶ CFU/g 오염이 증가했을 때 장 독소 생성이 보고되었으며, 일부 연구에서는 장 독소 생성의 가장 적합한 온도를 32°C 로 나타내고 있다(Kramer와 Gilbert, 1989; Fermanian 등, 1997). 최근 조리된 파스타에서 B. cereus 포자를 이용한 성장모델이 개발된 연구(Juneja 등, 2019)에서도 온도가 낮 을수록 B. cereus의 증식은 느린 것으로 보고되었다. 그러

나 Juneja 등(2019)의 연구에서는 B. cereus 구토형과 설사 형 포자를 모두 이용해 모델을 개발했기 때문에 설사형 영양 세포만을 이용하여 16°C 미만에서 사멸하는 경향을 보인 본 연구와는 다르게 13°C에서도 증식하는 경향을 보였다.

본 연구에서는 즉석섭취식품 도시락에서 검출된 B. cereus 는 모두 설사형으로(MFDS, 2019c) 도시락에서 B. cereus 의 1차 예측모델의 parameter인 Delta, LT, SGR, MPD 값 이 온도변화에 따라 어떻게 변화하는지를 나타낸 2차 모델 을 개발하여 도시락의 판매장에서 가정까지의 운송 중 B. cereus 오염도 변화를 예측하는 데 활용하였다.

(A) C. perfringens

Aerobic packing Vacuum packing

(B) B. cereus

Aerobic packing

Fig. 3. Cumulative distribution for comparing the contamination level of C. perfringens and B. cereus on lunch box from initial contamination level to home with @RISK. IC, initial contamina- tion level; C1, market storage; C2, transportation; C3, home stor- age.

도시락의 판매장에서 가정까지 유통 중 C. perfringens와 B. cereus의 오염도 변화

도시락의 판매장에서 가정까지의 유통환경 및 포장 상태 에 따른 C. perfringens와 B. cereus의 오염도 변화 및 최종 오염 수준을 예측한 결과는 Fig. 3과 같다. 선행연구 결과 (Lee와 Bae, 2015)에 따르면 구매 직후 도시락을 섭취하는 비율은 81.5%였고, 바로 섭취하지 않고 24시간 이내에 보 관 시 실온에 보관하는 경우는 73%였다. 본 연구에서는 극 단적인 시나리오(worst scenario)로 소비자들이 도시락을 구입 후 즉시 섭취하지 않고 실온에 보관하는 경우를 설정하 여 즉석섭취식품에서 C. perfringens와 B. cereus에 의해 일어날 식중독 가능성을 추정하였다.

C. perfringens의 초기오염도(IC)는 호기 또는 진공포장 시 모두 -0.7 log CFU/g으로 도시락 판매장에서 보관하는 동안 오염 수준은 호기, 진공포장 시 -2.1, -1.3 log CFU/

g(C1)으로 각각 감소했으며 판매장에서 가정으로 운송하는 동안 호기, 진공포장 도시락에서 각각 -2.8, -1.4 log CFU/

g(C2)으로 낮아졌다. 가정에서 섭취 전 실온 보관 시 도시락 의 오염도는 호기, 진공포장에서 각각 -5.8, -2.2 log CFU/

g(C3)으로 감소하였다. 특히 진공 포장된 도시락에서는 C. perfringens가 더 적게 감소하여 즉석섭취식품 도시락에서 C. perfringens에 의한 리스크를 감소하기 위해서는 진공보 다 호기포장이 더 적합하다는 것을 재확인하였다(Fig. 3A).

즉석섭취식품 도시락에 B. cereus의 초기오염도는 호기 포장된 도시락에서 -1.9 log CFU/g이고, 도시락 판매장에 서 -2.5 log CFU/g, 가정으로 운송되었을 때 오염 수준은 -2.5 log CFU/g으로 추정되었다. 도시락 판매장에서 가정 으로 운송되는 동안 온도는 최소 10°C에서 최대 25°C로 B. cereus가 증식하지 않는 경계 온도가 포함되어 있었다.

또한 운송시간이 최대 1.6시간으로 운송 중 온도가 25°C라 할지라도 B. cereus의 증식에 큰 영향이 없는 것으로 확인 되었다. 그러나 최종적으로 가정에서 섭취 전 실온 보관 시 오염 수준은 -1.7 log CFU/g으로 증가했는데, 이는 가정에 서 가장 극단적인 시나리오로 실온에서 최대 24시간까지 보관했을 때 온도가 최소 -7°C, 최빈 23.1°C, 최대 28.8°C (KMA, 2019)가 고려되었을 때 가정에서 오염 수준이 증가 하였다. 결론적으로 즉석섭취식품 도시락을 섭취하기 전 실 온에 보관하는 것이 B. cereus의 위해도에 가장 큰 영향을 주는 것으로 확인되었다.

@RISK를 활용한 도시락에서 C. perfringens와 B. cereus 의 정량적 위해평가

즉석섭취식품 도시락의 1일 평균 섭취량의 확률분포 모 델 식은 RiskNormal이 가장 적합한 것으로 나타났으며 1일 평균 섭취량은 417.27 g(Fig. 4), 하루에 한 번 섭취하는 섭취자 비율은 전체 조사대상자 중 0.17인 것으로 조사되었

Fig. 4. Probabilistic distribution of lunch box intake.

Table 4. Probability of foodborne illness of C. perfringens and B. cereus per day per one serving of lunch box Probability of illness/person/day Min 25% Mean 95% Max C. perfringens Vacuum

Aerobic

3.89×10^-15 0

3.54×10^-12 0

2.15×10^-11 3.67×10^-13

8.56×10^-11 1.89×10^-12

2.41×10^-10 1.41×10^-11

B. cereus Aerobic 0 0 0 0 0

다. 유통 및 저장 단계를 거치면서 균수 변화에 따른 C. per- fringens와 B. cereus의 최종오염 수준(log CFU/g)과 가정 에서 도시락의 1일 섭취량과 섭취자 비율을 고려하여 소비 자가 최종적으로 섭취하게 되는 C. perfringens 및 B. cer- eus의 양은 최종오염 수준(CFU/g)에 1일 섭취량(g)과 섭취 자 비율을 곱하여 추정하였다. C. perfringens의 용량 반응 모델은 Golden 등(2009)에 의해 개발된 Exponential mod- el을 사용하였다.

도시락 판매마트에서 가정까지 범위의 유통환경 시뮬레 이션을 통해 시중에 판매 중인 도시락을 1일 1회 섭취로 C. perfringens에 의한 식중독 발생 확률은 호기포장에서 평균 3.67×10^-13, 진공포장에서 평균 2.15×10^-11으로 나타 났다(Table 4). 이와 같은 결과는 즉석섭취식품 도시락에서 C. perfringens에 의한 식중독 발생 확률이 매우 낮은 것으 로 확인되었다. 또한 포장방법에 따른 최종 위해도 추정 결 과, 호기포장보다는 진공포장이 C. perfringens에 의한 위해 도가 높은 것으로 나타났으나, 호기포장 시 다른 호기성균들 의 증식이 일어날 수 있어 도시락 제조업체의 안전한 식재료 사용, 교차오염 방지, 온도/시간 관리 등 위생적인 제조관리 가 매우 중요할 것으로 사료된다.

B. cereus의 경우 용량-반응모델 식은 제시되어 있지 않 고 최소 감염량이 제시되어 이를 기준으로 식중독 발생 여부 를 추정하는 방식으로 위해 발생 수준을 추정하였다. 즉, 1 인당 1회 B. cereus 노출량이 최소 감염량 5 log CFU/g 이상 일 경우 질병 발생, 그 미만일 경우에는 질병이 발생하지 않 는 것으로 하여 최종 위해도를 추정하였다(MFDS, 2012b).

그 결과 현재 오염도, 유통 조건 및 소비자 섭취 패턴 등의

조건하에서 B. cereus에 의한 식중독 발생 확률은 없는 것 으로 추정되었다(data not shown). 이와 같은 결과는 현재 의 유통환경에서는 본 연구에서 위해평가에 사용한 설사형 B. cereus에 의해서는 도시락 섭취로 식중독 발생 가능성은 없는 것으로 확인되었다. 본 연구의 설사형 B. cereus는 도 시락에서는 17°C부터 증식하였고 실제로 도시락 판매장에 서 도시락의 보관온도는 평균 9.5°C로 B. cereus가 증식하 지 않는 온도였다. 판매장에서 집으로 이동하는 중의 온도는 최소 10°C, 최대 25°C, 가정에서의 보관온도는 평균 23.1

°C로 확인되었다. 따라서 도시락 판매장에서 집으로 이동하 는 환경에서는 B. cereus의 증식이 일어날 정도로 오래 보 관되지 않았으며 가정에서 최대 24시간으로 보관하여도 B. cereus 식중독에 걸리는 최소 감염량인 5 log CFU/g까지 증가하는 조건에 부합하지 않아 최종적으로 식중독 발생 가 능성은 없는 것으로 확인되었다.

민감도 분석

민감도 분석은 입력변수(초기오염도, 유통환경 조건, 섭 취량, 섭취자 비율 등)들이 리스크에 미치는 영향력의 크기 를 분석하는 방법으로 위해평가 시 위해 관리를 위한 우선순 위를 결정하고자 할 때 매우 유용하게 사용된다. 민감도 분 석을 통해 C. perfringens의 위해 수준에 대한 영향요인을 분석한 결과는 Fig. 5와 같다. 도시락에서 C. perfringens 위해도에 가장 큰 양의 상관관계를 나타내는 요인은 모두 도시락의 초기오염도로 나타났다. 호기포장에서는 가정 보 관온도, 가정 보관시간, 가정으로 운송하는 동안의 온도, 마 켓 보관시간, 가정으로 운송하는 동안 걸린 시간, 마켓 보관

Ready-to-eat lunch box

Aerobic packing Vacuum packing

Fig. 5. The regression coefficient for sensitivity analysis affecting illness by C. perfringens with consumption of lunch box.

(A) 20°C (B) 25°C

(C) 30°C

Fig. 6. The impact of control measures of B. cereus vegetative cell on lunch box based on acceptable probability for FSO at (A) 20, (B) 25, and (C) 30°C.

온도, 섭취량 순으로 음의 상관관계를 보였다. 진공포장에서 는 가정 보관온도, 가정 보관시간, 마켓 보관시간, 가정으로 운송하는 동안의 온도, 마켓 보관온도, 가정으로 운송하는 동안 걸린 시간, 그리고 섭취량 순으로 음의 상관관계를 나 타냈다.

FSO를 만족시키는 미생물학적 위해요소에 대한 제어방안 효과

FSO와 제어방안에 기초하여 즉석섭취식품 도시락의 보 관 및 섭취 단계에서 B. cereus 관리 방법이 미치는 영향을 조사하였다. 즉석섭취식품 도시락을 섭취하기 전 가정에서 의 가열시간을 B. cereus 관리수단으로 고려하였다(Fig. 4).

편의점에서 도시락을 구입한 후, 각각의 온도에서 보관한

뒤 섭취하기 전에 전자레인지(700 W)로 2분, 2분 30초, 3분 동안 가열하여 가열하지 않은 도시락의 B. cereus 저감화에 미치는 효과를 비교 분석하였다. 도시락 섭취 전 허용 확률 (Pa)이 0.9를 초과하여 FSO(3 log CFU/g 이하로 가정)를 만족시키는 데 필요한 보관온도와 가열시간에 따라 값을 구 했다. 도시락을 섭취하기 전 24시간 이내에 상온에 보관할 경우 위해가 될 수 있는 20, 25, 30°C의 상온 보관한 즉석섭 취식품 도시락에 있는 B. cereus 영양세포의 감소에 대한 가열 효과는 Fig. 6에 나타내었다. 열처리 효과 결과에 따르 면 가열하지 않거나 2분 가열 시 모든 온도에서 B. cereus의 FSO 규격(3 log CFU/g)을 만족시키는 저감화 효과는 없었 다. 2분 30초 가열 시 20°C에서는 2시간, 25°C와 30°C에서 는 1시간까지 보관하여도 B. cereus의 저감화 효과를 볼 수

있었다. 3분 가열 시에는 20°C에서 6시간, 25°C에서 4시간, 30°C에서 2시간까지 보관하여도 B. cereus의 FSO 규격을 만족할 수 있었다. 이와 같은 결과는 즉석섭취식품 도시락을 전자레인지로 가열 시 적어도 2분 30초로는 가열해주는 것 이 B. cereus 영양세포를 파괴하고 가열 후 보관시간을 연 장하는 데 더 효과적이라는 것을 보여준다. 또한 도시락 보 관 시 20°C에서 보관한 도시락이 25, 30°C에 보관한 도시 락보다 가열에 의한 저감화 효과가 컸으며, 이는 즉석섭취식 품 도시락의 보관온도 또한 미생물학적 위험을 줄이는 데 중요한 요소임을 나타낸다.

많은 연구(Dev 등, 2008; Giuliani 등, 2010; Tang 등, 2002; Shenga 등, 2010)에서 전자레인지가 미생물의 파괴 에 효과적이라는 것을 입증했다. 또한, Bacillus(Khalil과 Villota, 1986)와 Clostridium 포자(Grecz 등, 1964)의 전 자레인지에 의한 불활성화가 기존의 단순 열처리 방식보다 훨씬 높은 것으로 보고되었다. 즉석섭취식품 도시락의 경우 제조업체에서 제시하는 전자레인지를 이용한 일반적인 가 열 조건은 냉장온도인 10°C에서 보관했을 때 2분 30초이 다. 본 연구에서는 10°C 보관 시에 B. cereus 증식에 의한 리스크가 없음을 확인하였다. 20°C 이상의 상온에서 보관 시 B. cereus의 오염으로부터 도시락을 안전하게 섭취하기 위해서는 전자레인지로 3분 이상 가열하는 것이 가장 효과 적인 것을 확인하였다. 결론적으로 도시락을 10°C 이하 냉 장 보관할 경우에는 B. cereus 영양세포가 사멸하기 때문에 냉장온도 보관의 경우 가열처리 없이도 안전할 수 있다. 그 러나 섭취 전 상온 보관 시에는 B. cereus 영양세포가 증식 하여 식중독 발생의 위험이 있기 때문에 상온의 보관온도에 서 가열하지 않거나 전자레인지에서 2분 가열은 충분하지 않은 것으로 확인되었다. 본 연구에서 사용한 B. cereus는 설사형 영양세포로 구토형이나 포자가 오염되었을 경우에 는 리스크가 달라질 수 있다. 최근 설사형과 포자형의 리스 크를 분석한 연구 결과(Kwon 등, 2019)에 따르면 B. cereus 구토형과 포자는 B. cereus 설사형과 영양세포보다 열에 대 한 저항력이 높았음을 확인할 수 있다.

요 약

본 연구에서는 즉석섭취식품인 도시락에서 C. perfringens 와 B. cereus의 정량적 리스크를 평가하고 안전관리 방안 연구를 진행하였다. 국내 편의점에서 판매되고 있는 도시락 제품에서 C. perfringens는 검출되지 않았으나, B. cereus 는 80개의 제품 중 23개 제품에서 검출되었다. 즉석섭취식 품 도시락에서 C. perfringens는 포장방법에 상관없이 4°C 에서 25°C 사이의 온도 범위에서 모두 사멸하였고, B. cer- eus는 15°C에서 사멸을, 17°C에서는 증식하였다. @RISK 프로그램을 이용한 정량적 위해평가분석 결과에 따르면 1일 1회 즉석섭취식품 도시락 섭취로 C. perfringens로 인한 식 중독 발생 확률은 호기/진공 포장 각각 3.67×10^-13, 2.15×

10^-11으로매우 낮은 것으로확인되어즉석섭취식품 도시락 에서 미생물학적 기준설정에 대한 제고가 필요한 것으로 판 단된다. 그러나 B. cereus의 경우 본 연구에서는 설사형 B. cereus로 연구가 진행되었기 때문에 다른 유전형에 대한 연구가 추가로 필요할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 또한 즉석섭취식품 도시락을 구입 후 B. cereus가 증식할 위험이 있는 상온에 보관한 경우를 고려하여 섭취하기까지 허용 가 능한 수준(FSO)으로 줄이기 위해 전자레인지 가열을 통한 저감화 효과를 평가하였다. 섭취 전 20°C 이상의 상온에 보 관 후 전자레인지 가열시간의 효과는 3분으로 가열하는 것 이 2분, 2분 30초 가열하는 것보다 FSO를 만족시키는 보관 시간을 연장할 수 있음을 확인하였다. 본 연구 결과는 현재 즉석섭취식품 도시락에서 C. perfringens와 B. cereus의 미 생물학적 기준설정 제고와 안전관리 방안설정에 대한 과학 적 근거 자료로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

감사의 글

본 연구는 2019년도 식품의약품안전처 용역연구개발과제 의 연구개발비 지원(17162식위안035)에 의해 수행되었으 며 이에 감사드립니다.

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